邵繼平 張彩云 胡不為 謝學(xué)立 田樹紅 王日超 黃道隆 符 健

(海南醫(yī)學(xué)院藥物安評中心，?？?71199)

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·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

ELISA法檢測食蟹猴血漿中rhCNB多肽的方法學(xué)評價①

邵繼平 張彩云 胡不為②謝學(xué)立 田樹紅 王日超 黃道隆 符 健

(海南醫(yī)學(xué)院藥物安評中心，海口571199)

目的：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量測定食蟹猴血漿中rhCNB多肽的方法學(xué)評價。方法：利用雙抗體夾心ELISA法，對rhCNB多肽的方法學(xué)靈敏度、線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度和回收率進(jìn)行方法學(xué)驗證。結(jié)果：該方法特異性高，在0.195～12.5 ng/ml的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 15.1X-0.26，R2=0.996 8，定量下限(LLOQ)為0.195 ng/ml；該方法的批內(nèi)精密度CV分別為3.55%、1.39%和4.71%；批間精密度CV分別為1.59%、3.2%和3.8%，均<5%，準(zhǔn)確度在91.9%～108.8%之間，方法回收率在88.5%～108.3%之間，<110%，說明該ELISA方法的準(zhǔn)確度較高。符合驗證要求。結(jié)論：雙抗體夾心ELISA法靈敏度高、通量大、重復(fù)性、準(zhǔn)確度及精密度好，可用于生物樣品中rhCNB多肽的定量檢測。

酶聯(lián)免疫吸附法；食蟹猴；rhCNB多肽；方法學(xué)評價

肝癌(Liver cancer)是嚴(yán)重危害我國人民健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率僅次于胃癌和食道癌，耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為肝癌患者死亡的主要原因。晚期患者往往陷入無藥可救的絕境，在我國中位生存期僅3～6個月，在歐美也僅6～9個月，預(yù)后很差。

雖然治療肝癌的藥物眾多，但大多數(shù)藥物毒副作用大。目前臨床上肝癌藥物最大的缺點是缺乏組織選擇性，在體內(nèi)廣泛分布，在發(fā)揮療效的同時產(chǎn)生嚴(yán)重的全身性毒副作用。因此尋找高效低毒的新型抗癌藥迫在眉睫。

鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin，CN)是目前唯一一種依賴Ca/CaM(鈣調(diào)素)的蛋白磷酸酶，由A、B亞基以1∶1的比例組成異二聚體，A亞基(CNA)是催化亞基，B亞基(CNB)是調(diào)節(jié)亞基。CNB作為該酶的調(diào)節(jié)亞基，能促進(jìn)CNA的活性，且相對分子質(zhì)量小，性質(zhì)穩(wěn)定。CN在免疫激活通路中發(fā)揮重要作用，是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵酶。臨床前研究表明rhCNB(重組人鈣調(diào)磷酸酶B亞基，recombinant human calcineurin B subunit)能刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖以及增強NK細(xì)胞的殺傷活性，增強巨噬細(xì)胞吞噬能力等免疫功能，且rhCNB對H22肝癌有顯著的抑制作用，療效確切，是高效低毒的新型抗肝癌生物藥[1]。

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是蛋白類生物技術(shù)藥物常用的分析方法，具有操作簡單，靈敏度高、特異性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化，易被臨床采用等優(yōu)點[2-4]。rhCNB作為開發(fā)中的一種創(chuàng)新藥，本文采用ELISA方法來評價其療效，并從線性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度、回收率等方面進(jìn)行方法學(xué)驗證，旨在為該ELISA方法在臨床上快速、準(zhǔn)確、方便地定量檢測人生物樣本中的rhCNB奠定基礎(chǔ)，為評價rhCNB用于肝癌治療的臨床療效提供行之有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 rhCNB ELISA試劑盒(批號：A21503 115D，南京金斯瑞公司生產(chǎn))和rhCNB供試品(批號：20140807)均由?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰咎峁?。

1.1.2 儀器 TECAN酶標(biāo)儀(奧地利TECAN有限公司生產(chǎn))，Centrifuge 5810高速離心機(德國Eppendorf公司生產(chǎn))。

1.1.3 實驗動物 食蟹猴6只，普通級，海南新正源生物科技有限公司提供(合格證號：SCXK瓊2011-0002)，雌雄各半，體重(2.4～4.5)kg。飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院藥物安評中心動物房。

1.2 方法

1.2.1 食蟹猴血漿樣品制備方法 從食蟹猴肘正中靜脈取血0.3 ml置于肝素鈉抗凝真空管內(nèi)，靜置1 h后，用3 000 r/min離心20 min，分離后的血漿標(biāo)本保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 ELISA方法 雙抗夾心ELISA法的原理是在酶標(biāo)板上預(yù)先包被rhCNB抗體，待rhCNB抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，再加入HRP標(biāo)記rhCNB多抗，然后用TMB底物顯色，顯色強度與rhCNB濃度成正比。通過酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD值)，根據(jù)rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用線性擬合方式計算rhCNB的含量。試劑盒操作步驟：將rhCNB蛋白加入96孔板內(nèi)，室溫孵育1 h，洗板4次；加一抗，孵育1 h，洗板4次；再加入辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗，孵育0.5 h，洗板4次。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，避光室溫孵育5～15 min，最后加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光度[5,6]。

