鄭小娥王震劉浩

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300308）

獸疫鏈球菌ATCC39920可控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用

鄭小娥1王震2劉浩1

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300308）

旨在構(gòu)建一種在獸疫鏈球菌（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）中可用的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并探究其在兩步發(fā)酵中的應(yīng)用。分別構(gòu)建蔗糖、乳糖、木糖和乳酸鏈球菌素（nisin）誘導(dǎo)表達(dá)載體，以編碼透明質(zhì)酸合成酶的hasA基因作為報(bào)告基因，以hasA基因功能缺失導(dǎo)致莢膜缺陷的ΔhasA作為宿主菌，觀察誘導(dǎo)后莢膜生成情況驗(yàn)證系統(tǒng)的可行性。結(jié)果顯示，木糖和nisin系統(tǒng)不能誘導(dǎo)hasA表達(dá)，乳糖系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)效率低，蔗糖系統(tǒng)可嚴(yán)謹(jǐn)且高效誘導(dǎo)基因表達(dá)。以ΔhasA/pLH201菌株實(shí)施兩步發(fā)酵，葡萄糖為唯一糖源時(shí)僅用于菌體生長(zhǎng)，添加蔗糖誘導(dǎo)產(chǎn)生透明質(zhì)酸，終產(chǎn)量達(dá)到3.4 g/L。成功構(gòu)建了一種以蔗糖為誘導(dǎo)物的可控-誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，可用于獸疫鏈球菌兩步發(fā)酵。

獸疫鏈球菌；可控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；可控兩步發(fā)酵；透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是一種高分子量酸性黏多糖，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品及食品行業(yè)［1，2］。工業(yè)生產(chǎn)廣泛采用獸疫鏈球菌（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus）發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸［3］。

近年來(lái)，多株獸疫鏈球菌的全基因組測(cè)序完成并公布［4，5］，為揭示獸疫鏈球菌的基因功能進(jìn)而優(yōu)化HA的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。遺傳操作系統(tǒng)是揭示基因功能的有效工具，目前可用于獸疫鏈球菌的高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)未見報(bào)道。因此，構(gòu)建可在獸疫鏈球菌中高效誘導(dǎo)基因表達(dá)的遺傳操作系統(tǒng)對(duì)其基因功能研究及從分子生物學(xué)角度優(yōu)化獸疫鏈球菌HA發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。

獸疫鏈球菌是一種革蘭陽(yáng)性菌，部分革蘭陽(yáng)性菌中已有較為成熟的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，如用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的乳糖調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)［6］，用于枯草芽孢桿菌的木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)［7］，及用于乳酸菌的乳酸鏈菌素（nisin）調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)［8］等。然而，這些誘導(dǎo)系統(tǒng)能否用于獸疫鏈球菌，獸疫鏈球菌本身是否存在相似功能的元件可用于構(gòu)建誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，目前還不清楚。

關(guān)于獸疫鏈球菌蔗糖操縱子的研究較為清楚［9］，主要由scrR基因、scrB基因和scrA基因組成。scrR編碼GalR-LacI家族的蔗糖操縱子抑制子；scrB編碼蔗糖-6-磷酸水解酶，該酶可將胞內(nèi)蔗糖-6-磷酸水解成果糖和葡萄糖-6-磷酸；scrA 編碼蔗糖特異性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（PTS）的IIABC組分復(fù)合物EnzIIScr可將蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)檎崽?6-磷酸。研究發(fā)現(xiàn)蔗糖可誘導(dǎo)獸疫鏈球菌突變菌株scrA基因的表達(dá)，該誘導(dǎo)受scrR基因產(chǎn)物調(diào)控［10］，因此可嘗試?yán)么斯δ軜?gòu)建蔗糖調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)菌株，基因功能研究的最終目的是通過(guò)發(fā)酵提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。HA發(fā)酵一般采用獸疫鏈球菌分批發(fā)酵［11-13］，HA積累導(dǎo)致發(fā)酵液黏度迅速上升，限制基質(zhì)中物質(zhì)、能量傳遞，菌體生長(zhǎng)受到較大程度抑制，生產(chǎn)效率低下；部分研究者采用連續(xù)發(fā)酵雖能縮短發(fā)酵時(shí)間，節(jié)省生產(chǎn)成本，但也受到產(chǎn)品不穩(wěn)定等因素限制［14］；因此，建立一種HA高效發(fā)酵模式迫在眉睫。有研究曾報(bào)道一種基于分批和分批補(bǔ)料的兩步發(fā)酵策略，用于協(xié)調(diào)菌體生長(zhǎng)和HA合成的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［15］。如今兩步發(fā)酵模式受到越來(lái)越多的關(guān)注，因而探究一種基于基因可控表達(dá)的兩步發(fā)酵策略具有重大意義。

