朱巍巍李莉陳飛李楊王艷華包永明

（1. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024；2. 遼寧省微生物科學(xué)研究院，朝陽 122000）

基因組DNA去甲基化法改良蛹蟲草菌株高產(chǎn)蟲草素及性狀穩(wěn)定性評價

朱巍巍1，2李莉2陳飛2李楊2王艷華2包永明1

（1. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024；2. 遼寧省微生物科學(xué)研究院，朝陽 122000）

基因組DNA去甲基化能夠激活沉默基因，改變次級代謝產(chǎn)物譜，是一種全新的菌種改良途徑。利用不同濃度的DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷（5-azaC）處理蛹蟲草菌株CM-L1，降低基因組DNA甲基化水平，高效液相色譜篩檢得到改良株LB-C3和LD-A7，菌絲體中蟲草素含量分別提升127%和144.3%。LD-A7不能形成子實體，推測與關(guān)鍵的DNA甲基化修飾作用被改變有關(guān)。經(jīng)5次繼代培養(yǎng)后，以蟲草素含量為指標考察性狀穩(wěn)定性。隨傳代次數(shù)增加，基因組中甲基化的DNA含量增加，液體發(fā)酵菌絲體中的蟲草素含量均顯著降低，但是子實體中蟲草素含量非常穩(wěn)定，改良的菌株更適合栽培生產(chǎn)而非工業(yè)發(fā)酵。

DNA去甲基化；5-氮雜胞苷；蛹蟲草；蟲草素

蛹蟲草（Cordyceps militaris）隸屬于子囊菌亞門肉座菌目蟲草科蟲草屬，又名北蟲草、北冬蟲夏草，與冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）同屬異種［1］，二者的主要成分［2］和功效［3］存在相似性。蛹蟲草因能夠大批量的人工栽培而廣受關(guān)注，于2009年3月被衛(wèi)生部批準為新資源食品［4］。蟲草素（cordycepin）

作為蛹蟲草中最重要的活性成分之一［5］，早在1964年即有文獻記錄［6］，生物活性的研究方向集中在抑菌、體外抗腫瘤、保護肝腎系統(tǒng)［7］和增強免疫力［8］作用。雖然蛹蟲草已實現(xiàn)規(guī)模化栽培，但蟲草素的單位產(chǎn)量仍然很低［9］，穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)蟲草素菌株是蛹蟲草育種的追尋目標。

高產(chǎn)菌株的誘變和改良多采用物理、化學(xué)手段誘導(dǎo)菌株形成點突變累積或增加相關(guān)基因豐度，再篩選正向突變菌株，如離子束誘變［10］、復(fù)合誘變［11］、原生質(zhì)體融合［12］等。表觀遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展把非DNA序列改變的育種策略帶入視野［13］，通過改變基因組DNA甲基化水平對基因表達進行調(diào)控，是一種激活真菌沉默的次級代謝生物合成基因的有效手段。Williams等［14］采用5-氮雜胞苷（5-azaC）、5-氮雜-2-脫氧胞苷、普魯卡因等DNA甲基化酶抑制劑對12種真菌進行遺傳選育獲得了新的代謝產(chǎn)物，且已知代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也有所提升，但是對大型真菌基因組去甲基化育種未見報道。本研究使用DNA甲基化酶抑制劑5-azaC處理蛹蟲草菌株，降低基因組DNA甲基化水平釋放相關(guān)基因高表達以提升蟲草素產(chǎn)量，旨為構(gòu)造高產(chǎn)菌株提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與培養(yǎng)基 蛹蟲草菌株CM-L1分離自遼西地區(qū)人工栽培蛹蟲草。CPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g煮沸取濾液，葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏1.0 g，KH2PO41.0 g，K2HPO40.5 g，瓊脂16.0 g，水1 000 mL，pH值自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，葡萄糖5.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，KH2PO41.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，VB1 10.0 mg，水1 000 mL，pH值自然。

麥粒蟲草瓶：550 mL培養(yǎng)瓶加小麥麥粒30.0 g，水50 mL，1% KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，121℃滅菌30 min。

