陳大洋甄賀富劉萍邱詠謝林劉弘泰陳芳

（1. 中國科學院大學華大教育中心，深圳 518083；2. 深圳華大基因研究院，深圳 518083）

低深度測序在檢測單細胞染色體微小變異中的應用探索

陳大洋1甄賀富2劉萍2邱詠2謝林2劉弘泰1陳芳2

（1. 中國科學院大學華大教育中心，深圳 518083；2. 深圳華大基因研究院，深圳 518083）

旨在探討低深度測序在檢測單細胞染色體微小變異中的應用。以經(jīng)過比較基因組雜交（array CGH，aCGH）檢測的5例陽性細胞系為研究對象，從中分離的單細胞分別用兩種單細胞擴增試劑盒進行擴增，采用Hiseq2000測序平臺進行全基因組測序，然后進行生物信息學分析，將檢測結果與已被aCGH證實的結果進行比較。結果顯示，5個單細胞的全基因組擴增成功，通過低深度測序均獲得明確的檢測結果。在用GenomePlex?Single Cell WGA Kit試劑盒的處理中檢出區(qū)域與aCGH檢測區(qū)域均有80%以上的重疊，1個樣本檢出了8 Mb（Megabase）左右的假陽性；在用PicoPLEX?WGA Kit試劑盒處理時檢出信號與aCGH區(qū)域也有80%以上的重疊且無假陽性信號產(chǎn)生。證實在數(shù)據(jù)量為0.1 X左右時可以檢出單細胞染色體上7 Mb以上的拷貝數(shù)變異。

單細胞；低深度；染色體變異；擴增

基于單細胞測序技術（single-cell sequencing）的變異檢測方法極大促進了我們對大腦、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，及其組成這些系統(tǒng)的細胞之間異質性的認識。隨著二代測序技術的發(fā)展，單細胞測序為理解不同細胞類型分化過程中的基因組穩(wěn)定性提供了新視角。例如，Hou等［1］將多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）和單細胞深度測序相結合應用到原發(fā)性血小板增多癥（一種血癌）

和腎透明細胞癌（一種腎癌）的腫瘤內(nèi)部遺傳特征研究中，解決了用組織樣本測序時無法解決的腫瘤高異質性難題。McConnell等［2］以單個腦神經(jīng)元細胞為研究對象，通過單細胞測序在細胞中發(fā)現(xiàn)了大段的DNA缺失或重復突變。尤其在植入前篩查或診斷領域，通過對人極體活檢和單細胞測序能夠準確檢測胚胎染色體非整倍體，從而挑選正常胚胎進行植入［3］。

單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）和拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）是兩種主要的遺傳多態(tài)類型。SNP是指由單個核苷酸改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性，基于單細胞檢測SNP通常需要30X以上的測序深度［4］，測序成本較高。CNV是指與參照基因組比較，1 kb-1 Mb的DNA片段的缺失、插入、重復、倒位和復雜多位點的變異［5］。CNV包含數(shù)千個基因、疾病位點、功能性因子和部分重復序列，多發(fā)生在富含重復序列的位置。例如，端粒、著絲粒和異染色質；作為遺傳標記，與SNP具有較好的互補性。目前熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術、比較基因組雜交（array CGH，aCGH）、單核苷酸多態(tài)性-微陣列比較基因組雜交技術（single nucleotide polymorphism array based comparative genomic hybridization，SNP-array CGH）和高通量測序技術在檢測單細胞CNV方面均有應用。

