徐金瑞，侯方麗，黃建蓉，胡勇，鐘南京

（廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東中山528458）

番石榴葉多酚的提取及其抗氧化作用研究

徐金瑞，侯方麗，黃建蓉，胡勇，鐘南京

（廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣東中山528458）

以番石榴葉為原料，采用超聲波輔助技術(shù)優(yōu)化番石榴葉中多酚物質(zhì)的提取工藝；通過測(cè)定還原力、清除DPPH自由基能力和抑制豬油的氧化作用，探討番石榴葉多酚的抗氧化作用。結(jié)果表明，確定最佳提取工藝參數(shù)為：超聲波提取溫度55℃、時(shí)間20min，料液比1∶70（g/mL），乙醇濃度50%，在此條件下多酚含量達(dá)114.82mg/g。抗氧化研究表明，番石榴葉多酚能有效抑制豬油的氧化，且具有較好的還原力和清除DPPH自由基的能力。

番石榴葉；多酚；超聲波提取；抗氧化作用

油脂氧化是食用油脂及含油脂食品敗壞變質(zhì)的主要原因之一。油脂氧化對(duì)人體健康的危害目前已很明確[1]，為了延緩油脂氧化，目前最有效的措施通常是添加抗氧化劑，其中主要以化學(xué)合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）及特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）等為主。但相關(guān)研究表明合成抗氧化劑存在一定的危害性[2]，如BHA對(duì)白鼠有致癌作用，BHT可引起動(dòng)物肝臟增大等。因此，從自然界尋求高效、低毒且經(jīng)濟(jì)的天然抗氧化劑，已成為當(dāng)前食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科，原產(chǎn)于美洲，現(xiàn)在我國(guó)廣東、廣西、四川、福建等地均有栽培，其葉可全年采摘，資源十分豐富?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明[3-4]，番石榴葉中含有多種重要的芳香類二級(jí)代謝產(chǎn)物，有學(xué)者認(rèn)為正是這些化合物賦予番石榴葉多種藥用功效，如降血糖、抑菌、抗輪狀病毒等[5-6]。但目前鮮有關(guān)于番石榴葉中多酚物質(zhì)抗氧化活性的研究報(bào)道。同時(shí)，針對(duì)當(dāng)前人們對(duì)合成抗氧化劑安全性存在較多質(zhì)疑，若能明確番石榴葉多酚的抗氧化作用，將其作為天然抗氧化劑加以開發(fā)和利用，必然具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

基于此，本文對(duì)番石榴葉中多酚物質(zhì)的提取工藝及其抗氧化作用進(jìn)行了探討，可為番石榴葉的開發(fā)利用提供科學(xué)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴葉：采自中山市五桂山鎮(zhèn)某果園，將葉洗凈、烘干、粉碎，過40目篩備用；豬油：市售，新鮮豬板油洗凈，文火煉制而成，4℃保存；DPPH（1，1-二苯基-

2-三硝基苯肼）：購(gòu)自SIGMA公司；BHT為食品級(jí)：市購(gòu)；抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、乙酸、異辛烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、重鉻酸鉀、焦性沒食子酸、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉：均為分析純，市購(gòu)。

1.2 主要儀器

V-1200型紫外-可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DFY-500型高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；YM-650CT型超聲波提取機(jī)：上海豫明儀器有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1E-80型冷凍干燥機(jī)：上海楚定分析儀器有限公司；pHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚含量的測(cè)定—酒石酸亞鐵比色法[7]

吸取1mL待測(cè)樣液于25mL比色管中，加入4mL蒸餾水和5mL酒石酸亞鐵溶液，混合后，用pH 7.5磷酸鹽緩沖液定容，混勻；同時(shí)以蒸餾水代替樣品提取液作空白，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。另以0～50μg/mL的焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=2.669x-0.008 9，R2=0.999 5。1.3.2 番石榴葉多酚提取工藝設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

