朱小華 徐金華

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海200040)

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·臨床免疫學(xué)·

SLE患者DNA低甲基化對DNMT1啟動子表觀修飾負(fù)反饋調(diào)控的研究①

朱小華 徐金華

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海200040)

目的：檢測并分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(SLE)外周血CD4+T淋巴細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的表達(dá)水平與DNMT1啟動子甲基化水平、總體DNA甲基化水平的相關(guān)性，探討DNA甲基化對DNMT1啟動子表觀修飾的負(fù)反饋調(diào)控作用。方法：收集34例SLE患者與23名健康對照者，取外周血T淋巴細(xì)胞，分別用反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)分析DNMT1的表達(dá)水平、亞硫酸氫鈉處理后測序分析DNMT1啟動子甲基化水平、5-甲基胞嘧啶抗體分析總體DNA甲基化水平。結(jié)果：SLE患者總體DNA甲基化水平明顯低于正常人(P<0.05)，總體DNA甲基化水平與狼瘡疾病活動指數(shù)(SLE-DAI)負(fù)相關(guān)(P<0.05)。SLE患者DNMT1啟動子甲基化水平與正常人無差異(P>0.05)，DNMT1啟動子甲基化水平與DNMT1表達(dá)水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：SLE患者的總體DNA低甲基化狀態(tài)未影響DNMT1啟動子的表觀修飾，總體DNA低甲基化狀態(tài)對DNMT1的表達(dá)無明顯負(fù)反饋調(diào)控作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；表觀遺傳；負(fù)反饋

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因未明的累及全身多器官的慢性進(jìn)行性病譜性自身免疫病。SLE表觀遺傳學(xué)的研究顯示，DNA低甲基化為解釋SLE發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略提供了新的線索。DNA低甲基化通過促進(jìn)CD11a/CD18、CD70等共刺激分子的表達(dá)，首先使T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，活化的T細(xì)胞一方面促使B細(xì)胞活化、分泌免疫球蛋白,生了大量的針對自身抗原的抗體[1]。目前對于SLE中DNA甲基化異常的形成和調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚 ，涉及甲基化調(diào)控因素的研究很少。

DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)起著維持DNA甲基化的作用，即根據(jù)模板鏈上特異的甲基化位點(diǎn)，在DNA半保留復(fù)制出的新生鏈相應(yīng)的胞嘧啶上進(jìn)行甲基化修飾的過程。目前有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者存在DNA低甲基化，DNMT1表達(dá)水平明顯下降[2]。SLE患者DNMT1與DNA甲基化是否存在相關(guān)性，DNA甲基化是否具有負(fù)反饋調(diào)控作用，影響DNMT1啟動子的表觀修飾，進(jìn)而影響DNMT1的表達(dá)，目前尚未見報道。本研究通過分析SLE患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞DNMT1的表達(dá)水平與DNMT1啟動子甲基化水平、總體DNA甲基化水平的相關(guān)性，探討DNA甲基化對DNMT1啟動子表觀修飾的負(fù)反饋調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液購自上海國藥集團(tuán)。CD3免疫磁珠分離器購自德國Mitenyi Biotec公司。RNA抽提試劑盒購自美國Promega公司。RNA抽取試劑盒購自荷蘭Qiagen 公司。DNA抽取試劑盒購自中國Tiangen 公司。5-甲基胞嘧啶抗體購自美國Aviva Systems Biology。FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自美國 Santa Cruz。MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit試劑盒由中國Invitrogen公司提供。引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床病例收集 SLE患者34例，為門診與住院病人，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ARA)修訂的SLE標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)(SLE-DAI)進(jìn)行評分。其中活動期患者17例，診斷依據(jù)典型的臨床表現(xiàn)、異常的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及SLE-DAI≥5；緩解期患者17例，診斷依據(jù)SLE病史，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及SLE-DAI<5。正常對照組23名，男性2名，女性21名，采用年齡段、性別匹配。

1.2.2 淋巴細(xì)胞的分離 將SLE患者和正常人外周血采用Ficoll密度梯度離心法后再采用Mitenyi Biotec公司的CD3免疫磁珠分離(按免疫磁珠及分離柱的說明書操作)。將分離的細(xì)胞分成兩份，分別用于總體DNA甲基化與DNMT1的表達(dá)分析。