因為高通量測序成本較高，如何降低檢測成本成為迫切需要解決的問題。低深度測序方法檢測染色體變異方法具有成本低、準確性高、通量大等優(yōu)點。Zong等［6］發(fā)現(xiàn)每一百個基因組位點中挑出一個位點進行測序就足夠檢測胚胎非整倍體。本研究從5例細胞系中挑選出單個細胞分別用兩種常用的商業(yè)試劑盒進行全基因組擴增，用Hiseq2000進行低深度測序，旨在研究低深度測序在檢測單細胞CNV方面的可行性。org/上查詢；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（含2 mmol/L的L-谷氨酰胺）、D-PBS緩沖液、胰酶-EDTA、未滅活的小牛血清、Qubit?dsDNA Broad-Range Assay kit購自Life Technologies公司；單細胞全基因組擴增試劑盒分別購自Sigma公司的GenomePlex?Single Cell WGA Kit和Rubicon Genomics公司的PicoPLEX?WGA Kit；在深圳華大基因研究院完成文庫構建和Hiseq2000平臺測序。

表1 細胞系核型標準結果

1 材料與方法

1.1 材料

5例B淋巴細胞系購于Coriell研究所，具體細胞系信息可根據(jù)表1在網(wǎng)址https://catalog.coriell.

1.2 方法

1.2.1 細胞挑選 本研究在倒置顯微鏡下完成單細胞挑取，利用口吸管技術從懸浮細胞中挑取狀態(tài)理想、形狀圓潤的單細胞。首先，吸取1 μL細胞懸浮液，在D-PBS緩沖液進行梯度稀釋至能觀察到單細胞分散的狀態(tài)，用口吸管挑取單個細胞，然后在一新D-PBS緩沖液中進行洗滌至少3遍。最后，將洗滌干凈的單細胞轉移至預先裝有4 μL D-PBS緩沖液（或單細胞全基因組擴增試劑盒提供的細胞裂解液）的0.2 mL的PCR管中，短暫離心后放置于-20℃暫時保存（一周內(nèi)）或-80℃長期保存（一周以上）。

注意轉移單細胞后的口吸管，可以返回洗滌液中反復吹打，以確保單細胞沒有殘留。

1.2.2 全基因組擴增 分別將單細胞取出解凍后，進行短暫離心。同時利用兩種單細胞全基因組擴增試劑盒按各自的操作說明進行擴增。

擴增完成后，用Qubit?2.0 Fluorometer核酸熒光分析儀進行PCR產(chǎn)物濃度檢測，計算擴增產(chǎn)量。然后取1-2 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測PCR產(chǎn)物片段的長度范圍以及統(tǒng)計擴增成功率。

1.2.3 文庫構建和上機測序 本項研究的數(shù)據(jù)在Illumina Hiseq2000測序儀上獲得，文庫構建方法按照Hiseq2000的PCR Free PE index文庫構建標準操

作進行，主要過程如下：首先取500 ng的PCR產(chǎn)物進行超聲打斷，目標片段范圍為150-450 bp，然后進行末端修復，加3'-dA末端，以及連接測序的帶標簽接頭。最后用Qpcr對文庫進行濃度定量，將測序文庫混合成上機文庫進行上機測序，本研究選擇SE50+8 index的測序類型。

1.2.4 數(shù)據(jù)質控和過濾 對于測序下機數(shù)據(jù)首先通過FastQCv0.11.2軟件對樣本的數(shù)據(jù)指標進行質控；對于質控合格的樣本去掉低質量，測序接頭污染和擴增接頭污染的序列，隨機抽取2 M（百萬條序列）序列用于后續(xù)分析。

1.2.5 序列比對 利用短序列比對軟件BWA（Version0.7.7）［7］將過濾后的序列比對到人類參考基因組上（GRCh37，UCSC release hg19）；BWA的參數(shù)設置為bwa aln -l 15 -t 12，比對結果以SAM文件輸出；根據(jù)SAM文件［8］中的FLAG，POS和MAPQ信息挑出非重復且唯一比對的序列用于下游分析，并統(tǒng)計樣本比對指標。

1.2.6 均勻性評估 基于之前報道的方法將參考基因組劃分為長度不同的窗口，根據(jù)比對上序列的坐標信息，統(tǒng)計落入每個窗口內(nèi)的序列數(shù)，之后對序列數(shù)進行標準化和GC含量矯正［9］，得到代表每個窗口的拷貝數(shù)值，用每條染色體的變異系數(shù)來評估基因組的均勻性大小。

