唐雪鵬，李適廷，王崇，管付巖

（1.解放軍大連療養(yǎng)院桃源門(mén)診，遼寧 大連 116013；2.解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院，重慶 400037；3.解放軍第210醫(yī)院山屏街醫(yī)療區(qū)，遼寧 大連 116013；4.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

論著

牙周膜干細(xì)胞膜片構(gòu)建的生物性牙根生物學(xué)活性研究*

唐雪鵬1，李適廷2，王崇3，管付巖4

（1.解放軍大連療養(yǎng)院桃源門(mén)診，遼寧 大連 116013；2.解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院，重慶 400037；3.解放軍第210醫(yī)院山屏街醫(yī)療區(qū)，遼寧 大連 116013；4.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116021）

目的將經(jīng)過(guò)鑒定的人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSC）膜片分別與支架材料預(yù)處理牙本質(zhì)片（TDM）和羥基磷灰石/磷酸三鈣（HA-TCP）進(jìn)行體外共培養(yǎng)，評(píng)價(jià)不同支架對(duì)干細(xì)胞分化的影響。方法將單層牙周膜干細(xì)胞膜片與2種不同支架材料TDM和HA-TCP分別共培養(yǎng)1周，植入裸鼠皮下，通過(guò)掃描電鏡和組織學(xué)動(dòng)態(tài)觀察復(fù)合體顯微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果細(xì)胞膜片與TDM邊界處結(jié)合更為緊密；邊界大量礦物沉積和纖維樣組織生成；而在HA-TCP組只有單一的走形相對(duì)規(guī)則的纖維組織生成，未有明顯礦化沉積生成。結(jié)論復(fù)合的hPDLSC/ TDM組更適合具有生物學(xué)特點(diǎn)的干細(xì)胞發(fā)揮其特性，在合適的微環(huán)境下使hPDLSC向成牙周組織方向定向分化。

牙周膜干細(xì)胞膜片；支架材料；生物性牙根；組織再生

牙周膜干細(xì)胞（human periodontalligamentstem cells，hPDLSC）屬于成體干細(xì)胞，SEO等[1]首次利用克隆篩選和磁珠分離的方法證實(shí)有一種本身可以自我更新，而且還具備多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞存在于

牙周膜中，它可以產(chǎn)生牙周組織中具有特定功能的細(xì)胞。雖然牙周膜干細(xì)胞膜片在牙周組織再生中的研究已取得一定的研究結(jié)果，但是如何優(yōu)化干細(xì)胞膜片與支架材料構(gòu)建生物性牙根仍然是影響組織再生的技術(shù)難題[2-4]。支架材料與微環(huán)境在牙周再生中起決定性作用[5]。體外成功純化和培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞與何種支架材料復(fù)合能夠最大程度模擬出體內(nèi)牙周組織再生微環(huán)境，從而產(chǎn)生最佳的再生效果將對(duì)于牙周疾病的治療和牙周再生醫(yī)學(xué)具有重要意義[6-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索牙周膜干細(xì)胞膜片與2種支架材料構(gòu)建不同生物性牙根，通過(guò)異位移植技術(shù)模擬牙周組織再生微環(huán)境，觀察2種生物性牙根組織再生情況，為下一步牙周缺損修復(fù)的生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

α-DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），青霉素（Gibco公司，美國(guó)），L-谷氨酰胺（Gibco公司，美國(guó)），I型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)），抗壞血酸（Sigma公司，美國(guó)），地塞米松（Sigma公司，美國(guó)），0.25%胰蛋白酶（Amresco公司，美國(guó)），PBS（磷酸鹽緩沖液），二甲基亞砜（DMSO），β-甘油磷酸鈉（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州SW-CJ-1SD），二氧化碳恒溫孵箱（Forma公司，美國(guó)），離心機(jī)（Kubota公司，日本），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（南京華東公司DG5032），6孔培養(yǎng)板（Nunc公司，美國(guó)），Transwell共培養(yǎng)房（Nunc公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院頜面外科門(mén)診，選擇1例無(wú)牙周炎癥的智齒拔除。PBS沖洗4遍，用刮刀朝一個(gè)方向刮取根中1/3的牙周膜組織，置于6孔板內(nèi)。加入α-MEM培養(yǎng)液（20μg/ml抗壞血酸，10%FBS，0.3 mg/ml谷氨酰胺、100 u/ml青霉素）37℃、40 min、二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)，直至細(xì)胞從組織塊邊緣爬出后，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞直至生長(zhǎng)匯合率達(dá)到80%時(shí)，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆分離、挑選單克隆用于本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 多向分化能力的檢測(cè)第4代的hPDLSC懸液搖勻后，以1×104個(gè)/ml的密度接種到6孔板中，直至細(xì)胞擴(kuò)增至60%時(shí)，開(kāi)始替換為礦化誘導(dǎo)液（含40μg/ml的α-MEM培養(yǎng)液、10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.1μm/L地塞米松），每2天換液一次，誘導(dǎo)14 d后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定，茜素紅染色，使用倒置顯微鏡觀察。

