王子航 王志成 張嘉星 范運(yùn)達(dá) 康勁松 米旭光

(吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春130021)

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MicroRNA-199a/b-3p抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖機(jī)制研究①

王子航②王志成 張嘉星 范運(yùn)達(dá) 康勁松③米旭光④

(吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春130021)

目的：探討microRNA-199a/b-3p(miR199)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖存活的作用機(jī)制。方法：在三陰乳腺癌細(xì)胞BT549、MDA-MB-231轉(zhuǎn)染miR199，熒光定量檢測(cè)miR199表達(dá)量；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR199對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞存活率的影響；細(xì)胞周期分析檢測(cè)，轉(zhuǎn)染miR199對(duì)在乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：超表達(dá)miR199后，三陰乳腺癌細(xì)胞BT549、MDA-MB-231的增殖率分別下降(41.02±2.34)%和(28.42±6.70)%，細(xì)胞周期均被阻滯在G1期。結(jié)論：miR-199a/b-3p抑制三陰乳腺癌增殖，具有抗三陰乳腺癌增殖藥物開(kāi)發(fā)的潛質(zhì)。

三陰乳腺癌；microRNA-199a/b-3p；增殖

自1991～2010年間，乳腺癌死亡率增長(zhǎng)了32.89%，成為死亡率增長(zhǎng)最快的癌癥，其發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位[1]。近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度已高出原高發(fā)國(guó)家1～2個(gè)百分點(diǎn)，且呈明顯的年輕化趨勢(shì)，每年有16.9萬(wàn)婦女患乳腺癌[2]。根據(jù)乳腺癌分子分型，三陰乳腺癌為雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER2)均為陰性表達(dá)的乳腺惡性腫瘤，約占所有乳腺癌病理類型的10%～17%[3]，相對(duì)非三陰乳腺癌，三陰性乳腺癌無(wú)分子治療靶點(diǎn)，內(nèi)分泌治療無(wú)效；惡性度高，應(yīng)用化療藥物治療則敏感率低、副作用大，且預(yù)后差，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4]。因此需找新的治療靶點(diǎn)和手段是三陰乳腺癌研究中的熱點(diǎn)，本研究擬通過(guò)外源轉(zhuǎn)入microRNA-199a/b-3p對(duì)三陰性乳腺癌增殖進(jìn)行抑制，以達(dá)到抗癌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料 三陰乳腺癌BT549、MDA-MB-231細(xì)胞，使用含10%胎牛血清(四季青生物公司，中國(guó))的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，USA)，添加含青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml，37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)傳代。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑耗材 microRNA-199a-3p mimcs(Biomics，中國(guó))、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))、Lipofecta-mineTM2000(Life Technologies公司，美國(guó))、MTT(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))、SYBR GREEN Master mix(Roche，瑞典)、其他常規(guī)試劑(北京化工，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體法) 在轉(zhuǎn)染前24 h，1×106/孔在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不含抗生素不含血清的不完全培養(yǎng)液。將待轉(zhuǎn)染miRNA mimics按說(shuō)明書(shū)加入到250 μl雙無(wú)培養(yǎng)液中，吹打混勻。同時(shí)，將5～10 μl脂質(zhì)體加入到250 μl雙無(wú)培養(yǎng)液中，吹打混勻。室溫靜置5 min后，將兩者混勻。室溫孵育20 min后，將混合液加入到待轉(zhuǎn)孔中并混勻。培養(yǎng)5 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成完全培養(yǎng)液。

1.2.2 熒光定量分析 以Trizol法提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR熒光染料定量檢測(cè)miR-199表達(dá)量。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)添加各組分后，95℃預(yù)變性30 s，然后40循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同時(shí)融解曲線分析。結(jié)果以2-△△Ct表示mRNA拷貝數(shù)比值。

1.2.3 細(xì)胞增殖分析 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以0.5～1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。過(guò)夜培養(yǎng)后，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔100 μl。按轉(zhuǎn)染方法向細(xì)胞中加入脂質(zhì)體-待轉(zhuǎn)染物混合物，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，5 h后更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(MTT濃度為5 μg/ml的PBS溶液)，37℃避光培養(yǎng)4 h后，移除培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO，水平振蕩10 min，放入酶標(biāo)儀中檢測(cè)波長(zhǎng)570nm處的光吸收值。代入下述公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組吸光值-空白孔吸光值)/(對(duì)照組吸光值-空白孔吸光值)×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次后，將各轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活率導(dǎo)入SPSS軟件，計(jì)算P值。