稱取1 g番石榴葉粉，按一定料液比加入不同濃度乙醇溶液，在一定溫度下超聲輔助提取一定時(shí)間，過濾，濾液用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至原體積，測(cè)其多酚含量。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多酚含量為指標(biāo)，對(duì)影響多酚提取的溫度、料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度等進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab le1 Factorsand levelsof orthogonal tests

1.3.3 番石榴葉多酚的制備

稱取適量番石榴葉粉，按1∶70（g/mL）的料液比加入50%的乙醇，置于超聲波提取器中55℃提取20 min，過濾，將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，冷凍干燥成粉，備用（使用前以蒸餾水配成所需濃度用于1.3.4試驗(yàn)）。

1.3.4 抗氧化試驗(yàn)

1.3.4.1 還原力的測(cè)定－普魯士藍(lán)法[8]

取不同濃度的樣品液2 mL，依次加入 2 mL 2.5 mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH=6.6）和2mL 1%六鐵氰化鉀溶液，搖勻，50℃水浴保溫20min，冷卻后，再加入2mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min離心10min，取上清液2mL，依次加入2mL蒸餾水和0.4mL 0.1%三氯化鐵，混勻，于700 nm下測(cè)其吸光值（以蒸餾水代替樣品提取液作空白）。

1.3.4.2 清除DPPH·的能力[9]

于2mL 0.2mmol/LDPPH·溶液中加入2mL樣品，搖勻于室溫下放置30min，用無(wú)水乙醇作參比液，于517 nm下測(cè)定其吸光值A(chǔ)i；同時(shí)測(cè)定2mL 0.2mmol/L DPPH·溶液與2mL無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)c；再測(cè)2mL樣品液與2mL無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)j，根據(jù)以下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的抑制率：

式中：Ai為加樣品液時(shí)DPPH·溶液的吸光值；Aj為樣品液在測(cè)定波長(zhǎng)的吸光值度；Ac為未加樣品液時(shí)DPPH·溶液的吸光值。

1.3.4.3 抑制油脂的氧化—Schaal烘箱法[10]

將番石榴葉多酚分別按0.10%、0.30%、0.50%（添加物/油）的添加量加入豬油中，充分?jǐn)噭?。將?jīng)過處理的豬油和空白對(duì)照置于（62±1）℃烘箱中強(qiáng)制氧化，定時(shí)攪拌，每隔1天取樣，測(cè)定其過氧化值（POV）。

過氧化值測(cè)定參照GB/T 5538-2005《動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定》的測(cè)定方法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

稱取1 g番石榴葉粉，在料液比1∶40（g/mL），超聲波提取器作用溫度45℃、時(shí)間20min條件下，分別考察30%～70%乙醇提取對(duì)番石榴葉多酚含量的影響，結(jié)果見圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effectofethanolconcentration on extraction result

圖1表明，隨著乙醇濃度的升高，多酚含量持續(xù)增高，且在乙醇50%時(shí)達(dá)最高，之后隨乙醇濃度增大多酚含量趨于下降，而且從試驗(yàn)現(xiàn)象來(lái)看，乙醇濃度越高，提取液顏色越深，加大了色素等其他類物質(zhì)的溶出，不利于多酚的純化。綜合考慮，以50%乙醇作提取劑較適宜。

2.2 溫度對(duì)提取效果的影響

稱取1 g番石榴葉粉，在料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度50%，超聲波提取器作用時(shí)間20min條件下，考察不同溫度（35、45、55、65℃）提取時(shí)對(duì)番石榴葉多酚含量的影響，結(jié)果見圖2所示。

圖2 溫度對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effectof tem peratureon extraction result

