□ 潘潔莉　高麗娜　盛振華　李美芽　浙江中醫(yī)藥大學(xué)

竹燕窩的分子鑒定及金屬元素的含量分析

□ 潘潔莉高麗娜盛振華李美芽浙江中醫(yī)藥大學(xué)

竹燕窩，又名竹菌，有抗菌消炎、潤(rùn)肺滋陰、美容養(yǎng)血等功效，是珍稀的真菌類微生物。主產(chǎn)自四川和云南，在浙江少見(jiàn)。因其形與味如同燕窩，口感潤(rùn)滑清香，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚高，被譽(yù)為植物燕窩，曾歷次受央視等媒體的關(guān)注。研究表明，竹燕窩多糖具有一定的抗氧化活性，其醇提物對(duì)人食道癌、乳腺癌、白血病和肝癌均具有較好的預(yù)防功能。

作為一種絕美食品，食用安全性十分重要。食品中的金屬元素含量是當(dāng)前人們關(guān)心的重點(diǎn)，重金屬會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體會(huì)帶來(lái)潛在的健康危機(jī)。因此，對(duì)食品中金屬元素含量分析十分必要。目前，竹燕窩中金屬元素含量的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究對(duì)浙江杭州的竹燕窩進(jìn)行分子鑒定后，采用ICP-AES測(cè)定其中9種金屬元素的含量，了解竹燕窩的生長(zhǎng)地域性和環(huán)境特殊性，為竹燕窩作為食品保健品提供理論參考。

材料與方法

材料

電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，Therm o Scientific公司；Coolsafe冷凍干燥儀，丹麥Labogene公司；PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司。

砷、鈣、鎘、鐵、銅、汞、錳、鉛和鋅9種重金屬單元素，均購(gòu)自環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；硝酸，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氬氣（含量大于99.99%），購(gòu)自上海五鋼氣體有限責(zé)任公司；竹燕窩，采自浙江省杭州市。

方法

1 竹燕窩顯微觀察

挑取少量竹燕窩子實(shí)體，壓片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察子實(shí)體和孢子形態(tài)。

2 基因組DN A提取

采用CTAB法提取子實(shí)體基因組DN A，純度合格的DN A作為PCR擴(kuò)增的模板。

3 ITS序列的擴(kuò)增和分析

用真菌rRN A基因的ITS區(qū)擴(kuò)增通用引物18SF（5’-TCCG TAG G TG AACCTG CG G-3’）和28SR（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)得的序列采用Blast比對(duì)分析，獲得指標(biāo)靠前的相似序列，通過(guò)M EGA軟件以最大似然法構(gòu)建N J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。樹(shù)形圖上的百分?jǐn)?shù)表示比較菌株之間的相似度。

4 金屬元素含量分析

（1）樣品處理。取新鮮采取的竹燕窩，超純水清凈，-80 ℃冷凍過(guò)夜，于冷凍干燥儀中凍成干粉。準(zhǔn)確稱取三份樣品各約0.5 g（精確到0.0001 g）置于微波消解罐中，加入10 m L硝酸靜置過(guò)夜，然后裝好外罐在微波消解儀中進(jìn)行消解，冷卻后轉(zhuǎn)移置50 m L容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液備用。另取10 m L消化液，同法制作空白溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。分別吸取一定量的各元素標(biāo)準(zhǔn)品，用30%硝酸溶液配置4種不同濃度的混合溶液。依次在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，每一質(zhì)量濃度測(cè)定3次，以吸光度Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X（μ g/m L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定其相關(guān)系數(shù)及線性范圍。

（3）樣品微量元素含量測(cè)定。設(shè)定儀器入射功率：1150 W；輔助流速：0.5 L/m in；霧化器泵流量：50 r/m in；分析泵速：50 r/m in；最大積分時(shí)間：30 s；沖洗3次，每次30 s。根據(jù)各元素含量的不同，選擇靈敏度較高，其他元素干擾最小的譜線作為分析線。按上述設(shè)定的儀器操作條件，測(cè)定供試品溶液的吸光度，由各元素的回歸方程，計(jì)算相應(yīng)的濃度，扣除試劑的空白值，得出樣品中各元素的含量。