1.2.4 細(xì)胞周期分析 將PBS清洗過(guò)的待測(cè)細(xì)胞收集到15 ml尖底離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液后用70%乙醇重懸細(xì)胞，4℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，移除固定液，加入PI染液，重懸細(xì)胞。室溫避光30 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2 結(jié)果

2.1 三陰乳腺癌細(xì)胞中miR-199a/b-3p表達(dá)量分析 在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-199mimcs轉(zhuǎn)染組的miR-199表達(dá)量分別是對(duì)照組的(22.33±0.86)倍和(24.43±0.91)倍，均顯著高于對(duì)照組(P<0.01，圖1)。

2.2miR-199抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖miR-199mimcs轉(zhuǎn)染24h后，三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖率分別下降(41.02±2.34)%(圖2A)和(28.42±6.70)%(圖2B)，均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3miR-199誘導(dǎo)三陰乳腺癌細(xì)胞G1期阻滯 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析檢測(cè)miR-199抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中miR-199轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞所占比例為(75.10±3.09)%和(68.61±3.07)%，與對(duì)照組(50.58±1.15)%和(46.39±2.81)%相比均顯著上升(P<0.05)(圖3)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-199可以將三陰乳腺癌細(xì)胞阻滯在G1期。

圖1 三陰乳腺癌細(xì)胞中miR-199表達(dá)量分析Fig.1 Expression of miR-199 in TNBC cellsNote: *.P<0.01.

圖2 miR-199抑制BT549(A)和MDA-MB-231(B)增殖Fig.2 Proliferation of BT549 and MDA-MB-231 (B) inhibited by miR-199Note: *.P<0.01.

圖3 miR-199對(duì)BT549(A)和MDA-MB-231(B)細(xì)胞周期的影響Fig.3 Cell-cycle(G0/G1,S and G2/M)analysis of BT549 (A)and MDA-MB-231(B) transfected with miR-199Note: *.P<0.05.

3 討論

我國(guó)乳腺癌發(fā)病率位居大城市女性腫瘤的第一位，死亡率增長(zhǎng)迅速，乳腺癌已成為對(duì)婦女健康威脅最大的疾病[5]?，F(xiàn)在乳腺癌的治療藥物以蒽環(huán)類、紫杉類、諾維本和健擇為主導(dǎo)，對(duì)于偏晚期乳腺癌新輔助化療、新輔助內(nèi)分泌治療將成為常規(guī)治療方法進(jìn)入臨床[6]。依據(jù)乳腺癌基因表達(dá)特征，將乳腺癌分為5個(gè)亞型：包括導(dǎo)管A型(LuminalA型)，導(dǎo)管B型(LuminalB型)，HER-2過(guò)表達(dá)型(HER-2+型)，基底細(xì)胞樣型(Basal-like型)和正常型(Normal-like型)五型[7]。三陰乳腺癌(TNBC)指的是雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER-2)表達(dá)均為陰性的乳腺癌，約占全部乳腺癌類型的10%～17%[8]。內(nèi)分泌治療及針對(duì)HER-2的分子靶向治療對(duì)于三陰乳腺癌無(wú)效，目前治療中的主要手段為化療，但預(yù)后較差[9]。MicroRNA(miRNA)非編碼單鏈的小分子RNA，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。因此，miRNA在腫瘤診斷、腫瘤分型、預(yù)后判斷及基因治療中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。

在多種腫瘤細(xì)胞中，MiR-199a/b-3p呈現(xiàn)低表達(dá)，恢復(fù)miR-199a/b-3p表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移等[11，12]。因此，本研究擬探究miR-199a/b-3p對(duì)三陰乳腺癌增殖的影響及相應(yīng)機(jī)制。在三陰乳腺癌BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中超表達(dá)miR-199a/b-3p后，細(xì)胞的增殖明顯下降，說(shuō)明miR-199a/b-3p具有抑制三陰乳腺癌細(xì)胞增殖的能力，與其在肝癌、骨肉瘤和腎癌細(xì)胞中作用相同[11,13]。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)超表達(dá)miR-199a/b-3p后，BT549和MDA-MB-231細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著增加，說(shuō)明miR-199a/b-3p將三陰乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯在G0/G1期，這與其在其他類型腫瘤中的機(jī)制相同，相關(guān)分子機(jī)制可能與miR-199a-3p抑制mTOR、BCAR3、cMET或Brm等蛋白表達(dá)相關(guān)，但不排除還與抑制其他基因相關(guān)。進(jìn)一步研究miR-199a-3p抑制三陰乳腺癌增殖的分子機(jī)制，可為三陰乳腺癌治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供較高的理論基礎(chǔ)，并具有一定的臨床價(jià)值。

[1] 石曉君，張曉佳，王富生，等.1990-2010年中國(guó)女性乳腺癌的死亡分布特征[J].中華疾病控制雜志,2012,16(9):743-747.