圖2表明，隨著提取溫度的提高，多酚含量先明顯增大后趨于平緩，在55℃時(shí)達(dá)到最大值，超過55℃后多酚含量略有降低。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)提高溫度能夠促進(jìn)物料及溶劑分子運(yùn)動(dòng)和有效成分的溶解，從而提高多酚的提取效果，但溫度過高時(shí)會(huì)破壞多酚物質(zhì)，而且也增加了能耗，因此提取溫度以55℃較為適宜。

2.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

稱取1 g番石榴葉粉，在料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度50%，超聲波提取器溫度55℃條件下，考察不同超聲作用時(shí)間（10min～50min）提取時(shí)對(duì)番石榴葉多酚含量的影響，結(jié)果見圖3所示。

圖3 時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effectof tim eon extraction result

圖3表明，隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚含量先上升到一定峰值后下降，最后趨于穩(wěn)定，其中在超聲時(shí)間為20 min時(shí)，多酚含量達(dá)到最高點(diǎn)，而超過20 min后，多酚含量明顯下降，在30min過后多酚含量基本不變。其原因可能是處理時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，番石榴葉多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，有效成分降解，而雜質(zhì)逐漸溶出，導(dǎo)致多酚含量降低。因此，提取時(shí)間以20min較為適宜。

2.4 料液比對(duì)提取效果的影響

稱取1 g番石榴葉粉，在乙醇濃度50%，超聲波提取器溫度55℃、時(shí)間20min條件下，考察不同料液比（1∶20～1∶80，g/mL）提取時(shí)對(duì)番石榴葉多酚含量的影響，結(jié)果見圖4所示。

圖4 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effectof the ratio ofmaterial to solventon extraction result

圖4表明，隨著提取液用量的增大，多酚含量逐步提高，當(dāng)增至1∶60（g/mL）時(shí)，多酚含量達(dá)到最大，可能是番石榴葉中的多酚類物質(zhì)此時(shí)已基本溶出，再提高提取液用量，多酚含量反而略有降低，推測(cè)是番石榴葉中的雜質(zhì)成分競(jìng)爭(zhēng)性溶出，不利于提取多酚類物質(zhì)。因此，料液比以1∶60（g/mL）較為適宜。

2.5 番石榴葉多酚的最佳提取工藝

為了考查各因素交互作用對(duì)提取物含量的影響，對(duì)影響多酚提取的乙醇濃度、料液比、超聲波提取時(shí)間和溫度等因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The resultsof orthogonal tests

由表1結(jié)果可知，番石榴葉中多酚物質(zhì)超聲波提取的最佳工藝組合為A2B3C2D2，即最佳的提取溫度為55℃、料液比1∶70（g/mL）、超聲波時(shí)間20min、乙醇濃度50%。各因素對(duì)提取效果的影響主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即料液比＞乙醇濃度＞溫度＞超聲處理時(shí)間。但最佳的提取工藝組合A2B3C2D2并沒有出現(xiàn)在正交試驗(yàn)列表中，故對(duì)A2B3C2D2條件進(jìn)行了結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果表明，在正交試驗(yàn)所優(yōu)化的最佳提取條件下多酚含量為114.82mg/g。

2.6 不同濃度番石榴葉多酚的還原力

還原力是表示具有抗氧化活性的物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而達(dá)到抗氧化的作用。許多研究證實(shí)，抗氧化活性同還原力密切相關(guān)，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。還原力大小以吸光度值A(chǔ)700nm表示，結(jié)果見圖5。

圖5 番石榴葉多酚與抗壞血酸的還原力Fig.5 The reducing power of ascorbic acid and polyphenols from guava leaf

圖5表明，番石榴葉多酚的還原力隨濃度的增大而增大。通過比較其與抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液的半抑制率EC50[根據(jù)各自的線性回歸方程，計(jì)算吸光度為0.5時(shí)所需樣品的濃度（mg/L），該值越小，還原力越強(qiáng)]，可知抗壞血酸EC50=6.63mg/L，而番石榴葉多酚EC50=6.92mg/L，說(shuō)明番石榴葉多酚的還原能力與抗壞血酸的基本相當(dāng)，略弱于抗壞血酸。