1.2.7 CNV檢測 對于單個樣本，以全基因組范圍內(nèi)劃分好的窗口為檢測單元，對檢驗窗口中所包含的測序序列進行統(tǒng)計分析，用標準化后的落入每個窗口的序列數(shù)比值代表該窗口的測序深度。對不同GC含量的窗口計算每個GC含量間隔內(nèi)的測序深度，并對相應GC含量的窗口進行深度校正。用waldwolfowitz游程檢驗對全基因組內(nèi)的窗口進行統(tǒng)計檢驗，找出不同于群體的窗口，將這些顯著性窗口進行合并，最終根據(jù)合并區(qū)域的長度，深度值和顯著性大小確定拷貝數(shù)變異的具體坐標［9］。

2 結果

2.1 試劑盒擴增產(chǎn)量

表2表示在最終體積一致的情況下兩種不同試劑盒的擴增產(chǎn)量；圖1表示兩種不同商業(yè)擴增試劑盒擴增濃度比較；從中可以看出同一樣本Sigma公司的試劑盒（以下簡稱Sigma）擴增濃度較高，但樣本間差異較大，而Rubicon公司（以下簡稱Rubicon）的樣本間擴增濃度波動較小，且耗時較短。

表2 兩種不同擴增試劑盒擴增產(chǎn)量

圖1 兩種不同擴增試劑盒擴增濃度分布

2.2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出

表3為經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后單個樣本比對的統(tǒng)計指標。Sigma試劑盒唯一比對率的波動范圍為62.8%-65.1%，Rubicon試劑盒唯一比對率的波動范圍為59.1%-60.1%。在唯一比對到參考基因組上的序列中Sigma擴增的重復序列占比為7.6%-20.1%，Rubicon的占比為2.5%-3.0%。另外Rubicon擴增的序列GC含量平均為43.5%，Sigma的平均為39.0%。

表3 兩種不同擴增試劑盒比對數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 均勻性評估

圖2為用變異系數(shù)衡量全基因組波動情況示意圖。Sigma試劑盒的變異系數(shù)平均值±標準差為

0.35±0.05，Rubicon試劑盒變異系數(shù)的平均值±標準差為0.28±0.04。使用SPSS軟件對兩組數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，得出t=2.515，P=0.066。經(jīng)過Rubicon處理的樣本變異系數(shù)平均要比Sigma少0.07，說明Rubicon的均勻性較好。圖3顯示樣本各條染色體上標準化后的深度均在1附近波動，19號染色體GC含量是所有染色體中最高的，導致測到的序列較少。

圖2 兩種試劑盒擴增樣本的均勻性比較

圖3 樣本內(nèi)各個染色體上的深度分布

2.4 CNV檢測

參考之前報道的檢測CNV方法對10個樣本數(shù)據(jù)進行檢測，表4中列出了最終的檢測結果?？梢钥闯鰴z出的區(qū)帶與標準區(qū)帶均有80%以上的重合，根據(jù)之前報道［10］的判別標準可以認為1、3、4、5號細胞系兩種試劑盒檢出的區(qū)域與標準區(qū)域一致。在用Sigma擴增的產(chǎn)物中1個樣本檢出了8 Mb左右的假陽性；在用Rubicon擴增的產(chǎn)物中無假陽性信號產(chǎn)生。2號細胞系核型為46，XX，der（3）dup（3q）inv（p26q22）說明3號染色體在3q區(qū)帶發(fā)生重復，且斷裂和鏈接（倒位）發(fā)生于p26和q22區(qū)域，說明此數(shù)據(jù)分析方法不能檢測倒位事件。從圖4可以看出采用低深度測序策略變異區(qū)域缺失信號明顯，這也證明了低深度測序可以檢出有效的CNV。

表4 十個樣本的檢測結果

2.5 最低數(shù)據(jù)量測試

隨機抽取 0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2 M測序序列來評估鑒定拷貝數(shù)變異的最低數(shù)據(jù)量。從表5中可以看出當數(shù)據(jù)量在0.75 M以上時可以有效檢測出全部變異。

表5 不同數(shù)據(jù)量檢測結果匯總.

