桑鵬 王順 趙佳輝

頭穴透刺對腦梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA、Ca2+影響研究

桑鵬 王順 趙佳輝

目的 觀察頭穴透刺對腦梗死大鼠NO、PKA、PDGFR-β、Ca2+的影響。方法 運用線栓方法制作腦梗死的大鼠模型，對模型大鼠行頭穴透刺及一般針刺，藥物治療；14 d后檢測大鼠PDGFR-β、PKA及NO、Ca2+的變化。結果 頭穴透刺明顯提升大鼠PDGFR-β、PKA的表達；降低NO含量、升高Ca2+離子含量。頭穴透刺組的治療效果優(yōu)于其他兩組。結論 與其他兩組比較，頭穴透刺明顯提升大鼠PDGFR-β、PKA的表達；降低NO含量、升高Ca2+離子含量，對腦保護作用效果顯著。

腦梗死；頭穴透刺；NO；PKA；PDGFR-β；Ca2+

腦梗死的發(fā)病率、患病率和死亡率隨年齡增加而增加，給患者的家庭、社會帶來沉重的負擔。針刺治療腦梗死在臨床上療效顯著，但很少有作用機制研究。為提高患者臨床療效，進一步闡明針灸治療腦梗死機制，本研究采用不同治療針灸方法腦梗死病例。同時進行實驗研究觀察腦梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA及Ca2+的變化，為針灸治療腦梗死患者提供理論及實驗依據(jù)。

1 模型

1.1 實驗方法

150只大鼠參照隨機對照表分為頭穴透刺組，一般針刺組，藥物注射組。

1.2 模型復制

線栓法復制大鼠大腦中動脈梗死的模型[1]。大鼠腹腔麻醉，分離出大鼠的頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，動脈夾暫時夾閉CCA和ICA，魚線經(jīng)頸內動脈與頸外動脈分叉的膨大處切口插入頸內動脈，魚線插入完成后和頸內動脈一起結扎，取下動脈夾?？p合完成2小時后將魚線拔出，魚線球端退至頸總動脈，實現(xiàn)再灌注。

1.3 模型成功標志

造模成功后大鼠同側的Horner征和大鼠對側前肢為重的偏癱。

1.4 模型評估

大鼠清醒后對大鼠的神經(jīng)行為學表現(xiàn)進行評分，0分：未能發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)損傷的癥狀；1分：大鼠對側前爪完全伸直受限；2分：大鼠只能向對側轉圈；3分：大鼠會向對側傾倒；4分：大鼠意識喪失及無法自主活動。

2 方法

頭穴透刺組：選穴：百會透雙側曲鬢，前神聰透向雙側懸厘；患側上肢的曲池、手三里、外關、合谷及患側下肢陽陵泉、豐隆、足三里、三陰交。得氣后上述穴位選用G-6805型電針儀給予適當刺激。每日刺激1次，7 d為1療程，共治療2個療程。

一般針刺組：選穴：患側上肢的曲池、手三里、外關、合谷及患側下肢陽陵泉、豐隆、足三里、三陰交；得氣后上述穴位選用G-6805型電針儀給予適當刺激。每日刺激1次，7 d為1療程，共治療2個療程。上述電針儀均為青島鑫升實業(yè)有限公司準字2000第2270088號電針儀。

藥物注射組：腦蛋白水解物注射液（曲奧）30 ml（三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥H20051202），每日注射1次，7 d為1療程，共治療2個療程。

3 指標檢測

3.1 PDGFR-β的檢測

本實驗使用的染色試劑是辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素?；静襟E：組織進行石蠟切片，將切好并用福爾馬林固定的組織切片在常溫中靜置1 h，進行脫蠟致水化，再用蒸餾水沖洗；3%甲醇—過氧化氫室溫孵育8 min左右，用來減少過氧化物酶的活性，pH 7.2左右的PBS緩沖劑清洗6 min；使用微波抗原修復，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復合物在37℃孵育10 min，PBS洗4 min；DAB顯色液顯色，用自來水沖洗來終止反應；蘇木精再復染，脫水，透明，封片。用PBS來代替一抗作為陰性對照組。