本研究基于蔗糖可誘導(dǎo)scrA基因高水平轉(zhuǎn)錄的原理，以透明質(zhì)酸合成酶編碼基因hasA作為報(bào)告基因，構(gòu)建和比較蔗糖、乳糖、木糖和乳酸鏈球菌素（nisin）誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并依據(jù)葡萄糖效應(yīng)對(duì)蔗糖代謝產(chǎn)生影響的特性，建立一種以蔗糖為誘導(dǎo)物的可控的HA發(fā)酵模式，以期解除HA積累對(duì)發(fā)酵液傳質(zhì)的影響，并協(xié)調(diào)菌體生長(zhǎng)和HA合成的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒如表1所示，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基中37℃條件下培養(yǎng)，獸疫鏈球菌在THY培養(yǎng)基中37℃條件下培養(yǎng)［16］，乳酸菌在M17培養(yǎng)基中37℃條件下培養(yǎng)。大腸桿菌與獸疫鏈球菌的壯觀霉素使用濃度分別為50 mg/L和100 mg/L。

表1 研究所用菌株及質(zhì)粒

1.1.2 工具酶、試劑盒和其他試劑 限制性內(nèi)切酶、Taq酶，反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；UltraSYBR Mixture 購(gòu)自北京康為生物科技有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自全式金公司；PCR純化試劑盒、

瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，均購(gòu)自北京天根生化公司；壯觀霉素、發(fā)酵培養(yǎng)基成分及化學(xué)試劑均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 THB-G培養(yǎng)基（g/L） 牛肉浸粉10.0，胰蛋白胨20.0，NaHCO32.0，NaCl 2.0，Na2HPO40.4。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） MgSO4·7H2O 0.4，酵母浸出物3.5，K2HPO42.0，酪蛋白胨10.0，NaCl 1.5。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)所用引物如表2所示?；谥丿B延伸PCR技術(shù)［17］（gene splicing by overlap extension PCR，簡(jiǎn)稱SOE PCR）構(gòu)建pLH201載體。以獸疫鏈球菌ATCC39920基因組DNA為模板，scrRF/scrR-R和 Pscr-F/Pscr-R為引物，分別擴(kuò)增scrR基因（1 237 bp）及PscrA（365 bp），兩個(gè)片段通過(guò)重疊PCR方法連接形成1 582 bp的片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切回收后，連接到pLH200質(zhì)粒的Sph I/Sal I酶切位點(diǎn)。采用相同方法構(gòu)建乳糖、木糖、nisin誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒，其模板分別為獸疫鏈球菌ATCC39920的基因組DNA，枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，乳酸乳球菌CV56的基因組DNA；所用引物分別為 lacR-PlacA-F/lacR-PlacA-R、xylR-PxylA-F/xylR-PxylA-R、NisK-NisR-F/NisK-NisR-R、PnisA-F/PnisA-R；最終獲得質(zhì)粒pLH202、pLH203和pLH204。

表2 研究所用引物

1.2.2 熒光定量PCR RNA提取參照Mangan等［18］建立的方法。RNA反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行。選取編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的基因作對(duì)照。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)參照北京康為生物科技有限公司UltraSYBR Mixture產(chǎn)品說(shuō)明書規(guī)定條件實(shí)施。

1.2.3 轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)分析 獸疫鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化采用實(shí)驗(yàn)室常用的標(biāo)準(zhǔn)程序［17］。帶有hasA基因的誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)入ΔhasA菌株，經(jīng)THY液體培養(yǎng)后，劃線于THY-G平板（添加適宜濃度的誘導(dǎo)物），37℃培養(yǎng)24 h后觀察其表型。