第4代的hPDLSC細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/ml的密度均勻接種到6孔板中，直至細(xì)胞擴(kuò)增到60%左右時(shí)，加入成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液（含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液、0.5 mmol/LIBMT、10μmol/L胰島素、200μmol/L地塞米松），每2天換液，誘導(dǎo)14 d后PBS沖洗2遍，再用4%多聚甲醛固定，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的4代hPDLSC，先胰酶消化，將2 ml無(wú)水乙醇和1 ml PBS充分地吹打均勻，并將細(xì)胞密度調(diào)整至1× 105/ml，再用40 g/L的多聚甲醛固定30 min；充分洗滌后分別加一抗：抗-CD105（稀釋濃度1∶100）；抗-CD146（稀釋濃度1∶120）；抗Stro-1（稀釋濃度1∶100）。37℃孵育50 min，加入羊抗兔Ig-FITC，37℃避光50 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)水平。

1.4 單層干細(xì)胞膜片的制備

將增殖狀態(tài)良好的經(jīng)鑒定過(guò)的第4代hPDLSC以胰蛋白酶消化5 min，制成均勻的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)細(xì)胞分別均勻接種在培養(yǎng)皿中，加入10 ml誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含經(jīng)抗壞血酸、10%FBS的DMEM0），2 d換液一次，孵育10 d。

1.52 種支架材料的制備與檢測(cè)

1.5.1 牙本質(zhì)片的處理（treated dentin matrix，TDM）將用于正畸治療需要拔除的上頜第一前磨牙2顆與下頜第一前磨牙2顆分別用外科手術(shù)刀將剩余牙周組織完全刮除，切取根中1/3牙體組織，將剩余的牙體組織制備成2 mm×3 mm大小的長(zhǎng)方體，去離子水中浸泡；17%EDTA浸泡5 min，保存于無(wú)菌PBS溶液中，置于4℃冰箱備用。

1.5.2 羥基磷灰石-磷酸三鈣（hydroxyapite-tricalcium，HA-TCP）的制備將100 ml的氫氧化鈣Ca（OH）2溶液與600 ml磷酸水溶液攪拌均勻直至形成非結(jié)晶羥基磷灰石的溶液。表面進(jìn)行干燥并預(yù)燒結(jié)12 h，最后修整成3 mm×5 mm大小片狀結(jié)構(gòu)，CO60常規(guī)消毒備用。

1.5.3 牙周膜干細(xì)胞膜片與2種支架材料復(fù)合培養(yǎng)掃描電鏡觀察將制備好的支架材料置于一次性培養(yǎng)皿上，浸泡于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中30 min，將膜片分別與支架材料全方位復(fù)合，構(gòu)建生

物性牙根體。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱共孵育7 d，3%戊二醛緩沖液（pH 7.4）固定，PBS沖洗干凈，固定、干燥、噴金。掃描電鏡觀察。

1.5.4 裸鼠皮下異位移植4周齡裸鼠4只購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院動(dòng)物中心，并經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)許可。將細(xì)胞與2種支架材料復(fù)合體植入裸鼠皮下：左側(cè)實(shí)驗(yàn)組植入TDM+HPDLSC膜片（經(jīng)體外共培養(yǎng)），右側(cè)對(duì)照組植入HA-TCP+ HPDLSC膜片（經(jīng)共培養(yǎng)）。移植6周取材，10%福爾馬林固定1周，沖洗、脫鈣、系列脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSC形態(tài)學(xué)觀察