2.7 番石榴葉多酚清除DPPH·的能力

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能夠清除其，則表示受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過氧自由基及打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。因此，目前多被廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化劑清除自由基能力的快速方法。番石榴葉多酚與抗壞血酸清除DPPH·的能力見圖6。

由圖6可知，隨濃度增加，番石榴葉多酚和抗壞血酸均對(duì)DPPH·的清除作用增大。通過比較其與抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液的半抑制率EC50[抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)樣品的濃度（mg/L），該值越小，清除DPPH·的能力越強(qiáng)]，得到抗壞血酸EC50=46.76mg/L，而番石榴葉多酚EC50= 49.19mg/L，說(shuō)明番石榴葉多酚清除DPPH·的能力與抗壞血酸的基本相當(dāng)，但稍弱于抗壞血酸。

圖6 番石榴葉多酚與抗壞血酸清除DPPH·的能力Fig.6 Thescavenging DPPH·ability of ascorbic acid and polyphenols from guava leaf

2.8 番石榴葉多酚抑制油脂的氧化作用

圖7 番石榴葉多酚對(duì)豬油氧化的抑制作用Fig.7 The inhibiting oxidation on lard oilof polyphenols from guava leaf

由圖7可知，添加不同量的番石榴葉多酚對(duì)豬油均有一定的抗氧化作用。在0.10%～0.50%范圍內(nèi)，隨多酚添加量的提高，抗氧化作用也逐漸增強(qiáng)，但其作用效果總體上弱于0.02%BHT的抗氧化效果。實(shí)際上，所試多酚為粗提物，若能進(jìn)一步對(duì)其加以純化可能會(huì)增強(qiáng)其抗氧化作用，另外，番石榴多酚為天然有機(jī)物質(zhì)，其穩(wěn)定性受環(huán)境因素影響較大，與化學(xué)合成的抗氧化劑相比穩(wěn)定性差也是影響其抗氧化活性的重要原因。關(guān)于對(duì)番石榴葉多酚的純化及其穩(wěn)定性研究還有待于進(jìn)一步探討。

3 結(jié)論

1）番石榴葉中多酚物質(zhì)的最佳提取工藝條件是：以50%乙醇溶液為提取劑，料液比1∶70（g/mL）超聲波提取溫度55℃、時(shí)間20min，在此條件下多酚含量達(dá)114.82mg/g。

2）抗氧化試驗(yàn)研究表明，番石榴葉多酚能有效抑制豬油的氧化，且具有較好的還原力和清除DPPH自由基的能力，提示其可作為油脂的天然抗氧化劑加以開發(fā)利用。

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Extraction and Antioxidition of Polyphenols from Leaves of Guava

XU Jin-rui，HOU Fang-li，HUANG Jian-rong，HUYong，ZHONGNan-jing
（Collegeof Food Science，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Zhongshan 528458，Guangdong，China）

The ultrasonic extraction technology of polyphenols in guava leafwas optimized，and its reducing power，scavenging DPPH·ability and inhibiting oxidation on lard oilwere also researched.The results showed that the optimum parameter ofultrasonic extraction were as follows：ultrasonic extracton temperature 55℃，extraction time20min，the ratioofmaterial to solvent1∶70（g/mL），ethanol concentration 50%，and under this condition，the extracting rate ofpolyphenols in dried guava leafwas114.82mg/g.Theantioxidation research indicated that the polyphenols from guava leafhad could effectively inhibit the oxidation of lard oil，and had good reducing powerand scavenging DPPH·ability.

guava leaf；po lyphenols；ultrasonic extraction；antioxidation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.010

2015-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401521）；廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院學(xué)科建設(shè)基金（43555015）

徐金瑞（1976—），女（漢），副教授，博士，主要從事生物活性物質(zhì)與功能食品方面研究。