1.2.4 兩步法發(fā)酵 5 L發(fā)酵罐，裝液量3 L，接種量8%（W/V），轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度37℃，通氣量1.5 vvm，pH用6 mol/L NaOH自動(dòng)控制在7.0。第一階段（0-12 h）向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加初始濃度為30 g/L的葡萄糖，第二階段（12-24 h）葡萄糖消耗殆盡，添加初始濃度為20 g/L的蔗糖。

1.2.5 分析方法 葡萄糖、乳酸殘留量采用生物分析傳感儀測(cè)定。蔗糖殘留量利用間苯二酚化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定［19］。生物量通過(guò)紫外分光光度法檢測(cè)每2 h

的OD值確定。

2 結(jié)果

2.1 獸疫鏈球菌ATCC39920蔗糖操縱子結(jié)構(gòu)及不同碳源對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分析

獸疫鏈球菌ATCC39920蔗糖操縱子結(jié)構(gòu)如圖1-A所示，由蔗糖操縱子抑制子基因（scrR）、蔗糖-6-磷酸水解酶基因（scrB）及蔗糖PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)IIABC編碼基因（scrA）組成，scrR和scrA基因具有相反的轉(zhuǎn)錄方向。接種ATCC39920菌株于不同THB-G液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別為未添加糖類（THB-G）、僅添加蔗糖（THB-G+S）、添加葡萄糖和蔗糖（THB+S）、僅添加葡萄糖（THB），熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)scrA基因在未添加糖源時(shí)轉(zhuǎn)錄，添加蔗糖時(shí)高水平轉(zhuǎn)錄，添加葡萄糖和同時(shí)添加兩種糖時(shí)scrA基因轉(zhuǎn)錄水平極低（圖1-B），表明葡萄糖阻遏蔗糖操縱子中scrA基因的轉(zhuǎn)錄，蔗糖促進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄。

圖1 獸疫鏈球菌中蔗糖操縱子結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄水平分析

2.2 獸疫鏈球菌ATCC39920中高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的篩選

突變株（ΔhasA/pLH203、ΔhasA/pLH204，ΔhasA/ pLH202、ΔhasA/pLH201）分別劃線于添加不同濃度木糖、nisin、乳糖及蔗糖的THB-G固體平板上，37℃恒溫靜置24 h，觀察菌落形態(tài)，如表3和圖2所示。綜上研究表明蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在獸疫鏈球菌ATCC39920胞內(nèi)可高效誘導(dǎo)基因表達(dá)。

表3 四種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)不同濃度誘導(dǎo)物誘導(dǎo)效果

圖2 四種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)不同濃度誘導(dǎo)物誘導(dǎo)效果

2.3 葡萄糖效應(yīng)對(duì)蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的影響

ΔhasA/pLH201突變株分別劃線于添加濃度為1、2.5、5和10 g/L葡萄糖的THB-G（均含有10 g/L蔗糖）固體平板上，37℃恒溫靜置24 h，觀察菌落形態(tài)。如圖3所示，添加1、2.5、5和10 g/L的葡萄糖于含有10 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，均可抑制蔗糖誘

導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)效果。

培養(yǎng)基中葡萄糖濃度高于2.5 g/L，蔗糖不能誘導(dǎo)菌株表達(dá)產(chǎn)生HA，故蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)受葡萄糖效應(yīng)的影響。應(yīng)用此效應(yīng)可建立一種基因可控表達(dá)模式，即用蔗糖誘導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，在特定階段添加濃度高于2.5 g/L的葡萄糖沉默目的基因表達(dá)，從而達(dá)到揭示基因功能或調(diào)整代謝流的目的。

圖3 ΔhasA/pLH201菌株經(jīng)葡萄糖抑制后表型觀察（蔗糖10 g/L）

3 討論

2.4 基于蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的透明質(zhì)酸兩步發(fā)酵策略初探