3 討論

在人類已知的200多種染色體疾病中大多數(shù)是由染色體數(shù)目異常引起，如常見的13、18和21號染色體異常。另有部分染色體疾病因缺失或重復一段染色體片段而引起，統(tǒng)稱為染色體微缺失/微重復綜合征［11］?；诘蜕疃葴y序對單細胞染色體非整倍體進行篩查在臨床上已有報道［12］，但缺乏基于此策略對染色體微小變異的報道。本實驗對5例已知核型的單細胞采用低深度測序策略檢測染色體微小變異，為這一策略在臨床上的應用提供了數(shù)據(jù)支持。本實驗發(fā)現(xiàn)Rubicon試劑盒具有較好的均勻性，原因可能在于Rubicon試劑盒先以原始基因組為模板進行復制，經(jīng)過12次循環(huán)后，再以擴增產(chǎn)物為模板

進行擴增可有效降低擴增誤差，增加保真性［13］。而Sigma試劑盒是以擴增產(chǎn)物為模板進行擴增，其指數(shù)擴增會放大誤差導致擴增均勻性差［14］。

最近，高分辨率寡核苷酸和單核苷酸多態(tài)性微陣列技術（single nucleotidepolymorphismarray，SNP array）也被用于產(chǎn)前診斷，與熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）相比，SNP array 能在更廣范圍內(nèi)進行染色體異常的檢測，可發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的、小于5 Mb 的染色體微缺失/微重復［15］。然而，對某些罕見的、數(shù)據(jù)庫中未涵蓋的CNV，仍無法實現(xiàn)可靠的診斷。隨著二代測序技術在臨床上的廣泛應用，特別是單細胞檢測領域，低深度的CNV篩查具有重要意義。例如，Navin等［16］利用單細胞測序定量基因組拷貝數(shù)變異數(shù)，通過對2例乳腺癌病人進行單細胞測序進而構建腫瘤演變模型，研究腫瘤細胞異質性；McConnell等［17］從3位死者體內(nèi)分離了100個神經(jīng)元，采用單細胞測序技術，結果顯示41%的神經(jīng)元擁有獨特的CNV，表明這些神經(jīng)元并不是來自于同一個親本；在輔助生殖領域能夠在D3對胚胎中的單個細胞進行染色體變異的精確篩查并在D5選擇正常胚胎進行植入，使篩查和植入在同一個周期完成。低深度檢測單細胞染色體微小變異還需更多的樣本驗證才能應用到臨床領域，其將為分析遺傳發(fā)育，疾病研究提供非常有價值的幫助。

4 結論

本研究以來自相同細胞系的單細胞為材料，用兩種不同的擴增試劑盒進行全基因組擴增，并進行

低深度測序，結果表明低深度測序可以檢測單細胞染色體的微小變異。

圖4 來自Sigma（左）和Rubicon（右）擴增樣本的染色體變異檢測結果

［1］Hou Y, Song L, Zhu P, et al. Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm［J］. Cell, 2012, 148（5）：873-885.

［2］ McConnell MJ, Lindberg MR, Brennand KJ, et al. Mosaic copy number variation in human neurons［J］. Science, 2013, 342（6158）：632-637.

［3］Van der Aa N, Zamani EM, Vermeesch JR, et al. Preimplantation genetic diagnosis guided by single-cell genomics［J］. Genome Medicine, 2012, 5（8）：71.

［4］Ning L, Li Z, Wang G, et al. Quantitative assessment of single-cell whole genome amplification methods for detecting copy number variation using hippocampal neurons［J］. Scientific Reports, 2014, 5（5）：11415.

