王小莉余慶袁雅紅騰智平李東升曾毅

（1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所，十堰 442000；3. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所，北京 100052）

利用TALEN技術(shù)建立恒河猴TRIM5α基因突變細(xì)胞株

王小莉1，2余慶2袁雅紅1，2騰智平3李東升2曾毅1

（1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所，十堰 442000；3. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所，北京 100052）

利用TALEN技術(shù)建立恒河猴TRIM5α基因突變細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究TRIM5α基因的功能奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建針對(duì)TRIM5α打靶基因的TALEN，通過(guò)點(diǎn)突變的方法獲得包含TRIM5α第7個(gè)外顯子中打靶位點(diǎn)1 211-1 224的基因序列并構(gòu)建點(diǎn)突變donor載體。將打靶TRIM5α基因的TALEN質(zhì)粒和donor質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入恒河猴腎細(xì)胞（LLC-MK2）中，無(wú)限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞系，通過(guò)抽提基因組DNA，再利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)序列并測(cè)序篩選出TRIM5α堿基缺失（1 215-1 216）和點(diǎn)突變（1 213-1 215，1 217）的細(xì)胞系。通過(guò)共轉(zhuǎn)TALEN質(zhì)粒和點(diǎn)突變的donor質(zhì)粒篩選獲得了TRIM5α基因敲除和TRIM5α基因點(diǎn)突變的LLC-MK2細(xì)胞系。

TRIM5α；TALEN；恒河猴；點(diǎn)突變

艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起，并以全身免疫系統(tǒng)損害嚴(yán)重為特征的傳染性疾病。目前全世界每天約有 1.5萬(wàn) HIV 新發(fā)感染者，艾滋病已成為 21 世紀(jì)人類(lèi)面臨的最嚴(yán)峻的考驗(yàn)之一。艾

滋病的有效治療需要疫苗和藥物的研發(fā)，而目前艾滋病疫苗和藥物研發(fā)的一個(gè)瓶頸就是沒(méi)有合適的動(dòng)物模型［1-4］。與人類(lèi)最相近的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物是研究艾滋病的理想動(dòng)物模型，但HIV病毒不能有效在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，其最主要原因就是非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物存在天然的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的固有免疫限制因子［5-7］。這些固有免疫分子在不同種屬宿主中的進(jìn)化，限制了HIV-1以及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的跨種間傳播。正是這些固有免疫因子的異源分化性阻礙了HIV-1感染動(dòng)物模型的建立。TRIM5α是目前發(fā)現(xiàn)的最主要的限制性因子之一，也是HIV進(jìn)入感染細(xì)胞最先遇到的限制性因子，它可以結(jié)合感染的逆轉(zhuǎn)錄病毒的衣殼，并將其滅活［8，9］。因此如何改造猴子的TRIM5α基因使其失去抵御HIV感染的能力成為建立非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物HIV模型的關(guān)鍵。本研究將利用TALEN技術(shù)建立恒河猴TRIM5α基因點(diǎn)突變的細(xì)胞株，旨為進(jìn)一步研究TRIM5α基因突變對(duì)HIV病毒感染能力的影響及建立恒河猴HIV感染動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DNA ladder（碧云天生物技術(shù)公司）；100 bp DNA marker、基因組提取試劑盒、點(diǎn)突變?cè)噭┖小⑿×抠|(zhì)粒提取試劑盒、PCR mix（天根生化技術(shù)有限公司）；T4 DNA Ligase、BamH I酶、Pst I酶（NEB公司）；Opti-MEM、DMEM、胎牛血清（Gibco公司）；TALEN試劑盒（斯丹塞生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 恒河猴胚腎細(xì)胞系LLC-MK2細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，保持細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