3.2 PKA蛋白活性表達（westernblot法）

組織中蛋白的提取步驟：第一步SDS-PAGE電泳。第二步電轉印，從電傳印正極通過濾紙、NC膜到達電傳印負極。第三步去離子水多次清洗NC膜后浸入麗春紅S染色液，鉛筆標出蛋白質Marker位置，多次浸泡至NC膜顏色褪去。第四步加入封閉液室溫下2 h。每間隔10 min清洗1次NC膜，反復3次清洗；繼續(xù)室溫下靜置2 h。再每間隔10 min清洗1次NC膜，反復3次清洗，

加入無磷酸鹽封閉液，用去離子水洗滌終止反應。

3.3 NO、Ca2+的檢測

依照次序對加入100 μl的標準品于空白微孔；標準品孔中和樣品孔中加入50μl的酶標記溶液，液體充分混勻，保險膜密封酶標板，37℃的水浴鍋中水浴60 min；加入底物A 50μl，移液器反復吸打混勻。微孔中加入50 μl的終止液，移液器混勻，在TECAMGENIOS酶標儀上，450 nm處測定OD，根據(jù)制備的標準曲線，計算樣本含量。

4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標準差）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，組間、組內比較均用q檢驗。

5 結果

5.1 三組治療前后PKA含量變化分析

治療后，頭穴透刺組、藥物治療組、一般針刺組PKA含量均增加，與治療前比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療2個療程后，頭穴透刺組PKA含量高于一般針刺組與藥物注射治療組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

5.2 三組PDGFR-β陽性細胞計數(shù)分析

治療2個療程后，頭穴透刺組PDGFR-β陽性細胞計數(shù)均高于藥物治療組、一般針刺組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。加表2。

5.3 三組NO含量變化分析

頭穴透刺組NO含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；藥物治療組、一般針刺組NO含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療14 d后，頭穴透刺組與一般針刺組，藥物注射治療組對比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。加表3。

5.4 三組血漿Ca2+含量變化分析

頭穴透刺組Ca2+含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；藥物治療組、一般針刺組Ca2+含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療14 d后，頭穴透刺組與一般針刺組，藥物注射治療組對比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。加表4。

表1 三組PKA含量變化（±s）

表1 三組PKA含量變化（±s）

注：與治療前比較，△P＜0.01；藥物治療組、一般針刺組治療后與治療前比較，▲P＜0.05；治療2個療程后，與藥物治療組、一般針刺組對比，#P＜0.01

組別 治療前（mmol/L） 1療程后（mmol/L） 2療程后（mmol/L）頭穴透刺組 51.66±0.21 82.77±0.19△# 103.48±1.36△#藥物治療組 51.97±0.30 62.28±0.18▲ 73.34±0.34▲一般針刺組 51.85±0.19 72.25±0.21▲ 90.30±2.27▲

表2 三組PDGFR-β陽性細胞計數(shù)（±s）

表2 三組PDGFR-β陽性細胞計數(shù)（±s）

注：治療2個療程后，與藥物治療組、一般針刺組對比，#P＜0.01

組別PDGF-β陽性細胞頭穴透刺組 7.54±2.51#藥物治療組 5.32±1.34一般針刺組 6.34±1.87

表3 三組NO含量變化（±s）

表3 三組NO含量變化（±s）

注：與治療前比較，△P＜0.01；藥物治療組、一般針刺組治療后與治療前比較，▲P＜0.05；治療14 d后，與藥物治療組、一般針刺組對比，#P＜0.01

組別 治療前（μmol/L） 治療后7 d（μmol/L） 治療后14 d（μmol/L）頭穴透刺組 82.99±14.61 48.13±10.32△# 32.47±10.05△#藥物治療組 80.62±18.53 62.67±15.73▲ 48.86±15.52▲一般針刺組 80.62±18.53 62.67±15.73▲ 48.86±15.52▲