鏡下可見(jiàn)，hPDLSCs呈長(zhǎng)梭形纖維狀，集落狀生長(zhǎng)（見(jiàn)圖1A、B）。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯礦化結(jié)節(jié)，經(jīng)成脂誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯脂滴，說(shuō)明細(xì)胞具有多向分化能力（見(jiàn)圖1C、D）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞表面的干細(xì)胞標(biāo)志性分子CD105、CD146和 STRO-1均成陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖2）。成熟的hPDLSCs細(xì)胞單層細(xì)胞膜片見(jiàn)圖3。

圖1 牙周膜干細(xì)胞的分離與鑒定

圖2 牙周膜干細(xì)胞表面特異性CD分子檢測(cè)

圖3 成熟的hPDLSCs細(xì)胞單層細(xì)胞膜片大體觀

2.2 支架材料掃描電鏡觀察

TDM電鏡觀顯示TDM適合作為支架材料誘導(dǎo)細(xì)胞和微環(huán)境；HA-TCP掃描電鏡觀可見(jiàn)表面形態(tài)良好，適合細(xì)胞黏附和增殖（見(jiàn)圖4）。

圖4 TDM與HA-TCP掃描電鏡觀（×30）

2.3 PDLCS膜片與支架材料共培養(yǎng)掃描電鏡觀察

共培養(yǎng)7 d后，掃描電鏡下可見(jiàn)PDLSC/TDM組界面結(jié)合處細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞的極性化較為明顯，結(jié)合處有明顯的類牙骨質(zhì)的礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生（見(jiàn)圖5A、B）；而在PDLSC/HA-TCP組可見(jiàn)大量的走形不規(guī)則的纖維樣組織生成，細(xì)胞與支架材料結(jié)合處有空隙，未見(jiàn)明顯的細(xì)胞外礦化基質(zhì)的產(chǎn)生（見(jiàn)圖5C、D）。

2.4 PDLSC膜片與支架材料裸鼠皮下異位移植組織學(xué)觀察

組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hPDLSC/TDM組細(xì)胞極性化趨勢(shì)更為明顯，膜片內(nèi)細(xì)胞與支架材料結(jié)合處形成大量走形規(guī)則的纖維連接，穿通性明顯，還能夠觀察

到不均量的礦化物沉積和纖維樣組織，似牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，箭頭處可見(jiàn)交界處明顯的礦化沉積（見(jiàn)圖6A）；PDLSC/HA-TCP組有走形不規(guī)則的穿通纖維形成，形成少量的表面礦化沉積，箭頭處所示（見(jiàn)圖6B）。

圖6 hPDLSC與支架復(fù)合物裸鼠體內(nèi)異位移植組織再生結(jié)果（×40）

3 討論

作為理想的組織工程學(xué)的支架材料可以從微觀結(jié)構(gòu)上控制生物材料與細(xì)胞間的相互作用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定位黏附、增殖分化及細(xì)胞微環(huán)境的重建[9-11]。細(xì)胞定植到支架的表面作為組織再生的第一步尤為重要。只有細(xì)胞定植到支架上后，細(xì)胞才能夠定向增殖并且分泌細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)作為細(xì)胞與支架材料接觸最重要的結(jié)合位點(diǎn)可以使細(xì)胞更好的黏附到支架材料上。目前已有文獻(xiàn)證實(shí)，通過(guò)細(xì)胞的三維培養(yǎng)，促使細(xì)胞膜片分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，提高了細(xì)胞對(duì)材料材料的黏附能力[12-13]。而本實(shí)驗(yàn)所選用的經(jīng)過(guò)特殊處理的牙本質(zhì)片通過(guò)梯度化表面修飾處理，不僅可以提高支架材料的誘導(dǎo)特性，并且極大地優(yōu)化細(xì)胞與支架的特異性作用，從而有利于提高種子細(xì)胞的生物學(xué)特性。