1.1.2 試劑與儀器設(shè)備 SPX-450型生化培養(yǎng)箱（中儀國科）；KQ-50DA型數(shù)控超聲儀（昆山超聲）；SPH-2012生化搖床（上海世平）；LHH.CP-505-Q大型人工氣候箱（上海印溪）；3K15高速冷凍離心機（SIGMA，德國）；Waters e2695 高效液相色譜（Waters，美國）；Waters 2489紫外檢測器（Waters，美國）；Multiskan GO 全波長酶標儀（ThermoFisher，美國）；DYY-6型電泳儀（北京六一）等。

真菌基因組DNA提取試劑盒（#GD2416-01，BIOMIGA）；比色法DNA甲基化定量試劑盒（#P-1034，EPIGENTEK），檢測限0.2 ng甲基化DNA。

蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、5-azaC、二甲基亞砜均為國產(chǎn)分析純，VB1為國產(chǎn)生化試劑，色譜純甲醇（#A456-4，Thermo Fisher），蟲草素標準品購自中國食品藥品檢定研究院（#110858），純度以95.5%計。

1.2 方法

1.2.1 菌株處理 5-azaC用二甲基亞砜預(yù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，加入無菌水配制成10.0 μmol/L溶液，以2倍梯度逐級稀釋成5.0、2.5、1.25、0.63、0.31及0.16 μmol/L溶液，每濃度取100 μL均勻涂布平皿后接種菌塊，根據(jù)菌絲生長抑制情況測定最小抑菌濃度（MIC）。

使用90 mm平皿制作同心環(huán)誘變平板［15］，中心環(huán)使用CPDA培養(yǎng)基，外環(huán)使用混入5-azaC的CPDA鋪制，終濃度分別為0.01×MIC、0.1×MIC、0.5×MIC、MIC，CM-L1菌株接種后置培養(yǎng)箱中20℃暗培養(yǎng)。高濃度抑制明顯區(qū)域在菌絲生長點取樣，低濃度無明顯抑制區(qū)域隨機取樣進行篩檢，按取樣位置5-azaC的濃度由低到高順序編號LA-##、LB-##、LC-##、LD-##予以區(qū)分。

取直徑2-4 mm接種塊回接CPDA平皿，20℃暗培養(yǎng)至菌絲長滿。刮取菌絲液氮研磨破碎，稱取100.0 mg菌粉加入1 mL 純水超聲浸提30 min，10 000 r/min離心10 min 取上清進行液相色譜分析。

1.2.2 蟲草素定量 高效液相色譜法檢測蟲草素含量［16］，色譜柱Symmetry C18（3.9×150 mm），柱溫30℃，流動相甲醇∶水（15∶85，V/V），上樣量5 μL，流速1 mL/min，紫外檢測波長260 nm。

液體發(fā)酵采用500 mL三角瓶加入150 mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速150 r/min，20℃避光培養(yǎng)［17］，每日測定生物量及菌絲體中蟲草素含量，確定菌絲體中蟲草素含量檢測時間點。

菌絲體60℃烘干至恒重，研磨破碎，取100.0

mg加入1 mL 純水超聲浸提50 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾后進行液相色譜分析。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。

子實體60℃烘干研磨破碎，取樣品1.0 g加入25 mL純水超聲浸提50 min，10 000 r/min離心10 min，取上清定容至100 mL，0.22 μm濾膜過濾進行液相色譜分析。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 子實體形成能力驗證 待驗證菌株接種至麥粒蟲草瓶，每株接種6瓶，20℃暗培養(yǎng)至菌絲長透，相對濕度65%-70%。轉(zhuǎn)色期光照強度200-300 lx，培養(yǎng)溫度20℃，每日給予12℃低溫刺激6 h，相對濕度70%-75%。原基形成后光照強度100-200 lx，培養(yǎng)溫度18℃，相對濕度85%-90%。

1.2.4 性狀穩(wěn)定性研究 菌株分別接種CPDA試管（20×200 mm）斜面，20℃暗培養(yǎng)12 d后轉(zhuǎn)管繼代，連續(xù)傳代5次，考察各代次液體發(fā)酵菌絲體及子實體中蟲草素的含量，以蟲草素含量變化為指標評價該性狀穩(wěn)定性，采用SPSS軟件進行顯著性差異分析。

使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取gDNA，電泳檢測完整性，測定OD值檢測純度及含量，使用DNA甲基化定量試劑盒跟蹤檢測甲基化水平。