1.2.3 方法學(xué)評價 對建立的rhCNB雙抗夾心ELISA法分別進(jìn)行線性和范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度、回收率等方法學(xué)驗證[7-9]。(1)線性范圍：線性是指在設(shè)計的劑量范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物質(zhì)濃度呈正比關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系[10,11]。參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法將標(biāo)準(zhǔn)品母液從1 mg/ml倍比稀釋為：12.5 ng/ml、6.25 ng/ml、3.125 ng/ml、1.56 ng/ml、0.78 ng/ml、0.39 ng/ml、0.195 ng/ml、0 ng/ml。檢測其信號值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察是否呈線性。(2)定量下限：以零濃度溶液重復(fù)測定20次。然后計算空白值均值和空白值十倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度，最后統(tǒng)計實驗所測得的平均值為定量下限[12-14]。(3)準(zhǔn)確度：取線性范圍內(nèi)高、中、低三個濃度的溶液進(jìn)行方法學(xué)準(zhǔn)確度的考察。將標(biāo)準(zhǔn)品母液依次稀釋成10 000 ng/ml、5 000 ng/ml、1000 ng/ml。每個濃度的溶液各取2 μl分別加到2 μl猴空白血漿中，用1996 μl 1×稀釋液分別稀釋成10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml高中低三個濃度。每一濃度制備6份樣品。然后按照試劑盒說明書檢測其信號值，最后通過計算回收率比較測定值與真實值之間的差異。(4)精密度：取線性范圍內(nèi)高、中、低三個濃度的溶液進(jìn)行方法學(xué)批內(nèi)和批間精密度的考察。同一批內(nèi)求RSD計算批內(nèi)精密度，連續(xù)測3 d，測其批間差異。標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋方法見1.2.3(1)。(5)回收率：選已知含量的血清樣本，分別加入三個濃度的等體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為10 ng/ml、5 ng/ml、1 ng/ml)，混勻后再用本法進(jìn)行測定?；厥章?實際濃度/理論濃度×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果用藥動學(xué)軟件(BAPP)進(jìn)行線性擬合求回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Microsoft Excel XP軟件進(jìn)行一般計算。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍 對12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0 ng/ml一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行ELISA檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸收值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以陰性對照的2.1倍為cut off 值，確定該方法的陽性值。從圖1可見，線性方程Y=15.1X-0.26，R2=0.996 8。在0～12.5 ng/ml的濃度范圍內(nèi)，本方法的線性關(guān)系良好，符合驗證要求。

2.2 定量下限 定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度最低點，以零濃度溶液重復(fù)測定16次。然后計算空白值均值和空白值十倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度，最后統(tǒng)計實驗所測得的平均值為定量下限。本方法測得的定量下限為0.195 ng/ml。符合驗證要求。

2.3 準(zhǔn)確度 在rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍內(nèi)，選擇高、中和低3個標(biāo)準(zhǔn)品濃度：10、5和1 ng/ml，每一個濃度做6份平行樣品，計算每一濃度的回收率。表1準(zhǔn)確度分析結(jié)果表明該方法高、中、低濃度的回收率分別為107.3%、91.9%和108.8%，均在80%～120%可接受范圍內(nèi)?？梢?，本方法的準(zhǔn)確度符合驗證要求。

2.4 精密度 在rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品線性范圍內(nèi)，選擇高、中和低3個標(biāo)準(zhǔn)品濃度：10、5和1 ng/ml，每一個濃度做6份平行樣品，連續(xù)測定3 d，計算每一濃度的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。表2和表3批內(nèi)和批間精密度結(jié)果顯示該方法的批內(nèi)精密度CV分別為3.55%、1.39%和4.71%；批間精密度CV分別為1.59%、3.2%和3.8%，均<10%?？梢姡痉椒ǖ呐鷥?nèi)和批間精密度均符合驗證要求。

圖1 rhCNB標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rhCNBNote: rhCNB ELISA method had high linearity within 0.195-12.5 ng/ml,the working curve of rhCNB was Y=15.1x-0.26，R2 = 0.996 8.