1.2.3 細(xì)胞基因組DNA抽提 DNA抽提采用Tiangen Genomic DNA kit(血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒)提取,按如下步驟操作：(1)從-80℃冰箱取出凍干細(xì)胞；(2)加入200 μl緩沖液GA，振蕩至徹底混勻；(3)加入20 μl蛋白酶K(20 mg/ml)溶液，混勻；(4)加入220 μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴箱中放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(5)加220 μl無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；(6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；(7)向吸附柱CB3中加入500 μl去蛋白液GD,12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；(8)向吸附柱CB3中加入700 μl漂洗液PW,12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；(9)向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW,12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；(10)將吸附柱CB3放回廢液收集管中，12 000 r/min離心2 min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱CB3置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(11)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μl經(jīng)65～70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心30 s；(12)離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min；(13)紫外/可見光分光光度計測定濃度及A260/A280比值以判定DNA純度，置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 總體DNA甲基化檢測 將分離的一份外周血T淋巴細(xì)胞，在離心管中調(diào)細(xì)胞濃度為1×106ml-1。按下述方法：(1)用PBS清洗一次；(2)4%的多聚甲醛PBS在室溫固定20 min；(3)用PBS在室溫清洗三次；(4)用含0.5%曲拉通100的PBS在室溫通透化處理15 min；(5)用PBS在室溫清洗三次；(6)在室溫用含10%NGS的PBS封閉60 min；(7)在37℃用5-甲基胞嘧啶抗體(終濃度，1 μg/ml)孵育30 min；(8)用含0.1% Tween-20的PBS在室溫清洗三次；(9)用鋁箔包裹后在室溫下用FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育60 min以上；(10)用含0.1% Tween-20的PBS在室溫清洗三次；(11)在流式細(xì)胞儀中檢測平均熒光強(qiáng)度，設(shè)立不加5-甲基胞嘧啶抗體的陽性對照。用熒光指數(shù)表示DNA總體甲基化：熒光指數(shù)=(樣品熒光強(qiáng)度-陽性對照熒光強(qiáng)度)∕陽性對照熒光強(qiáng)度。

1.2.5 啟動子DNA甲基化檢測 用MethylCode Bisulfite Conversion Kit試劑盒對DNA樣本進(jìn)行處理，按如下步驟操作：(1)準(zhǔn)備DNA樣品，總體積為20 μl，如果需要可以補(bǔ)去離子水使總體積為20 μl；(2)在20 μl的樣品中加入130 μl的CT轉(zhuǎn)換試劑，混勻；(3)在PCR儀上進(jìn)行以下程序：98℃ 10 min，64℃ 2.5 h，4℃ 放置20 h；(4)在制備管中加入600 μl的Binding buffer,將制備管置于離心管中；(5)將步驟3中的溶液加入到(4)的Binding buffer中，混合均勻；(6)離心10 000 r/min，30 s,棄濾液；(7)加入100 μl Wash buffer,離心10 000 r/min，30 s，棄濾液；(8)加入200 μl Desulphonation Buffer ，室溫放置15～20 min；(9)離心10 000 r/min，30 s,棄濾液；(10)加入200 μl Wash buffer ，10 000 r/min，30 s,棄濾液；(11)重復(fù)步驟10 ，將制備管置于干凈的1.5 ml離心管中；(12) 制備管中加入15 μl的Elution buffer,10 000 r/min，30 s洗脫DNA；(13)引物設(shè)計合成，正向引物： 5′-AGAGGGAAATTAGTGTTTT-GTTTTT-3′;反向引物:5′-AATTTCTTAACACTTCCCTACTATAAC-3′，共297 bp；(14)第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃ 預(yù)變性3 min→(95℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃30 s)共25個循環(huán)，72℃ 5 min。用第一輪的PCR產(chǎn)物作為模板(稀釋20 倍)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95℃ 預(yù)變性3 min→(95℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃30 s)共40個循環(huán)，72℃ 5 min；(15)用Axygen 凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，轉(zhuǎn)化到凍存的DH5α(200 μl/tube)感受態(tài)細(xì)胞，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)過夜，至克隆長出，每板挑5個克隆送測。