ΔhasA/pLH201突變株具有蔗糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制hasA表達(dá)的特性，且HA對(duì)蔗糖的得率系數(shù)高于葡萄糖，因此嘗試兩步法分批培養(yǎng)ΔhasA/pLH201突變株的發(fā)酵模式。如圖4-A所示，0-12 h（僅添加葡萄糖）ΔhasA與ΔhasA/pLH201菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，ΔhasA/pLH201突變株生物量達(dá)2.4 g/L；12-24 h（添加蔗糖），兩株菌均有二次生長(zhǎng)情況，ΔhasA/pLH201突變株生物量為2.7 g/L，ΔhasA生物量達(dá)到2.9 g/L。

檢測(cè)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中HA產(chǎn)量變化，結(jié)果（圖4-B）顯示，ΔhasA菌株幾乎不產(chǎn)HA；ΔhasA/ pLH201突變株前12 h（以葡萄糖為唯一糖源）不產(chǎn)HA，添加蔗糖后HA產(chǎn)量迅速提高，且20 h后趨于穩(wěn)定，終濃度達(dá)到3.4 g/L，表明基于蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的HA兩步發(fā)酵策略高效可用。

圖4 ΔhasA與ΔhasA/pLH201發(fā)酵過(guò)程中的生物量、HA產(chǎn)量、殘?zhí)橇恳约叭樗岙a(chǎn)量變化

發(fā)酵過(guò)程中乳酸產(chǎn)量變化如圖4-C所示，菌體生長(zhǎng)前期兩株菌乳酸產(chǎn)量基本一致，進(jìn)入穩(wěn)定期后呈現(xiàn)出明顯差別，ΔhasA/pLH201突變株乳酸終產(chǎn)量達(dá)36.1 g/L，與ΔhasA相比降低7.3%，表明乳酸產(chǎn)量與HA產(chǎn)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，乳酸過(guò)度積累抑制HA產(chǎn)生。

糖源消耗是一個(gè)重要指標(biāo)（圖4-D），ΔhasA/ pLH201與ΔhasA菌株糖源消耗趨勢(shì)基本相同。進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，葡萄糖含量均急劇下降且12 h時(shí)葡萄糖均已基本耗盡；添加蔗糖均約有2 h糖源利用延滯，14 h后蔗糖含量迅速下降，24 h蔗糖均已基本耗盡，糖源消耗與物質(zhì)積累保持一致。

近年來(lái)HA的開發(fā)應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，針對(duì)獸疫鏈球菌基因功能及發(fā)酵模式的研究逐漸成為熱點(diǎn)。由于傳統(tǒng)發(fā)酵方式產(chǎn)HA具有人力、物力、財(cái)力消耗較大，溶氧受到較大程度限制［11］，高耗能［20］，產(chǎn)品不穩(wěn)定［14］且生產(chǎn)效率低（菌體生長(zhǎng)受抑制、副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量過(guò)高）［19］等缺點(diǎn)，僅僅通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化等方式提高HA產(chǎn)量收效甚微，因而越來(lái)越多研究者轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)研究，試圖通過(guò)對(duì)獸疫鏈球菌實(shí)施分子改造以提高HA產(chǎn)量。然而單一分子改造也未能產(chǎn)生預(yù)期效果，因此期望以分子改造為手段獲得發(fā)酵模式的改變，進(jìn)而提高HA產(chǎn)量。

在革蘭陽(yáng)性菌中，Hartman等［6］成功構(gòu)建了可用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的乳糖調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，Nariya等［7］構(gòu)建用于枯草芽孢桿菌的木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，Mierau等［8］構(gòu)建用于乳酸菌的乳酸鏈菌素（nisin）調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)，但是關(guān)于這些系統(tǒng)能否用于獸疫鏈球菌的研究未見報(bào)道。本研究成功構(gòu)建乳糖、木糖及nisin調(diào)控的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，系統(tǒng)可行性分析表明乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)效率低，木糖、nisin誘導(dǎo)系統(tǒng)不工作。木糖不發(fā)揮作用，可能由于木糖自身缺乏木糖磷酸化PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)且不能通過(guò)其它途徑（如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)作用；nisin誘導(dǎo)系統(tǒng)不工作的原因可能是nisin缺乏進(jìn)入獸疫鏈球菌內(nèi)的有效途徑或者nisK-nisR二元系統(tǒng)在獸疫鏈球菌內(nèi)不可用。乳糖誘導(dǎo)效率低可能由于塔格糖-6-磷酸既是誘導(dǎo)物，也是乳糖代謝過(guò)程中的一種中間產(chǎn)物，在以乳糖為唯一糖源時(shí)很快被分解利用，并無(wú)一定的累積量用于誘導(dǎo)表達(dá)，也可能是獸疫鏈球菌內(nèi)乳糖代謝效率較低，PlacA啟動(dòng)子