［5］Goidts V, Cooper DN, Armengol L, et al. Complex patterns of copy number variation at sites of segmental duplications：an important category of structural variation in the human genome［J］. Human Genetics, 2006, 120（2）：270-284.

［6］Zong C, Lu S, Chapman AR, et al. Genome-wide detection of singlenucleotide and copy-number variations of a single human cell［J］. Science, 2012, 338（6114）：1622-1626.

［7］Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform［J］. Bioinformatics, 2009, 25（14）：1754-1760.

［8］Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The sequence alignment/map format and SAMtools［J］. Bioinformatics, 2009, 25（16）：2078-2079.

［9］Zhang C, Zhang C, Chen S, et al. A single cell level based method for copy number variation analysis by low coverage massively parallel sequencing［J］. PLoS One, 2013, 8（1）：e54236.

［10］Tsuang DW, Millard SP, Ely B, et al. The effect of algorithms on copy number variant detection［J］. PLoS One, 2010, 5（12）：e14456.

［11］Gardner RJMK, Sutherland GR, Shaffer LG. Chromosome abnormalities and genetic counseling［M］. New York：Oxford University Press, 2004.

［12］Wells D, Kaur K, Grifo J, et al. Clinical utilisation of a rapid lowpass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation［J］. Journal of Medical Genetics, 2014, 51（8）：553-562.

［13］Langmore JP. Rubicon Genomics, Inc［J］. Pharmacogenomics, 2002, 3（4）：557-560.

［14］ Lei H, Fei M, Alec C, et al. Single-cell whole-genome amplification and sequencing：methodology and applications［J］. Annu Rev, 2015, 6：10-14.

［15］Schaaf CP, Wiszniewska J, Beaudet AL. Copy number and SNP arrays in clinical diagnostics［J］. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2011, 12（12）：25-51.

［16］Navin N, Kendall J, Troge J, et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing［J］. Nature, 2011, 472（7341）：90-94.

［17］McConnell MJ, Lindberg MR, Brennand KJ, et al. Mosaic copy number variation in human neurons［J］. Science, 2013, 342（6158）：632-637.

（責任編輯 馬鑫）

Application of Low-coverage Whole Genome Sequencing in Detecting Chromosome Micro Variations of Single Cell

CHEN Da-yang1ZHEN He-fu2LIU Ping2QIU Yong2XIE Lin2LIU Hong-tai1CHEN Fang2
（1. BGI Education Center，University of Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518083；2. Beijing Genomics Institute，Shenzhen 518083）

The paper aims to study the application of low-coverage whole genome sequencing in detecting chromosome micro variations of single cell. Using 5 cell lines with positive signal and validated by aCGH as research object，the complete genome of single cell amplified by two commercial kits was sequenced by Hiseq2000；then，comparing the results by bioinformatics with those validated by aCGH. Results showed that in preliminary tests，the whole genome amplification（WGA）was successful in the 5 single cells. Following the low-coverage whole genome sequencing，they all showed the expected karyotype. While using the GenomePlex? Single Cell WGA Kit，the overlapping rate of the detection results and aCGH results was more than 80%，but there was 1 false positive signal of about 8 Mb（Megabase）in 1 sample. While using PicoPLEX? WGA Kit，the overlapping rate of the detection results and aCGH results also was more than 80%，and there was no false positive signal in detection results. The results confirmed that the method would detect the copy number variations larger than 7 Mb via the low-coverage whole genome sequencing（0.1 X）.

single cell；low-coverage；chromosome variations；amplification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.011

2016-04-16

深圳市未來產(chǎn)業(yè)專項資金（CXZZ20140808170655268）

陳大洋，男，碩士研究生，研究方向：胚胎篩查；E-mail：chendayang@genomics.cn

陳芳，女，博士，研究方向：產(chǎn)前診斷；E-mail：fangchen@genomics.cn