1.2.2 TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)TRIM5α基因序列設(shè)計(jì)打靶位點(diǎn)，根據(jù)TALEN試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建TRIM5α TALEN左右臂質(zhì)粒。PCR、酶切篩選鑒定陽(yáng)性菌落。PCR篩選正向引物為：5'-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3'，反向引物為：5'-AGCTGGGCCACGATTGAC-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10 min。PCR篩選的陽(yáng)性菌落提質(zhì)粒BamH I和Pst I雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 點(diǎn)突變donor序列的獲得 收集LLCMK2細(xì)胞按基因組提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取基因組，PCR的方法獲得donor序列連入T載體并篩選出陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，PCR正向引物為：5'-TATCCCCTAACTGACCTGT-3'，反向引物為：5'-GGAGAATATGGCACAAGA-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10 min。按點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)步驟操作，選取單克隆測(cè)序并篩選出成功點(diǎn)突變的donor克隆。

1.2.4 TALEN質(zhì)粒打靶細(xì)胞 將8 μg TRIM5α TALEN質(zhì)粒（左右臂質(zhì)粒各4 μg）、2 μg點(diǎn)突變的Donor PCR回收產(chǎn)物與90 μL含1×106LLC-MK2細(xì)胞的Opti-MEM混合，150 V電擊5 s后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至六孔板中37℃培養(yǎng)。

1.2.5 T7E1酶切 根據(jù)TRIM5α打靶位點(diǎn)兩端的序列設(shè)計(jì)PCR上游引物：5'-GACACTGGCTCCAAACA -3'，下游引物：5'-TCTACGAAAACTCCAACAC-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10 min。PCR產(chǎn)物37℃ T7E1酶切30 min后瓊脂糖凝膠電泳。檢測(cè)打靶效率時(shí)打靶細(xì)胞基因組PCR產(chǎn)物直接T7E1酶切，挑選陽(yáng)性克隆時(shí)野生型與打靶細(xì)胞PCR產(chǎn)物經(jīng)變性退火后再T7E1酶切。

1.2.6 挑細(xì)胞單克隆測(cè)序 打靶后的細(xì)胞采用無(wú)限稀釋法，接種到96孔板，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 d后在顯微鏡下觀察標(biāo)記單克隆細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳入24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，提取基因組PCR擴(kuò)增T7E1酶切鑒定，陽(yáng)性克隆目的片段PCR產(chǎn)物連入T載體并測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 打靶TRIM5α基因TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

研究表明，恒河猴TRIM5α基因序列中可與小的泛素化相關(guān)的修飾蛋白相互作用的位點(diǎn)（SIM）與HIV病毒感染的限制性有關(guān)，本研究設(shè)計(jì)的TALEN打靶位點(diǎn)主要是針對(duì)TRIM5α基因的SIM位

點(diǎn)。根據(jù)NCBI中恒河猴TRIM5α的基因組序列和對(duì)TRIM5α基因的分析，按TALEN試劑盒設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)的TALEN打靶左右臂的序列如圖1-A所示。菌落PCR篩選陽(yáng)性菌落，陽(yáng)性菌落的PCR產(chǎn)物大小約為1 700 bp，如圖1-B所示，左右臂各挑3個(gè)克隆，篩選出左臂兩個(gè)陽(yáng)性克隆右臂一個(gè)陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提質(zhì)粒BamH I和Pst I雙酶切鑒定，酶切后產(chǎn)物的大小與理論大小相符（圖1-C）。質(zhì)粒進(jìn)一步的送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果通過(guò)比對(duì)完全正確。以上結(jié)果表明，成功構(gòu)建了打靶恒河猴TRIM5α的TALEN左右臂質(zhì)粒。

圖1 打靶TRIM5α基因的TALEN設(shè)計(jì)及質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定

