劉海英

（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

響應曲面試驗優(yōu)化獼猴桃中SOD的提取工藝

劉海英

（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

優(yōu)化獼猴桃中超氧化物岐化酶（SOD）提取工藝，旨在進一步開發(fā)植物SOD酶源。選取獼猴桃為原料，在單因素試驗基礎(chǔ)上，應用Box-Behnken響應曲面設(shè)計，以熱變性溫度、熱變性時間、丙酮沉淀處理為試驗因素，以SOD酶活性為響應變量，分析并優(yōu)化SOD的提取工藝。試驗確立了最佳的SOD提取工藝參數(shù)為熱變性溫度57.5℃、熱變性時間27min、V丙酮∶VSOD酶液=0.93，此條件下，SOD酶活性為（835±25）U/mL。

超氧化物岐化酶；響應曲面設(shè)計；提取工藝

超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，EC1.15.11）簡稱SOD，是一種廣泛存在于動物、植物、好氧微生物細胞中的金屬酶，是唯一能夠特異性清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶[1]。SOD水平高低直接影響著生物體的衰老與死亡，SOD主要生理功能為平衡機體的氧自由基，從而有效預防活性氧對生物體的毒害作用。當前SOD主要應用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品及人和動植物許多疾病的監(jiān)測等領(lǐng)域。當前，常用的SOD主要為動物源性，其具有價格昂貴、常溫保存時間短、存在病毒等生物活性物質(zhì)的交叉感染風險，國際衛(wèi)生組織已停止動物源性SOD的使用[2]。人們?nèi)粘Ｊ秤玫墓瞎卟?、野生植物中含有大量的植物性SOD，由于植物中的SOD純屬植物天然蛋白，不含對人體有害物質(zhì)，避免了交叉感染發(fā)生的可能，使用安全性高，具有明顯的社會和經(jīng)濟效益，市場前景廣闊。近年來發(fā)現(xiàn)獼猴桃中含有一定量的超氧化物歧化酶，因此，筆者選擇獼猴桃作為試驗原材料優(yōu)化SOD的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 原材料與試劑

獼猴桃：市售。

KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、檸檬酸、KCl、NaCl、丙酮、鄰苯三酚等：試劑均為分析純，均來自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BT2202S型電子天平：德國賽多利斯；H2500R-2高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司；HH-S8恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司；UV1102型

紫外分光光度計：上海天美；HYC-360醫(yī)用冷藏柜：海爾集團；漩渦振蕩儀：海門市其林貝爾儀器廠；研缽；過濾系統(tǒng)；量筒；燒杯等。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程[3]

獼猴桃→研磨→浸提→過濾、離心→粗酶液→熱變性處理→離心取上清液→等電點沉淀處理去除雜蛋白→丙酮沉淀處理去除雜蛋白→蛋白酶。

1.2.2 SOD的活力測定

采用Mark lund鄰苯三酚自氧化法[4-6]進行測定。酶活力單位的定義為：在1mL反應液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時的酶量為1個活力單位。

1.2.3 單因素試驗

根據(jù)獼猴桃中SOD的性質(zhì)，選取浸提緩沖溶液的pH值、浸提時間、熱處理溫度、熱處理時間、等電點沉淀pH值、丙酮沉淀處理6個單因素進行分析。

表1 試驗設(shè)計單因素及其水平Table1 Thesingle factor and the levelof theexperimentaldesign

粗酶液提?。悍Q取500g市售獼猴桃，在冰浴環(huán)境下研磨充分，將所有研磨所得物一并倒入1000mL燒杯中，加入2倍體積50mmol/L磷酸鹽緩沖液置于醫(yī)用冷藏柜中浸提，過濾系統(tǒng)過濾，然后將濾液在10000 r/min的條件下高速冷凍離心（4℃）15min，最后將離心液通過濾紙過濾，制成SOD粗酶液。

熱變性處理：取試管加入SOD粗酶原液3mL，在試驗設(shè)計溫度的恒溫水浴鍋中加熱指定時間，倒入離心管中進行10 000 r/min冷凍離心20min后，去除沉淀雜蛋白，將上清液置于25℃恒溫水浴鍋中20min后進行酶活性測定，每次操作重復3次。