1.2.6 DNM1表達(dá)水平檢測 將分離的CD3+T細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。real time RT-PCR擴(kuò)增DNMT1與內(nèi)參照β-actin。引物序列：DNMT1：正向引物： 5′-GATTTGTCCTTGGAGAA-CGGTG-3′;反向引物:5′-TGAGATGTGATGGTGG-TTTGCC-3′，共245 bp。β-actin：正向引物：5′-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′;反向引物:5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′，共156 bp。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；50個循環(huán)(94℃，變性30 s；55℃，退火30 s；72℃，延伸30 s)；95 ℃ 保溫1 min 后制作熔點(diǎn)曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用Stata7.0統(tǒng)計軟件，采用兩樣本均數(shù)差別的t檢驗(yàn)分別比較SLE活動期、緩解期患者與正常對照組中總體DNA甲基化狀態(tài)和P53基因表達(dá)的差異。總體DNA甲基化狀態(tài)和P53基因表達(dá)水平兩者的相關(guān)性及與SLE-DAI的相關(guān)性采用相關(guān)與回歸分析。以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者與正常人的總體DNA甲基化狀態(tài) SLE患者活動期(8.50±1.42)與正常人(11.31±1.34)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。SLE患者緩解期(11.30±1.34)與正常人相比，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SLE患者活動期與緩解期相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 SLE患者總體DNA甲基化與狼瘡疾病活動指數(shù)(SLE-DAI)的相關(guān)性 SLE患者的DNA甲基化水平與疾病活動指數(shù)(SLE-DAI)的線性回歸分析，顯示DNA甲基化水平與SLE-DAI成負(fù)相關(guān)，r=-0.78,P<0.01(圖1)。

2.3 DNMT1在SLE患者與正常人中的表達(dá) SLE患者及正常人CD4+T淋巴細(xì)胞的DNMT1 Real time PCR擴(kuò)增曲線圖(圖2)。SLE患者CD4+T淋巴細(xì)胞的DNMT1mRNA表達(dá)(0.465 7±0.057 4)與正常人(0.743 9±0.137 7)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 SLE患者DNMT1的表達(dá)水平與總體DNA甲基化水平的相關(guān)性 SLE患者DNMT1的表達(dá)水平與總體DNA甲基化水平的線性回歸分析顯示：DNMT1的表達(dá)水平與總體DNA甲基化水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性(r=0.14,P>0.05)，見圖3。

2.5 SLE患者與正常人的DNMT1啟動子DNA甲基化狀態(tài) SLE患者DNMT1啟動子DNA甲基化水平(0.138±0.065)與正常人(0.155±0.064)相比，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 SLE患者DNMT1啟動子DNA甲基化水平與DNMT1表達(dá)水平的相關(guān)性 SLE患者的總體DNMT1表達(dá)水平與其啟動子DNA甲基化程度的線性回歸分析，顯示總體DNMT1表達(dá)水平與與其啟動子DNA甲基化程度無明顯相關(guān)性，r=-0.083,P>0.05，見圖4。

圖1 SLE患者DNA甲基化水平與SLE-DAI的相關(guān)性Fig.1 Correlation between whole methylation and SLEDAI in patients with SLE

圖2 DNMT1 Real time PCR擴(kuò)增曲線圖Fig.2 Real time PCR amplification curve of DNMT1

圖3 SLE患者DNMT1的表達(dá)水平與總體DNA甲基化的相關(guān)性Fig.3 Correlation between whole methylation and DNMT1 mRNA in patients with SLE

圖4 SLE患者DNMT1的表達(dá)水平與DNMT1啟動子甲基化水平的相關(guān)性Fig.4 Correlation between DNA methylation status of DNMT1 promoter and DNMT1 mRNA in patients with SLE

3 討論

表觀遺傳學(xué)是研究DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下，通過修飾而改變基因表達(dá)與活性，是一種基因外調(diào)節(jié)方式的遺傳變化。人類基因組中約有70%組織特異表達(dá)的基因5′端上游區(qū)有富含CpG二核苷酸對的CpG島。CpG島的甲基化及其去除的狀態(tài)，對維持與調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)起著重要作用，當(dāng)某些CpG島的甲基化去除可引起細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)異常，從而造成各種疾病的發(fā)生[3]。研究表明,表觀遺傳學(xué)變化與幾類疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),主要包括癌癥、免疫缺陷病及自身免疫性疾病[4]。

我們的研究證實(shí)SLE患者體內(nèi)DNA甲基化水平顯著降低，并且DNA甲基化的降低水平與SLE-DAI呈正相關(guān)，說明表觀遺傳學(xué)的改變是SLE發(fā)病的重要機(jī)制。

目前已有研究證實(shí)DNA低甲基化通過促進(jìn)LFA-1、CD70等共刺激分子的表達(dá)，首先使T細(xì)胞具有自身反應(yīng)性，活化的T細(xì)胞一方面促使B細(xì)胞活化、分泌免疫球蛋白；另一方面，大量殺傷巨噬細(xì)胞，增加血液循環(huán)中的自身抗原，降低了對免疫復(fù)合物的清除，兩者相互促進(jìn)，這樣便產(chǎn)生了大量的針對自身抗原的抗體[1]。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化反應(yīng)的催化劑，在染色質(zhì)重構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。DNMT1是DNMT中最為重要的一員，起著維持甲基化的作用，即根據(jù)模板鏈上特異的甲基化位點(diǎn)，在DNA半保留復(fù)制出的新生鏈相應(yīng)的胞嘧啶上進(jìn)行甲基化修飾的過程[5]。我們的研究結(jié)果顯示，SLE患者DNMT1的表達(dá)水平明顯下降，這說明SLE患者DNMT1的低表達(dá)是總體DNA低甲基化水平的重要因素。