2.2 恒河猴Trim5 alpha點(diǎn)突變donor的構(gòu)建及鑒定

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了針對(duì)打靶恒河猴TRIM5α基因序列中SIM位點(diǎn)兩端的donor序列，結(jié)果如圖2-A所示。通過(guò)點(diǎn)突變?cè)噭┖袑onor序列中SIM位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行點(diǎn)突變，菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，結(jié)果如圖2-B所示。選取菌落PCR鑒定正確的菌落擴(kuò)增培養(yǎng)提質(zhì)粒測(cè)序鑒定，SIM位點(diǎn)的序列成功點(diǎn)突變，測(cè)序結(jié)果如圖2-C所示。以上結(jié)果表明，成功獲得了恒河猴TRIM5α點(diǎn)突變的donor序列。

圖2 恒河猴TRIM5α點(diǎn)突變donor的構(gòu)建及鑒定

2.3 T7E1酶切檢測(cè)TALEN打靶效率

將構(gòu)建鑒定正確的打靶恒河猴TRIM5α的TALEN左右臂質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到LLC-MK2細(xì)胞中，TALEN右臂質(zhì)?？杀磉_(dá)GFP，電轉(zhuǎn)24 h后熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情況，70%左右的細(xì)胞均為GFP陽(yáng)性，結(jié)果如圖3-A所示。轉(zhuǎn)入打靶恒河猴TRIM5α的TALEN質(zhì)粒的細(xì)胞和野生型的細(xì)胞提取基因組，PCR擴(kuò)增含打靶位點(diǎn)的序列，產(chǎn)物經(jīng)T7E1酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3-B）顯示，理論打靶酶切后得到的產(chǎn)物大小為150 bp和450 bp左右的兩條帶，電泳結(jié)果與理論相符，經(jīng)灰度分析打靶效率約為50%。以上結(jié)果表明構(gòu)建的打靶恒河猴TRIM5α的TALEN質(zhì)粒可成功打靶TRIM5α基因。

圖3 TALEN打靶恒河猴TRIM5α基因

2.4 篩選TRIM5α基因突變的細(xì)胞克隆

將打靶恒河猴TRIM5α的TALEN左右臂質(zhì)粒和突變donor序列的PCR產(chǎn)物通過(guò)電轉(zhuǎn)的方法導(dǎo)入LLC-MK2細(xì)胞中，無(wú)限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞。提取基因組后PCR的產(chǎn)物與野生型PCR產(chǎn)物混合變性退火T7E1酶切，單克隆T7E1酶切的結(jié)果如圖4-A所示。共挑取了12個(gè)單克隆，其中6個(gè)為打靶的單克隆。將打靶的單克隆細(xì)胞基因組PCR產(chǎn)物連入T載體，每個(gè)單克隆細(xì)胞挑取10個(gè)進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)分析測(cè)序結(jié)果（圖4-B）顯示，成功篩選出打靶位點(diǎn)附近基因組缺失和點(diǎn)突變的細(xì)胞克隆。

圖4 TRIM5α基因突變細(xì)胞克隆的篩選

3 討論

TRIM5α是三基序蛋白大家族的一個(gè)成員，包含4個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，即 RING 結(jié)構(gòu)域、B-box 結(jié)構(gòu)

域、coiled-coil 結(jié)構(gòu)域和PRYSPRY。它是一種環(huán)狀域E3泛素化連接酶，可以在1型人類(lèi)免疫缺陷性病毒（HIV-1）和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒入侵細(xì)胞漿時(shí)，迅速阻止病毒對(duì)細(xì)胞的感染［10］。PRYSPRY 的 C 末端是決定靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物限制反轉(zhuǎn)錄病毒的種屬特異性的區(qū)域［11，12］。小的泛素化相關(guān)的修飾蛋白（SUMO）可與細(xì)胞中的蛋白發(fā)生相互作用從而調(diào)節(jié)細(xì)胞，這種相互作用是由SUMO interacting motifs（SIMs）介導(dǎo)的。近來(lái)的研究表明，SIMs在TRIM5α基因的不同物種之間相對(duì)保守且決定了細(xì)胞能否感染某種病毒，將恒河猴TRIM5α基因的SIMs位點(diǎn)突變轉(zhuǎn)入人的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其失去了抗病毒活性［13，14］。將猴子的TRIM5α基因組中的SIMs位點(diǎn)進(jìn)行改造能否使猴子感染HIV，目前尚無(wú)這方面的研究報(bào)道。