等電點沉淀處理：取熱變性后的SOD酶液2mL，分別加入試驗設(shè)計的pH值的磷酸鹽緩沖液，迅速混勻置于4℃醫(yī)用冷藏柜中沉淀30min，倒入離心管中，10 000 r/min冷凍離心20min，去除沉淀雜蛋白，將上清液放于25℃恒溫水浴鍋中20min后進行酶活性測定，每次操作重復3次。

丙酮沉淀處理：取試管加入3mL等電點沉淀的SOD酶液，然后試管中加入指定體積的丙酮，混勻后立即置于4℃醫(yī)用冷藏柜中沉淀30min，倒入離心管中，10 000 r/min冷凍離心20min，去除沉淀雜蛋白，將上清液放于25℃恒溫水浴鍋中20min后進行酶活性測定，每次操作重復3次。

1.2.4 SOD提取工藝的響應曲面優(yōu)化[7-8]

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇熱變性溫度、熱變性時間、丙酮沉淀處理為主要因素，設(shè)計三因素三水平響應曲面試驗，并對試驗結(jié)果進行分析和優(yōu)化。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2007對單因素試驗中的各因素進行比較分析。各組間試驗數(shù)據(jù)以x±s表示。采用minitab15進行響應曲面試驗設(shè)計、分析及優(yōu)化，以α=0.05作為顯著性水平。所有試驗均重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對SOD酶活性的影響

浸提緩沖溶液的pH值、浸提時間、熱處理溫度、熱處理時間、等電點沉淀pH值、丙酮沉淀處理6個單因素試驗結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Single factor test results

由圖1-a看出，SOD粗酶液活性隨著pH值的升高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH=7.4時，粗酶液具有最佳的活性，過高或過低pH造成部分酶失活。圖1-b顯示，浸提時間對SOD粗酶液活性無顯著性影響。圖1-c、1-d、1-e、1-f顯示，SOD酶液活性均隨著熱變性溫度、熱變性時間、等電點沉淀pH值、丙酮沉淀處理的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分別在熱變性溫度60℃、熱變性時間25min、等電點沉淀pH= 5.0、V丙酮∶VSOD酶液=1.0時，SOD酶液具有最佳活性。

綜合以上數(shù)據(jù)，固定浸提緩沖溶液的pH值=7.4，浸提時間12 h（過夜浸提）、等電點沉淀pH=5.0 3個單因素水平，選取熱變性溫度、熱變性時間、和丙酮沉淀處理3個因素，以酶活性為響應值進行響應曲面分析。

2.2 SOD提取工藝的響應曲面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析

由Box-Behnken試驗設(shè)計，在單因素試驗基礎(chǔ)上選取熱變性溫度、熱變性時間和丙酮沉淀處理3個因素進行響應曲面分析，以SOD酶活性為響應值，試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table2 Box-Behnken design and corresponding experimental results

每個組合重復試驗3次，取其平均值作為SOD酶活性結(jié)果，采用minitab15軟件分析試驗結(jié)果。對表2試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得SOD酶活性對熱變性溫度（A）、熱變性時間（B）和丙酮沉淀處理（C）的二次多項式回歸模型：

對回歸模型進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果如表3、表4所示。

表3 回歸系數(shù)的顯著性檢驗Table3 Significance testof regression coefficient

由回歸模型方差分析的結(jié)果（表4）可以看出，模型具有極高顯著性（P＜0.01），失擬項檢驗P值不顯著（P＞0.05），表明模型不失擬；同時回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明，該模型的相關(guān)系數(shù)r2=0.998 4（表3），說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應值線性關(guān)系顯著。意味著所建立的回歸二次模型成立，可用此模型來分析和預測SOD酶活性提取工藝條件。從回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可得知：熱變性溫度、熱變性時間和丙酮沉淀處理的一次項、二次項的P值均小于0.01，說明對SOD酶活性的影響極顯著；熱變性溫度、熱變性時間的交互項P值小于0.01，說明對SOD酶活性影響極顯著；熱變性溫度與丙酮沉淀處理以及熱變性時間與丙酮沉淀處理的交互項P值均＞0.05，對SOD酶活性影響不顯著。

表4 回歸模型的方差分析Table4 Variance Analysisof regressionm odel

2.2.2 模型雙因素交互作用分析

由方差分析可知，熱變性溫度、熱變性時間的交互作用對SOD酶活性有顯著的影響，用minitab15軟件根據(jù)相應繪制二者的等值線圖及響應曲面圖，如圖2所示。

圖2 因素交互作用的等值線圖及響應曲面圖Fig.2 Contour plotsand response surfacep lotsof the interaction of factors