細(xì)胞外基質(zhì)是使用組織工程學(xué)原理構(gòu)建的生物性牙根的重要組成部分，它的構(gòu)建過(guò)程極漫長(zhǎng)和復(fù)雜，受多方面因素影響[14-16]。但來(lái)自于細(xì)胞所處的微環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化將直接或間接影響細(xì)胞外基質(zhì)的平衡的作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的時(shí)空變化[17]。當(dāng)細(xì)胞與支架緊密結(jié)合后，細(xì)胞膜表面特異性受體會(huì)識(shí)別支架材料表面相應(yīng)的配體，并與之相結(jié)合，從而產(chǎn)生特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)和促使種子細(xì)胞自分泌細(xì)胞外基質(zhì)及發(fā)生適應(yīng)性結(jié)構(gòu)和功能改建。通過(guò)支架材料的誘導(dǎo)，存在于細(xì)胞膜片內(nèi)的干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)將發(fā)生功能性重組，細(xì)胞的排列、形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞外基質(zhì)骨架的三維構(gòu)象均將發(fā)生轉(zhuǎn)變，該種變化影響著干細(xì)胞最終的分化方向[18]。本實(shí)驗(yàn)選用的支架材料TDM與HA-TCP均為具有一定活性的誘導(dǎo)性材料，能夠誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞向成骨方向定性分化。SEM結(jié)果表明，兩種支架材料均能使干細(xì)胞膜片內(nèi)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，但TDM還表現(xiàn)出具有提升礦化基質(zhì)沉積量的作用，更為重要的是在接觸共培養(yǎng)的情況下膜片內(nèi)細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞更為狹長(zhǎng)、細(xì)胞突起減少和細(xì)胞極性增加，該特征是否與膜片內(nèi)干細(xì)胞的分化以及生物學(xué)活性的變化有關(guān)，是值得進(jìn)一步探討的內(nèi)容。

本實(shí)驗(yàn)所選用的2種支架材料均有孔隙率高的特點(diǎn)，有利于細(xì)胞的黏附。但塊狀的HA-TCP存在材料表面的親和力差、強(qiáng)度不高和表面自由基容易喪失等缺點(diǎn)。而TDM卻具有定向誘導(dǎo)、強(qiáng)度硬度較高，更易于細(xì)胞表面黏附分子與自由基的附著與固位，在共培養(yǎng)體系中更易誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨方向分化。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TDM與干細(xì)胞膜片的復(fù)合共培養(yǎng)更類似體內(nèi)牙周組織再生的過(guò)程，可以為骨組織工程化發(fā)展提供新的思路。

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（張蕾 編輯）

Biological activity of biological roots constructed by periodontal ligament stem cell sheet*

Xue-peng Tang1,Shi-ting Li2,Chong Wang3,Fu-yan Guan4
(1.Taoyuan Clinic of Dalian Sanatorium of Chinese PLA,Dalian,Liaoning 116013,China; 2.Department of Stomatology,Xinqiao Hospital,the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China;3.Shanping Medical District of No.210 Hospital of Chinese PLA, Dalian,Liaoning 116013,China;4.The No.210 Hospital of Chinese PLA, Dalian,Liaoning 116021,China)

Objective To co-culture the identified human periodontal ligament stem cell membranes(hPDLSC) respectively with pretreated dentin matrix(TDM)and hydroxyapatite/tricalcium(HA-TCP)in vitro,and evaluate the effects of different scaffolds on stem cell differentiation.Methods Monolayer periodontal ligament stem cell membrane was incubated with two different scaffold materials for 1 week,and implanted into osteoporosis rats.Using scanning electron microscopy and histological section,the microsture changes were dynamically observed.Results A lot of mineral deposition and fibrous tissue were formed in the dentin matrix(TDM)group and there was some irregular fibrous tissue regeneration in the HA-TCP group without obvious mineral material generation.Conclusions hPDLSC/TDM composite is more suitable for the stem cells to fully develope their own biological characteristics.It can be more suitable for hPDLSC to differentiate into periodontium in suitable microenvironment.

periodontal ligament stem cell sheet;scaffold material;biological root;tissue regeneration

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.003

1005-8982（2016）22-0013-05

2016-05-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81300873）

管付巖，E-mail：1291512662@qq.com.