2 結(jié)果

2.1 篩檢結(jié)果統(tǒng)計

5-azaC 對菌株CM-L1菌絲的MIC為2.5 μmol/L，實驗共挑取5-azaC處理樣本207株，經(jīng)高效液相色譜篩檢，其中蟲草素含量增加10%-50%的正突變株43株，增加50%-100%的正突變株8株，增加一倍以上的正突變株有2株，LB-C3和LD-A7（圖1）。蟲草素含量減少10%以上的負突變株14株，未發(fā)現(xiàn)含量減少50%以上的負突變株。蟲草素含量提升50%以上菌株篩檢統(tǒng)計結(jié)果，見表1。

圖1 蟲草素高產(chǎn)菌株液相色譜篩檢圖

表1 蟲草素含量提升＞50%的菌株篩檢結(jié)果

2.2 子實體形成能力驗證

LB-C3、LD-A7和CM-L1接種至麥粒瓶平行培養(yǎng)，45 d后CM-L1和LB-C3子實體發(fā)育正常，長勢同步；LD-A7僅見菌絲轉(zhuǎn)色，無子實體分化（圖2），繼續(xù)培養(yǎng)至60 d后菌絲老化滲液，終止培養(yǎng)。

圖2 蟲草子實體結(jié)實性驗證

2.3 性狀穩(wěn)定性評價

基因組DNA甲基化水平定義為5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）在基因組中所占百分比。出發(fā)菌株CM-L1基因組甲基化水平在3次繼代培養(yǎng)情況下相對穩(wěn)定，但是繼續(xù)傳代會導(dǎo)致甲基化DNA增加，經(jīng)5-azaC處理后基因組DNA甲基化水平下降，而當環(huán)境中的5-azaC消失后，LB-C3和LD-A7的基因組DNA甲基化水平隨繼代培養(yǎng)逐步恢復(fù)（圖3）。

圖3 繼代培養(yǎng)后基因組DNA甲基化含量變化

蛹蟲草液體發(fā)酵過程中，蟲草素累積過程與生物量變化曲線趨于一致，二者幾乎同時進入平臺期

（圖4）。LD-A7進入對數(shù)生長期的速度滯后，且最終菌絲生物量也偏低。三株菌10 d均進入平臺期，蟲草素含量與最終測定值接近，故菌株遺傳穩(wěn)定性考察設(shè)第10天采樣。

圖4 液體發(fā)酵過程中生物量（A）及蟲草素含量（B）變化曲線

連續(xù)繼代培養(yǎng)5次后，不同傳代次數(shù)菌株液體發(fā)酵法菌絲體中蟲草素含量出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。出發(fā)菌株CM-L1同樣存在蟲草素產(chǎn)量下降的問題，5-azaC處理株繼代培養(yǎng)3次后顯著下降（圖5），但是蟲草素含量仍較出發(fā)菌株增加一倍以上。

圖5 繼代培養(yǎng)次數(shù)對菌絲體中蟲草素含量的影響

平行栽培試驗測定子實體中蟲草素含量，結(jié)果顯示各代次之間蟲草素含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且同一代次間各樣本的離散程度也比較低（圖6）。蟲草子實體的狀態(tài)比較穩(wěn)定，子實體生物學(xué)效率均可達到90%（P＞0.05），即每栽培瓶30 g干麥粒均可收獲新鮮蟲草子實體27 g以上。

圖6 繼代培養(yǎng)次數(shù)對子實體中蟲草素含量的影響

3 討論

DNA甲基化是真核生物中非常重要的一種表觀遺傳學(xué)標記，雖然不改變基因的序列，卻能調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，對基因的表達起到促進或抑制的作用［18］。

5-azaC與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）具有很強的結(jié)合力，競爭性抑制DNMT活性，能夠改變生物體基因組的甲基化狀態(tài)，從而改變次級代謝產(chǎn)物譜。蟲草素在蛹蟲草中的生物合成途徑尚不明確，但是通過基因組DNA去甲基化手段改良菌株很容易獲得高產(chǎn)株，使用5-azaC處理后改良株的正突變率達到25.6%，其中 LB-C3和LD-A7的菌絲體中蟲草素含量較出發(fā)菌株CM-L1分別提升127%和144.3%。雖然基因組DNA甲基化水平與蟲草素含量存在關(guān)聯(lián)，但二者并未呈現(xiàn)負相關(guān)性。LD-A7菌株子實體發(fā)育異常推測與基因組DNA甲基化修飾作用被改變有關(guān)，具體原因尚待進一步研究。除了目的物蟲草素含量發(fā)生變化外，高效液相色譜檢測到某些未知組分也發(fā)生了變化，這些變化的未知組分可能會成為功能性研究的寶藏。