[2] 鄭 瑩,吳春曉,張敏璐.乳腺癌在中國(guó)的流行狀況和疾病特征[J].中國(guó)癌癥雜志,2013,23(8):561-569.

[3] 胡 彥.三陰乳腺癌患者預(yù)后生存因素臨床分析[J].中外醫(yī)療,2015,34(10):67-68.

[4] 曹 靜,呂志排,雷冬梅,等.乳腺癌的分子分型與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐,2013,12(4):466-469.

[5] 令狐銳霞,司 文,李 瑩,等.3846例乳腺癌流行病學(xué)及臨床病理學(xué)分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,36(10):1017-1021.

[6] 鐘輝鳳,陳曉品.三陰乳腺癌治療現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2015,31(4):488-490.

[7] Lin NU,Vanderplas A,Hughes ME,etal.Clinicopathological features and sites of recurrence according to breast cancer subtype in the National Comprehensive Cancer Network(NCCN)[J].J Clin Oncol,2009,27(15):543-546.

[8] 邱正才.三陰乳腺癌的特征及治療現(xiàn)狀[J].吉林醫(yī)學(xué),2015,36(13):2766-2767.

[9] 陳玉娟,王曉東,汪 靜.三陰乳腺癌的特征及治療現(xiàn)狀[J].中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2012,19(9):113-116.

[10] Yates LA,Norbury CJ,Gilbert RJ.The long and short of microRNA[J].Cell,2013,153(3):516-519.

[11] 陶良俊,秦 超,曹 強(qiáng),等.MicroRNA-199a-3p在腎癌中的表達(dá)及作用[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2012,4(4):229-232.

[12] 王子航,李春實(shí),康勁松,等.microRNA-199a/b-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2015,31(9):1242-1244.

[13] Hou J,Lin L,Zhou W,etal.Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3Pas therapeutic target for hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell,2011,19(2):7065-7070.

[收稿2015-11-28 修回2016-01-27]

(編輯 張曉舟)

Effect of miR-199a/b-3p on cell proliferation of TNBC cells

WANG Zi-Hang,WANG Zhi-Cheng,ZHANG Jia-Xing,FAN Yun-Da,KANG Jin-Song,MI Xu-Guang.Clinical Medical College,Jilin University,Changchun 130021,China

Objective:To analyze the inhibiting mechanism of microRNA-199a/b-3p(miR-199)on cell proliferation of triple negative breast cancer(TNBC)cells.Methods: Expression of miR199 in BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with miR-199a/b-3p was detected by qRT-PCR.The proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells transfected with miR-199 were analysed by MTT assay.Cell cycle of TNBC cells transfected with miR-199 was detected by Flow Cytometry assay.Results: MiR-199a/b-3p could suppress the proliferation of BT549 and MDA-MB-231 cells.Comparing with normal control,the proliferation rate were up to(41.02±2.34)% and(28.42±6.70)%,and the cell cycle were arrest at G1 phase.Conclusion: MiR-199a/b-3p could suppress the proliferation of TNBC,and may be a promising anti-cancer drug for TNBC.

TNBC;microRNA-199a/b-3p;Proliferation

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.006

①本文受吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”創(chuàng)新訓(xùn)練國(guó)家級(jí)培育項(xiàng)目(No. 2015791141)、吉林省科技廳青年基金項(xiàng)目(No.20150520047JH)、吉林省衛(wèi)生計(jì)生科研計(jì)劃(No.2014Z013)資助。

王子航(1994年-)，男，臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2012級(jí)本科，主要從事抗腫瘤機(jī)制的研究，E-mail:1456825616@qq.com。

及指導(dǎo)教師：康勁松(1969年-)，男，博士，副教授，主要從事腫瘤病理生理的研究，E-mail:kangjs@jlu.edu.cn。 米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤靶向治療研究，E-mail:mixg699@163.com。

R735.7

A

1000-484X(2016)04-0480-03

②延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，延吉 133002。

③吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，長(zhǎng)春 130021。

④吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130021。