在本研究中我們重點(diǎn)探討影響DNMT1表達(dá)的調(diào)控因素，有研究顯示啟動子的表位修飾直接影響了DNA的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，也會影響DNMT的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)DNMT存在啟動子的表位修飾，DNMT啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化后，DNMT的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降[6]。因此，我們研究了SLE患者在存在總體DNA低甲基化的狀態(tài)下是否存在DNMT1啟動子區(qū)域的表位修飾，即SLE患者的DNA低甲基化是否具有負(fù)反饋調(diào)控DNMT1表達(dá)的作用。

我們的研究結(jié)果顯示SLE患者DNMT1啟動子DNA甲基化水平與正常人相比，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。SLE患者的DNMT1表達(dá)水平與其啟動子DNA甲基化程度的線性回歸分析，顯示DNMT1表達(dá)水平與其啟動子DNA甲基化程度無明顯相關(guān)性。

有研究發(fā)現(xiàn)信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)誘導(dǎo)DNMT1的表達(dá)，用STAT3 siRNA處理惡性T淋巴細(xì)胞后DNMT1的表達(dá)明顯下降[7]。腫瘤抑制基因p53通過與DNA特異性結(jié)合而抑制DNMT1的mRNA表達(dá)[8]。p53缺失的B6/lpr狼瘡小鼠自身免疫性下降，同時自身抗體產(chǎn)生減少[9]。Sp蛋白屬于與基因啟動子區(qū)域順式元素結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子家族，Sp1、Sp3蛋白與DNMT1啟動子區(qū)域順式元素的結(jié)合呈劑量依賴性，并能控制DNMT1 基因的表達(dá)[10]。因此，我們推測SLE患者的DNMT1的表達(dá)可能還有其他因素的調(diào)控。

我們的研究表明SLE患者存在明顯的DNA低甲基化狀態(tài)，DNMT1的表達(dá)與DNA低甲基化相關(guān)，DNA低甲基化未影響DNMT1啟動子的表觀修飾，DNA甲基化對DNMT1的表達(dá)無明顯負(fù)反饋調(diào)控作用。DNMT1在SLE表觀遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制的作用及其調(diào)控因素有待進(jìn)一步研究。

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[收稿2015-06-24 修回2015-07-15]

(編輯 張曉舟)

Negative feedback effection of DNA methylation on expression of DNMT1 in patients with systemic lupus erythematosus

ZHU Xiao-Hua,XU Jin-Hua.Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

Objective:To analyse the whole DNA methylation status,expression of DNMT1 and DNA methylation status of DNMT1 promoter from patients with systemic lupus erythematosus(SLE)．To assess the negative feedback effection of DNA methylation on the expression of DNMT1 in the patients with SLE.Methods: The whole DNA methylation status in T cells from 34 SLE patients and 23 healthy controls was assessed by the specific monoclonal antibodies to 5-methylcytosine(5-mc)and the DNA methylation status of DNMT1 promoter was assessed by the Bisulfite Conversion Kit and sequencing.Real time RT-PCR was applied to analyse DNMT1 mRNA levels in T cells from the patients and controls.Results: SLE patients had siginificantly whole DNA hypomethylation than controls(P<0.05),and the whole DNA methylation was negative correlated with the SLE-DAI.There was no difference in levels of DNA methylation of DNMT1 promoter between patients and controls,also no correlation between the levels of DNA methylation of DNMT1 promoter and DNMT1 mRNA.Conclusion: There was no negative feedback effection of DNA methylation on the expression of DNMT1 in the patients with SLE.The mechanism of lower expression of DNMT1 in patients with SLE should be studied further.

Systemic lupus erythematosus；Epignetics；Negative feedback

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.020

①本文受國家自然科學(xué)基金(81371745)資助。

朱小華(1976年-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事自身免疫性疾病的研究。

及指導(dǎo)教師：徐金華(1963年-)，男，博士，教授，主要從事自身免疫性疾病和過敏性皮膚病的研究, E-mail:hsyyxjh@163.com。

R593.24+1

A

1000-484X(2016)04-0542-05