何菲，樊春華，郭珮，王弘凱，周宏宇，陳益，李晉芳，冉建華*

（重慶醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，2神經(jīng)科學(xué)研究中心，3附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016）

論 著

PKCβ／p66Shc介導(dǎo)高尿素引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生

何菲1，2，樊春華1，2，郭珮1，2，王弘凱1，2，周宏宇1，2，陳益1，2，李晉芳3，冉建華1，2*

（重慶醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，2神經(jīng)科學(xué)研究中心，3附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016）

目的 探討PKCβ／p66Shc通路在高濃度尿素引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生中的作用。方法 體外培養(yǎng)HUVECs，分為正常對照組、甘露醇組、尿素組和尿素＋LY333531（PKCβ抑制劑）組。采用CCK8法檢測高濃度尿素對細(xì)胞活性的影響，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量；Western blot檢測細(xì)胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平；免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)p-p66Shc水平。結(jié)果 25mmol／L尿素明顯抑制HUVECs活力，并引起細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙增大、鋪路石樣排列結(jié)構(gòu)受到破壞等形態(tài)學(xué)改變。與對照組相比，25mmol／L尿素引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，在6h達(dá)到峰值；加入PKCβ抑制劑LY333531后ROS水平明顯降低。Western blot結(jié)果顯示，25mmol／L尿素誘導(dǎo)p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平隨作用時間的延長而逐漸增加。25mmol／L尿素負(fù)荷6h后可見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)p-p66Shc免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)，LY333531可阻斷該作用；Western blot檢測也顯示LY333531可顯著抑制高濃度尿素對p-p66Shc水平的上調(diào)。結(jié)論 PKCβ／p66Shc信號通路是高濃度尿素誘導(dǎo)HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生的重要途徑。

尿素；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；PKCβ／p66Shc；活性氧簇

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）患者最常見的并發(fā)癥和最主要的死亡原因，其致死率比其他并發(fā)癥高10～20倍［1］；而ESRD并發(fā)CVD中以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）多見。與普通人群不同，ESRD患者并發(fā)AS具有發(fā)病率高、發(fā)病年齡早、病變累及廣等特點(diǎn)，并以氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為主要病理改變，但目前的病理機(jī)制尚不清楚。近年來的研究證實(shí)，高濃度尿素可誘導(dǎo)多種細(xì)胞中活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的大量產(chǎn)生，造成蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化及DNA損傷，是導(dǎo)致慢性腎衰竭氧化應(yīng)激（oxidative stress）、胰島素抵抗等多種病理改變的重要致病因素［2，3］。我們前期研究也證實(shí)了高濃度尿素誘導(dǎo)人腦內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生［4］。眾所周知，氧化應(yīng)激可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而ROS產(chǎn)生過多是導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生的主要因素。那么，ESRD患者體內(nèi)的高尿素水平是否通過 ROS大量產(chǎn)生介導(dǎo)血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激及后續(xù)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其具體機(jī)制如何都不清楚。p66Shc是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，磷酸化的p66Shc通過轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮重要作用［5-8］。研究報(bào)道，高血糖、高血脂、高濃度酒精等可通過激活PKCβ，進(jìn)而導(dǎo)致p66Shc蛋白磷酸化及其線粒體轉(zhuǎn)位，引起ROS過量產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的發(fā)生［9-11］。目前PKCβ／p66Shc通路在高濃度尿素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究采用高濃度尿素負(fù)荷HUVECs細(xì)胞，觀察細(xì)胞活性、形態(tài)的改變以及ROS的產(chǎn)生，檢測PKCβ／p66Shc通路在ROS產(chǎn)生過程中的改變，為闡明ESRD患者并發(fā)AS的病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Excell公司）；1640培養(yǎng)基（Gbico公司）；胰酶細(xì)胞消化液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；青-鏈霉素溶液（100 X）（碧云天公司）；DMSO、甘露醇（Sigma公司）；尿素（Solaibao生物技術(shù)公司）；活性氧測定試劑盒（貝博生物有限公司）；RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Milipore公司）；PVDF膜（Milipore公司）；β-actin抗體（博士德公司）；p66Shc和p-p66Shc抗體（Santa公司）；PKCβ和 p-PKCβ抗體（abcam公司）；PKCβ抑制劑LY333531（Santa公司）；Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG（H＋L）（碧云天公司）；辣根過氧化物酶二抗（Santa公司）。

2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng)

HUVECs復(fù)蘇后，加入含10%FBS和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在孵育箱中以37℃、5% CO2的飽和濕度進(jìn)行培養(yǎng)。每兩天換液一次，待其達(dá)對數(shù)生長期時，以胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)或進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)分組。