由表3的P值和圖2中響應曲面圖可知，熱變性溫度、熱變性時間的交互作用為顯著水平（P＜0.01）。當熱變性溫度一定時，隨著熱變性溫度的升高，SOD酶活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。這可能是由于熱變性促使雜蛋白的沉淀需要一定的時間，隨著熱變性時間的增加，雜蛋白逐漸沉淀，但是當熱變性的時間繼續(xù)延長，熱變性的高溫同樣會促使部分SOD失去活性，最終造成酶活性降低。由圖2中等值線圖可以看出，固定V丙酮∶VSOD酶液=1，當熱變性溫度在60℃左右，熱變性時間在25min時，SOD具有較高的酶活性。

2.2.3 驗證試驗

采用minitab15響應優(yōu)化器進行分析，得出SOD最優(yōu)工藝參數(shù)為熱變性溫度57.5℃、熱變性時間27min、V丙酮∶VSOD酶液=0.93（如圖3所示）。

圖3 SOD提取最佳工藝參數(shù)Fig.3 Optimalp rocessparam eters for SOD extraction

按照上述最優(yōu)工藝參數(shù)，重復5次試驗，結(jié)果SOD酶活性為（835±25）U/mL，與理論值824相對偏差1.33%，驗證了響應面設(shè)計的準確性。

3 結(jié)論

本研究以獼猴桃為主要原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應曲面設(shè)計對SOD提取工藝中的熱變性溫度、熱變性時間、丙酮沉淀處理3個因素進行優(yōu)化，最終得到的最佳SOD提取工藝參數(shù)為熱變性溫度57.5℃、熱變性時間27min、V丙酮∶VSOD酶液=

0.93，此條件下所得到的SOD酶活性為（835±25）U/mL。

本研究所用所用儀器設(shè)備均為實驗室常規(guī)儀器設(shè)備，所用試劑實驗室常規(guī)試劑，價格低廉、化學危害性很小。另外本研究所采用的的工藝流程簡單、易于操作，因此該試驗所確定的提取路線不失為一條較為廉價的提取純化SOD的工藝路線，值得推廣。

[1] 李珺,馬力通,高書良.番茄中超氧化物歧化酶提取工藝的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(7):3997-3998

[2]金紹黑.植物超氧化物歧化酶的提取、修飾制備工藝及其應用研究[J].成都航空職業(yè)技術(shù)學院學報,2005,21(1):44

[3]魏瑞鋒,魏桃英.獼猴桃中SOD提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2013,41(32):12716-12717,12757

[4]LIY L,ZHANG Y.Determination of SOD activity bymeans of pyogallolautoxidationmethod[J].Chinese Lab Tech,2000,10:673

[5]朱廣廉,鐘誨文,張愛琴.植物生理學實驗[M].北京:北京大學出版社,1990:242

[6]張宏,譚行鈞.四種鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性方法的比較[J].內(nèi)蒙古大學學報(自然科學版),2002,33(6):677-681

[7]熱孜耶·喀日,米麗班·霍家艾合買提,熱合滿·艾拉,等.響應面法優(yōu)化馬血中SOD超聲波提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2012, 33(2):249-251

[8]王燕華,武福華,郭昭涵,等.響應面試驗優(yōu)化丹參中多糖的超聲波提取工藝及其抗氧化活性[J].食品科學,2015,36(18):7-12

Optim ization of the Extraction Process of Superoxide Dismutase（SOD）from K iw iby Response Surface Experiment

LIUHai-ying
（Departmentof Food Engineering，InnerMongolia Businessand VocationalCollege，Hohhot010070，InnerMongolia，China）

Optimization ofkiwifruitsuperoxide dismutase（SOD）extraction process，to further develop the SOD enzyme source plant.Selection ofkiwi fruitas rawmaterial，based on single factor test，the application of Box-Behnken response surface design，the thermal denaturation temperature，thermal denaturation time，acetone precipitation as test factors，with SOD activityas the response variable，analyzeand optimize theextraction processofSOD.The optimum extraction processparametersofSODwereestablished in the experiment.The parametersofwere heatdenaturation temperature 57.5℃，heatdenaturation time 27min，Vacetone∶VSODenzymeliquid=0.93. Under thiscondition，theactivityofSODwas（835±25）U/mL.

superoxide dismutase；response surface design；extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.028

2016-07-19

劉海英（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品加工技術(shù)。