表1 rhCNB ELISA方法準(zhǔn)確度

Tab.1 Accuracy of rhCNB ELISA method

rhCNB(ng/ml)Trialvalues(ng/ml)Recovery(%)Averagerecovery(%)x±s1010.151101.51111.277112.76710.966109.660107.310.73±0.38110.552105.52110.781107.81410.659106.58954.66193.2194.62192.4254.65993.1884.49689.92591.94.598±0.0644.60192.0224.55291.03511.008100.8231.058105.7851.137113.684108.81.088±0.0511.125112.4751.131113.1191.070107.034

表2 rhCNB ELISA方法批內(nèi)精密度(n=18)

Tab.2 Inter-precision of rhCNB ELISA method(n=18)

表3 rhCNB ELISA方法批間精密度(n=48)

Tab.3 Intra-precision of rhCNB ELISA method(n=48)

rhCNB(ng/ml)Trialvalues(ng/ml)123456x±sWithin-runRSD(%)1010.15111.27710.96610.55210.78110.6599.790±0.1561.598.8678.8878.9969.5098.9339.1369.8029.9049.3669.6769.2409.51954.6614.6214.6594.4964.6014.5525.034±0.1613.25.0525.2494.9915.3645.6895.4894.8975.4336.2905.2184.7154.63911.0081.0581.1371.1251.13151.07051.128±0.0433.81.1831.2311.3251.3091.3131.2550.9961.0020.9021.0221.0851.156

表4 rhCNB ELISA方法回收率

Tab.4 Recovery of rhCNB ELISA method

rhCNB(ng/ml)Trialvalues(ng/ml)Recovery(%)Averagerecovery(%)RSD(%)108.77687.78.56685.68.22782.288.55.69.55795.59.11491.155.415108.35.419108.45.039100.8105.82.395.070101.45.529110.511.056105.61.042104.21.122112.2108.35.501.175117.41.021102.1

2.5 回收試驗 由表4結(jié)果可見，高中低濃度樣品的回收率分別為：88.5%、105.8%、108.3%，方法回收率<110%，說明該ELISA方法的準(zhǔn)確度較高。符合驗證要求。

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附法是高通量篩選和定量檢測生物技術(shù)藥物的一種常用方法，其原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行檢測，靈敏度高達(dá)納克甚至皮克級，以靈敏度高、特異性好、操作簡便、安全而廣泛應(yīng)用于臨床診斷[15-17]。但ELISA法也存在一定的局限性：如重復(fù)性較差、受自身抗體或內(nèi)源性酶等干擾；此外，影響因素多，較明顯的是溫度和時間等，都會帶來誤差。因此用ELISA法定量檢測生物樣本中的藥物，對分析方法的靈敏度、線性范圍、精密度與準(zhǔn)確度等都有嚴(yán)格的要求。本文采用雙抗夾心ELISA技術(shù)對rhCNB試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評價，結(jié)果表明，血漿中雜質(zhì)不干擾樣品的測定，在0.195 ng/ml～12.5 ng/ml的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=15.1X-0.26，R2=0.996 8；高、中、低三個濃度的準(zhǔn)確度高，批內(nèi)和批間精密度均小于10.0%，有良好的精密度；方法回收率<110%。綜上所述：該方法特異性、準(zhǔn)確度和精密度、線性及范圍、定量下限等均符合驗證可接受標(biāo)準(zhǔn)，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地對生物樣品中的rhCNB多肽進(jìn)行定量檢測。

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[收稿2015-10-12 修回2015-10-27]

(編輯 倪 鵬)

Methodological evaluation of rhCNB in long-tailed macaque sera detected by Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)

SHAO Ji-Ping,ZHANG Cai-Yun,HU Bu-Wei，XIE Xue-Li,TIAN Shu-Hong,WANG Ri-Chao,HUANG Dao-Long，F(xiàn)U Jian.Hainan Medical University，Haikou 571199，China

Objective:To validate an enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) method for the quantification of rhCNB in long-tailed macaque sera.Methods: The linear，sensitivity,accuracy，precision and recovery were determined using ELISA.Results: The present ELISA method had high linearity within 0.195 ng/ml-12.5 ng/ml,the working curve of rhCNB was Y= 15.1X-0.26，R2=0.996 8, the method showed good sensitivity of 0.195 ng/ml,the accuracy were in the range of 91.9%-108.8%,and the Coefficient of variation(CV) for inter-assay were 3.55%,1.39% and 4.71%,the intra-assay were 1.59%,3.2% and 3.8%，all less than 10%,the recoveries were in the range of 88.5%-108.3%,<110%.Thus the method was coincidence with requirement.Conclusion: Double antibody sandwich ELISA assay of rhCNB in long-tailed macaque sera has good sensitivity,accuracy,precision and recovery and it can be used to measure rhCNB concentration in biological samples．

Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)；Long-tailed macaque；Recombinant human calcineurin B subunit(rhCNB)； Methodological evaluation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.017

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目(81160408)。

邵繼平(1971年-)，女，博士，副教授，主要從事新藥安全性評價的研究，E-mail：jpshaosl@163.com。

及指導(dǎo)教師：符 健(1959年-)，男，博士，教授，主任，主要從事新藥安全性評價的研究。

R969.1 R917

A

1000-484X(2016)04-0528-04

②西交利物浦大學(xué)，蘇州215123。