3 尿素對細(xì)胞活性影響的CCK8檢測

取對數(shù)期的HUVECs經(jīng)胰酶消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)后制成細(xì)胞懸液（約1×105個／ml），種于96孔板中，每孔加入含10%FBS的培養(yǎng)液0.1ml，放入37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、100、200mmol／L）的尿素，每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中孵育24h。然后向每個孔中加入10μl CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h后，用酶標(biāo)儀測定其在450nm（A450值）的吸光度值。用下列公式計(jì)算 HUVECs細(xì)胞活力抑制率（IR）∶IR（%）＝［（對照組A值實(shí)驗(yàn)組A值）／（對照組A值-空白組A值）］×100%。

4 活性氧測定

以25mmol／L尿素在不同時間點(diǎn)干預(yù)HUVECs后，按照ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用DCFH-DA探針孵育30min后用0.01mol／L的PBS洗3次，再置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。鏡下的熒光強(qiáng)度越高代表ROS的產(chǎn)生越多，反之則越少。

5 免疫熒光技術(shù)檢測p-p66Shc的表達(dá)

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)后，待細(xì)胞增殖至70%～80%后，用胰蛋白酶消化并制成細(xì)胞懸液，然后接種于12孔板的蓋玻片上，培養(yǎng)24h后進(jìn)行分組。進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)后用0.01mol／L的PBS洗3次，每次5min，4%多聚甲醛37℃固定30min，然后用0.01mol／L的PBS洗3次，每次5min；加入0.2%Triton X-100室溫孵育15min，PBS洗滌后，加入含10%的馬血清于37℃封閉30min。然后加入一抗（陰性對照以PBS代替一抗），4℃過夜。第2天用PBS洗3次，每次10min，然后避光滴加熒光二抗（1∶200）于37℃孵育1h。DAPI染核5min后PBS洗3次，每次10min，用防猝滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。

6 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平

培養(yǎng)的HUVEC按實(shí)驗(yàn)要求干預(yù)后收集細(xì)胞。加細(xì)胞裂解液冰上裂解30min，4℃低溫離心機(jī)、12000r／min離心20min后，上清即為細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。以10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳進(jìn)行蛋白分離，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，于37℃用5%BSA封閉2h，加入一抗（均為1∶1000），4℃孵育過夜。次日TBST洗膜3次，每次15min，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠抗體 IgG（1∶10000）37℃雜交1h，TBST洗膜3次，每次20min；ECL顯色液顯色，Image Lab Tool機(jī)器曝光。Image Lab Tool分析軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件系統(tǒng)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié)　果

1 高濃度尿素抑制HUVECs活力

為了明確尿素對細(xì)胞活力的影響，應(yīng)用CCK-8法檢測不同濃度尿素負(fù)荷24h后細(xì)胞抑制率。結(jié)果顯示，細(xì)胞的抑制率隨尿素濃度的升高呈逐漸上升的趨勢，25mmol／L及更高濃度的尿素對細(xì)胞的活性有明顯的抑制作用（圖1）。

圖1　不同濃度的尿素負(fù)荷對　HUVECs活力的影響；*，與0mmol／L組相比，0.01＜P＜0.05（n＝3）Fig.1　Effects of different concentrations of urea on HUVECs viability；*，0.01＜P＜0.05，compared with the 0 mmol／L group（n＝3）

2 高濃度尿素負(fù)荷對HUVECs形態(tài)的影響

為了明確25mmol／L尿素是否引起HUVECs形態(tài)的變化，用倒置顯微鏡觀察25mmol／L負(fù)荷 24h對HUVECs形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，未負(fù)荷尿素的HUVECs為短梭形或小三角形，單層貼壁生長，呈鋪路石樣鑲嵌排列（圖2A）。以25mmol／L尿素負(fù)荷24h后，細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞體積變小，排列較為紊亂，典型的鋪路石樣鑲嵌排列方式消失（圖2B）。

3 高濃度尿素誘導(dǎo)HUVECs中ROS的產(chǎn)生

為了明確25mmol／L尿素負(fù)荷 HUVECs后可通過產(chǎn)生ROS來引起細(xì)胞損傷，用熒光倒置顯微鏡觀察25mmol／L尿素負(fù)荷HUVECs 0h、1h、3h和12h后ROS產(chǎn)生情況。以甘露醇組（25mmol／L）作為滲透壓對照，以排除滲透壓對ROS產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，12h內(nèi)甘露醇組中均未見綠色熒光表達(dá)，排除了滲透壓的改變會引起ROS的產(chǎn)生；尿素負(fù)荷HUVECs細(xì)胞1h后，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增加，并隨時間延長而增高，在6h熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值（圖3）。