結(jié)果與討論

子實(shí)體形態(tài)特征

從圖1中可看出，竹燕窩子實(shí)體叢生，呈淡黃色珊瑚狀（圖1-A）。分支很多，分支明顯，尖端黑色部分為分生孢子器（圖1-B/C）。將分生孢子器進(jìn)行壓片后于光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)孢子為橢圓形，中間有1～2個(gè)球狀物（圖1-D）。

圖1　竹燕窩子實(shí)體以及孢子形態(tài)

分子鑒定

將測(cè)得的ITS序列用Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其序列與Scorias spongiosa（HM 480490.1）最為接近，相似性可達(dá)99%，可推測(cè)該竹燕窩的形成菌株為Scorias spongiosa，與賀慶生分離的竹燕窩菌株為同一種菌株。在N CBI上下載與該菌株的ITS序列接近的一些菌株的序列，采用M EGA軟件以最大似然法構(gòu)建了N J進(jìn)化樹(shù)，如圖2所示?？煽闯?，浙江產(chǎn)的竹燕窩與HM 480490.1進(jìn)化關(guān)系最為接近，可達(dá)87%。

圖2　竹燕窩的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

國(guó)家食用菌標(biāo)準(zhǔn)參考

參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2762-2012）食用菌類中的限量標(biāo)準(zhǔn)，可發(fā)現(xiàn)浙江竹燕窩中的Hg、Pb、Cd、As含量均較低，符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)。Cu、M n、Zn、Fe、Ca含量較高，F(xiàn)e、Zn、Cu、M n是人體必需的微量元素，鈣是人體必需的常量元素，這些都是對(duì)人體有益的元素。

結(jié)論

元素含量檢測(cè)

從表1可以看出，各元素的回歸方程線性關(guān)系很好，相關(guān)系數(shù)均可達(dá)到0.999以上，可用于后續(xù)樣品中元素含量的測(cè)定。

將竹燕窩樣品溶液按儀器工作條件進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)得數(shù)據(jù)代入回歸方程后扣除空白值，得到樣品中各元素的濃度，根據(jù)所稱量的重量，換算成質(zhì)量比，結(jié)果見(jiàn)表2。

元素平均值±誤差限H g 0 . 0 1 3 ± 0 . 0 0 1 P b 0 . 3 3 0 ± 0 . 0 3 2 C d 0 . 0 3 0 ± 0 . 0 0 4 A s 0 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 C u 7 . 8 1 6 ± 0 . 1 0 0 M n 1 0 . 8 6 0 ± 0 . 1 0 1 Z n 2 0 . 0 1 2 ± 0 . 2 5 5 C a 7 4 1 3 . 7 1 6 ± 2 6 . 2 8 F e 4 7 . 1 4 1 ± 0 . 3 3 7

本研究對(duì)浙江竹燕窩進(jìn)行分子鑒定，并采用微波消解ICP-AES法測(cè)定其中的9種金屬元素的含量。所測(cè)定的竹燕窩樣品中的Hg、Pb、Cd、As的含量均符合我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2012。食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)Fe、Zn、Cu、M n的含量進(jìn)行限定，因此無(wú)法判斷竹燕窩樣品中這四種元素的含量是否超標(biāo)。但Fe、Zn、Cu、M n、Ca都是人體所必需的元素，在人體的生命活動(dòng)過(guò)程中起著重要的作用。這些元素含量與種植環(huán)境中的土壤和水源有一定的關(guān)系，從研究結(jié)果來(lái)看，浙江竹燕窩可作為安全食品，可補(bǔ)充人體所必需的Ca、Fe等元素。本研究為了解竹燕窩的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供了理論基礎(chǔ)。

浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金（編號(hào)：2014ZR12），浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研基金（編號(hào)：JC201308）。

李美芽。

潘潔莉（1986-），女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師。研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。