表4 三組血漿Ca2+含量變化（±s）

表4 三組血漿Ca2+含量變化（±s）

注：與治療前比較，△P＜0.01；藥物治療組、一般針刺組治療后與治療前比較，▲P＜0.05；治療14 d后，與藥物治療組、一般針刺組對比，#P＜0.01

組別 治療前（mmol/L） 治療后7 d（mmol/L） 治療后14 d（mmol/L）頭穴透刺組 1.86±0.11 2.77±0.19△# 2.98±0.27△#藥物治療組 1.87±0.20 2.28±0.18▲ 2.38±0.23▲一般針刺組 1.88±0.12 2.25±0.21▲ 2.51±0.18▲

6 討論

PDGF促進鄰近的細胞生長，結合受體后作用于細胞介質，對膠質細胞和間質細胞具有促有絲分裂和趨化的作用[1]，PDGF最初從血小板中發(fā)現(xiàn)，參與血管內膜的重建，加速組織創(chuàng)傷修復。提高GABA能神經(jīng)元及膠質細胞的有效利用率。論證了頭穴透刺對腦梗死后神經(jīng)恢復的功能，PDGFR-β表達和PDGF的功能密切相關[2]。

NO維持血管張力從而舒張血管，對血壓的高低、血流分布、抑制血小板聚集、預防動脈粥樣硬化及改善代謝有重要的意義，是活躍的血液調節(jié)因子[3]。頭部透穴組NO含量明顯降低，說明頭部透穴可減少NO含量，增加腦部血管灌注，有利于腦神經(jīng)的修復。

PKA的作用底物有離子通道、結構和調節(jié)蛋白等轉錄因子[4]，

含有不同種亞型。興奮時突觸前神經(jīng)末梢釋放遞質，突觸后膜上的相應受體得到激活，釋放cAMP激活PKA，從而膜對離子的通透性得到改變[5]，PKA進入核內更便利。頭穴透刺治療后，神經(jīng)細胞內Ca2+濃度升高，cAMP濃度上升，激活PKA-CREB提高神經(jīng)再生的功效[6]。

2個療程后，頭針透穴組的模型大鼠Ca2+濃度升高，論證了降低NO為代表的氧自由基水平可以保護腦神經(jīng)[7]。PKA受體損傷和鈣離子含量的升高受阻，降低了神經(jīng)損害，增加神經(jīng)相關功能的恢復[8]。該試驗采用分三組進行對比試驗，結果證實：三組治療對腦梗死均有療效，頭針透穴組治療效果優(yōu)于其他兩組，提供頭穴透刺對腦梗死患者的治療療效實驗室數(shù)據(jù)。

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The Effect of Scalp Acupuncture on PDGFR-β, NO, PKA, Ca2+in Rats With Cerebral Infarction

SANG Peng WANG Shun ZHAO Jiahui Department of Acupuncture, Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang 150001, China

Objective The Effect of scalp penetration acupuncture on NO, PKA, PDGFR-β, Ca2+in rats with cerebral infarction. Methods Using suture-occluded method in the rats medels With cerebral infarction. Scalp penetration acupuncture, general acupuncture and medication in rats. Detecting the change of PDGFR-β, PKA, NO, Ca2+in rats after two of treatment courses. Results Scalp penetration acupuncture significantly improve PDGFR-β, PKA expression and increase Ca2+ion content. At the same time reduce NO content. The therapeutic effect of scalp penetration acupuncture group is better than the other two groups. Conclusion Scalp penetration acupuncture group Compared with the other two groups has the best effect on brain protection

Cerebral infarction, Scalp acupuncture, NO, PKA, PDGF-β, Ca2+

R246.6

A

1674-9308（2016）32-0221-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.32.125

黑龍江省中青年攻關項目 ZQG009

黑龍江省中醫(yī)藥科學院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001