如何以DNA甲基化作為契入點在基因組水平上標記、識別、控制優(yōu)勢性狀，如何保持目標性狀的穩(wěn)定性，仍然是育種工作的難點［19］。性狀穩(wěn)定性受多因素共同調(diào)控，除了DNA序列的影響外，表觀遺傳修飾在環(huán)境與性狀之間建立起紐帶，即生物體對環(huán)境的適應(yīng)和調(diào)整可以通過DNA甲基化形式記錄在基因組中遺傳下去［20］。無論是出發(fā)菌株還是改良株，在限定的培養(yǎng)條件下，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)增加基因組中甲基化的DNA都呈增加趨勢，說明有自發(fā)甲基化不斷形成，同時菌絲體蟲草素含量降低，改良株尤其明顯。繼代培養(yǎng)對子實體中蟲草素含量變化影響很小，可能是因為子實體發(fā)育階段依靠基內(nèi)菌絲傳遞營養(yǎng)物質(zhì)維持生長，子實體并不直接參與，且固體培養(yǎng)基不具備流動性降低菌絲個體與環(huán)境交換的速率，有助于保持穩(wěn)定；而菌絲體液體發(fā)酵過程中，每個菌絲體都持續(xù)與環(huán)境發(fā)生物質(zhì)、能量交換，個體間基因組DNA甲基化水平分歧度比較高，具體表現(xiàn)為同一發(fā)酵批次樣品離散度高和各發(fā)酵批次間的產(chǎn)量不穩(wěn)定。5-azaC處理得到的高產(chǎn)菌株雖然在液體發(fā)酵過程性狀穩(wěn)定性有欠缺，但是較高的正突變率和相對穩(wěn)定的子實體特性能夠彌補這種缺憾。

4 結(jié)論

使用DNA甲基化酶抑制劑5-azaC處理蛹蟲草菌株，降低基因組中DNA甲基化水平以提升蟲草素含量，正突變率較高，但是對蛹蟲草子實體的形成存在影響。連續(xù)繼代培養(yǎng)后液體發(fā)酵菌絲體中的蟲草素含量顯著降低，子實體中蟲草素含量非常穩(wěn)定，經(jīng)改良的菌株更適合栽培生產(chǎn)而非工業(yè)發(fā)酵。

［1］黃年來, 林志彬, 陳國良, 等. 中國食藥用菌學(xué)［M］. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社, 2010：1763.

［2］王志兵, 張洪玉, 劉洋, 等. 基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法同時測定冬蟲夏草和蛹蟲草中的9種核苷及堿基［J］. 食品工業(yè)科技, 2014, 35（4）：83-87.

［3］王曉彤, 孫淑軍, 房軍偉. 簡述蛹蟲草與冬蟲夏草異同［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2014（4）：165-169.

［4］ 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 衛(wèi)生部關(guān)于批準蛹蟲草為新資源食品的公告（2009年第3號）［Z/OL］. http:// www.moh.gov.cn/zhuzhan/gonggao/201304/e44ed1e230a244528faf8 181fc5c0b1c.shtml, 2009-03-18.

［5］ 劉桂君, 周思靜, 楊素玲, 等. 蛹蟲草中蟲草素的研究進展［J］.食品科學(xué), 2013, 34（21）：408-413.

［6］ Kaczka EA, Trenner NR, Arison B, et al. Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’-deoxyadenosine［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1964, 14：456-457.

［7］曾宏彬, 宋斌, 李泰輝. 蛹蟲草研究進展及其產(chǎn)業(yè)化前景［J］.食用菌學(xué)報, 2011, 18（2）：70-74.

［8］Zhu SJ, Pan J, Zhao B, et al. Comparisons on enhancing the immunity of fresh and dry Cordyceps militaris in vivo and in vitro［J］. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 149（3）：713-719.