活性較低，導(dǎo)致hasA基因未能高水平表達(dá)。鑒于上述3種系統(tǒng)在獸疫鏈球菌中均不可用，本研究基于Guzman等［9］的研究，以蔗糖操縱子為基礎(chǔ)構(gòu)建蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，可在獸疫鏈球菌內(nèi)嚴(yán)謹(jǐn)且高效調(diào)控基因表達(dá)。

蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可在獸疫鏈球菌內(nèi)嚴(yán)謹(jǐn)高效表達(dá)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明蔗糖誘導(dǎo)hasA基因表達(dá)且葡萄糖效應(yīng)沉默其表達(dá)，因而建立一種基于基因可控表達(dá)的兩步發(fā)酵模式，用以消除發(fā)酵過(guò)程中HA積累對(duì)發(fā)酵液傳質(zhì)的影響，以期獲得高密度菌體，提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量。兩步法發(fā)酵過(guò)程中，hasA基因缺失促使獸疫鏈球菌喪失莢膜合成能力，溶氧和基質(zhì)傳遞速率增大，但菌體濃度只是略有提高。產(chǎn)生此效果的可能原因是敲除hasA基因?qū)е翲A合成途徑中某些物質(zhì)積累，此類物質(zhì)積累過(guò)量可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。此外獸疫鏈球菌莢膜是大分子量酸性黏多糖（典型陰離子聚電解質(zhì)），帶大量負(fù)電荷［21］，莢膜缺失引起細(xì)胞表面理化性質(zhì)改變，并影響細(xì)胞對(duì)部分陽(yáng)離子吸收利用，從而限制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。后續(xù)將深入研究ΔhasA的生理生化特性，試圖解除限制其生長(zhǎng)繁殖的因素，獲得高密度菌體，并結(jié)合兩步發(fā)酵模式，有望顯著提高HA產(chǎn)量。

4 結(jié)論

本研究從獸疫鏈球菌出發(fā)，成功構(gòu)建4種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并以蔗糖高效誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)獸疫鏈球菌內(nèi)基因可控表達(dá)的兩步發(fā)酵，HA終產(chǎn)量達(dá)到3.4 g/L。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Controlled Inducible Expression System in Streptococcus zooepidemicus ATCC39920 and Its Application

ZHENG Xiao-e1WANG Zhen2LIU Hao1
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

This work aimed at establishing an inducible gene expression system in Streptococcus zooepidemicus，and investigating the application of it in controllable two-stage fermentation. Induced expression vectors by sucrose，lactose，xylose and nisin were constructed，then using hasA of hyaluronic acid（HA）synthase as reporter gene，and ΔhasA with capsule-deletion resulted from the function deletion of gene hasA as the host bacterium，the feasibility of these systems was verified by observing the generation of capsule. The results showed that：The expression of hasA was not induced in the xylose and nisin vector，at low-efficiency in lactose vector，and efficient and rigorous in sucrose vector. A controllable two-stage fermentation mode was conducted using ΔhasA/pLH201 as strain and glucose only as sole sugar source for the growth of bacteria，and added sucrose induced the generation of HA，and HA production reached at 3.4 g/L. In conclusion，this study successfully constructed a sucrose-induced gene expression system that can be used for two-stage fermentation of S. zooepidemicus.

Streptococcus zooepidemicus；controlled inducible expression system；controllable two-stage fermentation；hyaluronic acid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.021

2016-03-03

天津市國(guó)際科技合作項(xiàng)目（13RCGFSY19400），天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金項(xiàng)目（20130602）

鄭小娥，女，研究方向：微生物遺傳育種；E-mail：390857354@qq.com

劉浩，男，博士，教授，研究方向：微生物遺傳育種；E-mail：liuhao@tust.edu.cn