TALE核酸酶（TALENs）是一類(lèi)能夠與靶位點(diǎn)特異性人工DNA結(jié)合域結(jié)合，形成特異性DNA損傷的人工酶。隨著基因打靶技術(shù)的快速發(fā)展，TALENs已經(jīng)成為多種生物靶基因中斷的重要工具［15］。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的TRIM5α基因組中的SIMs位點(diǎn)對(duì)病毒的限制性作用，設(shè)計(jì)了針對(duì)此位點(diǎn)的TALEN打靶質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的TALEN質(zhì)粒正確，可通過(guò)電轉(zhuǎn)高效轉(zhuǎn)入恒河猴細(xì)胞中，成功打靶TRIM5α基因。由于TRIM5α基因的功能除了具有限制HIV病毒感染的作用之外，還具有免疫調(diào)節(jié)方面的功能［16，17］，因此如何改造TRIM5α基因使其失去對(duì)HIV病毒的感染能力同時(shí)又不破壞基因其

他方面的功能是建立非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物HIV感染動(dòng)物模型的關(guān)鍵。本研究通過(guò)對(duì)SIMs位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變獲得了點(diǎn)突變的donor序列，將打靶恒河猴TRIM5α的TALEN左右臂質(zhì)粒和突變donor序列共轉(zhuǎn)染恒河猴細(xì)胞，挑單克隆細(xì)胞測(cè)序最終篩選出TRIM5α基因SIMs位點(diǎn)附近基因組缺失和點(diǎn)突變的細(xì)胞克隆。本研究利用TALEN技術(shù)成功建立了恒河猴TRIM5α基因組缺失和點(diǎn)突變的細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究TRIM5α基因?qū)IV病毒感染能力的影響及建立恒河猴HIV感染動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用TALEN打靶技術(shù)成功建立了恒河猴TRIM5α基因缺失和點(diǎn)突變的細(xì)胞克隆。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Establishment of Mutagenesis Cell Line of Macaca mulatta Gene TRIM5α by TALEN

WANG Xiao-li1，2YU Qing2YUAN Ya-hong1，2TENG Zhi-ping3LI Dong-sheng2ZENG Yi1
（1. College of Life Sciences，Beijing University of Technology，Beijing 100124；2. Life Science Institute，Affiliated Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000；3. Institute of Virology，Chinese Academy of Preventive Medicine，Beijing 100052）

Using transcription activator-like effector nuclease（TALEN）to establish the mutagenesis cell line of Macaca mulatta gene TRIM5α is to lay the foundation for further studying the function of TRIM5α gene. The TALEN plasmids targeting TRIM5α was constructed. The site-directed gene mutagenesis donor vector was obtained by site-directed gene mutagenesis technology and the sequence contained the seventh exon of TRIM5α at the position from 1 211 to 1 224. The TALEN plasmids and donor vector were co-transfected into the M. mulatta’s kidney cell line（LLC-MK2）by electroporation. The single cell line was obtained by the infinite dilution method. By extracting the genomic DNA and amplifying the target sequence by PCR，the cell line with base deletion（1 215-1 216）and site mutations（1 213-1 215，1 217）of TRIM5α was screened. Conclusively，the LLC-MK2 single cell line with knockout and site-directed gene mutagenesis of gene TRIM5α was obtained.

tripartite motif 5 alpha；TALEN；Macaca mulatta；site-directed gene mutagenesis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.010

2016-04-21

國(guó)家科技部重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX10001004-002-005）

王小莉，女，博士研究生，研究方向：腫瘤病毒學(xué)；E-mail：xiaolitina@126.com

曾毅，男，院士，研究方向：腫瘤病毒學(xué)；E-mail：zengy@public.bta.net.cn