［9］楊濤, 董彩虹. 蟲草素的研究開發(fā)現(xiàn)狀與思考［J］. 菌物學(xué)報, 2011, 30（2）：180-190.

［10］Das SK, Masuda M, Hatashita M, et al. A new approach for improving cordycepin productivity in surface liquid culture of Cordyceps militaris using high-energy ion beam irradiation［J］. Letters in Applied Microbiology, 2009, 47（6）：534-538.

［11］孟澤彬, 文庭池, 康冀川, 等. 蛹蟲草高產(chǎn)胞外蟲草素和蟲草多糖的誘變育種［J］. 中國釀造, 2012, 31（7）：57-61.

［12］周洪英, 邊銀丙. 蛹蟲草蟲草素高產(chǎn)原生質(zhì)體融合子鑒定與篩選［J］. 食用菌學(xué)報, 2007, 14（2）：65-70.

［13］趙文婷, 鄒懿, 胡昌華. 微生物菌種改良的新方法新策略［J］.生物工程學(xué)報, 2009, 25（6）：801-805.

［14］Williams RB, Henrikson JC, Hoover AR, et al. Epigenetic remodeling of the fungal secondary metabolome. ［J］. Organic & Biomolecular Chemistry, 2008, 6（11）：1895-1897.

［15］朱巍巍, 李莉, 池景良, 等. 一種大型真菌去甲基化育種方法及裝置：中國, ZL 2013 1 0377815. 7［P］. 2015-04-01.

［16］黃麗俊, 李利東, 宓曉黎. 高效液相色譜法同時檢測蟲草制品中腺苷和蟲草素含量的研究［J］. 農(nóng)學(xué)學(xué)報, 2015（5）：25-28.

［17］羅巍, 劉東波, 吳鄭武, 等. 蛹蟲草液態(tài)發(fā)酵過程中有效成分的動態(tài)積累變化［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37（10）：96-99.

［18］ 王瑞嫻, 徐建紅. 基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化［J］.遺傳, 2014, 36（3）：191-199.

［19］徐青, 余云舟, 趙萌, 等. DNA甲基化在動植物遺傳育種中的研究進展［J］. 生物技術(shù)通訊, 2011, 22（1）：113-117.

［20］Zhang TY, Meaney MJ. Epigenetics and the environmental regulation of the genome and its function［J］. Annual Review of Psychology, 2010, 61（1）：439-466.

（責任編輯 馬鑫）

Enhanced Cordycepin Production of Cordyceps militaris by Genomic DNA Demethylation and the Evaluation of Its Stability

ZHU Wei-wei1，2LI Li2CHEN Fei2LI Yang2WANG Yan-hua2BAO Yong-ming1
（1. School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024；2. Liaoning Research Institute of Microbiology，Chaoyang 122000）

Genomic DNA demethylation may activate silenced gene，which alters secondary metabolite spectrum，and therefore it is a completely novel approach for strain improvement. Using different concentrations of DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine（5-azaC）to treat the Cordyceps militaris CM-L1，then the genomic DNA methylation level reduced. Further，the improved strains LB-C3 and LD-A7 were acquired by screening with high performance liquid chromatography，and in which the contents of cordycepin in mycelium increased by 127% and 144.3% respectively. LD-A7 could not form a fruiting body，which was speculated to be related to the role of DNA methylation changed. The stability was investigated after 5 times subculture using the content of cordycepin as an indicator. With the subculture times increased，the methylated DNA in the genome increased，and the cordycepin in mycelium of liquid fermentation significantly decreased；however，the content of cordycepin in fruiting bodies was very stable，indicating that improved strains were better suited to the cultivation rather than production in industrial fermentation.

DNA demethylation；5-azaC；Cordyceps militaris；Cordycepin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.009

2016-04-11

遼寧省農(nóng)業(yè)公關(guān)及產(chǎn)業(yè)化項目（2015209002），遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重點培養(yǎng)青年人才項目（2014034）

朱巍巍，男，博士研究生，研究方向：食用菌育種及標準化栽培；E-mail：zhuweiwei@vip.163.com

包永明，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：蛋白質(zhì)及酶工程、生物催化與轉(zhuǎn)化、藥物化學(xué)及藥理；E-mail：biosci@dlut.edu.cn