4 PKCβ抑制劑減少高濃度尿素誘導(dǎo)的HUVECs中ROS的產(chǎn)生

為了驗(yàn)證HUVECs中PKCβ是否參與尿素誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，應(yīng)用PKCβ抑制劑LY333531（10μmol／L）預(yù)培養(yǎng)HUVECs 2h后，再負(fù)荷尿素6h，用DCFH-DA方法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的改變。熒光倒置顯微鏡可見，與對照組相比，負(fù)荷尿素的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度較未負(fù)荷尿素的對照細(xì)胞明顯增強(qiáng)，而用LY333531預(yù)孵育再負(fù)荷尿素的細(xì)胞，其綠色熒光強(qiáng)度明顯低于單純尿素負(fù)荷細(xì)胞，但仍高于未負(fù)荷尿素的對照細(xì)胞（圖4）。

5 高濃度尿素激活PKCβ／p66Shc信號通路

為了證明高濃度尿素是否激活PKCβ／p66Shc信號通路，應(yīng)用Western blot檢測了25mmol／L尿素負(fù)荷HUVECs、0h、3h、6h、12h、24h后 PKCβ、p-PKCβ、p66Shc和p-p66Shc水平的變化。結(jié)果顯示，隨著尿素負(fù)荷HUVECs的時間延長，p66Shc、pp66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平均呈逐漸上升趨勢（圖5），提示高濃度尿素可激活PKCβ／p66Shc信號通路。

6 LY333531抑制高濃度尿素對HUVECs中pp66Shc水平的上調(diào)

為了進(jìn)一步明確PKCβ是否為p66Shc的上游信號分子，用免疫熒光染色和Western blot檢測了LY333531是否阻斷25mmol／L尿素負(fù)荷上調(diào)HUVECs內(nèi)p-p66Shc的作用。免疫熒光檢測顯示，HUVECs負(fù)荷25mmol／L尿素6h后，p-p66Shc免疫反應(yīng)性（綠色熒光強(qiáng)度）明顯增強(qiáng)，即p66Shc磷酸化水平明顯升高（圖6A）；而用LY333531預(yù)孵育后的HUVECs內(nèi)p-p66Shc免疫反應(yīng)性在負(fù)荷尿素后不再明顯增強(qiáng)（圖6A）。Western blot檢測顯示，加入LY333531預(yù)孵育的HUVECs內(nèi)p-p66Shc水平明顯低于未用LY333531預(yù)孵育的HUVECs（圖6B）。由此表明，PKCβ抑制劑可顯著抑制高濃度尿素誘導(dǎo)的HUVECs中p66Shc蛋白的磷酸化水平上調(diào)，提示PKCβ是P66shc的上游信號分子。

圖2　尿素負(fù)荷前后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)。A，正常的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；B，尿素負(fù)荷24h后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；比例尺，100μmFig.2　Morphology of HUVECs before and after urea loading.A，normal HUVECs；B，HUVECs after 24h urea loading；scale bar，100 μm

圖3　高濃度尿素誘導(dǎo)HUVECs ROS的產(chǎn)生。A，尿素和甘露醇負(fù)荷HUVECs后ROS產(chǎn)生的變化；比例尺，100μm；B，相對熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與0h組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n＝3Fig.3　ROS produced in HUVECs induced by high concentration urea.A，change of ROS production in HUVECs after urea treatment and mannitol treatment.Scale bar，100 μm；B，statistical analysis of the relative fluorescence intensity；compared with the 0h group；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n＝3

圖4　PKCβ抑制劑對尿素誘導(dǎo)HUVECs ROS產(chǎn)生的影響。A，DCFH-DA法檢測HUVECs中ROS；比例尺，100μm；B，DCFH-DA法檢測HUVECs中ROS的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對照組相比：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；＃，與尿素組比較，0.01＜P＜0.05；n＝3Fig.4　Effect of PKCβ inhibitor on ROS production induced by urea in HUVECs.A，DCFH-DA detection of ROS production in HUVECs，scale bar，100 μm；B，statistical analysis of ROS production detected by DCFH-DA in HUVECs；compared with the control group：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；＃，compared with the urea group，0.01＜P＜0.05；n＝3

圖5　高濃度尿素對 HUVECs中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平的影響。A，p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ的Western blot檢測；B，p66Shc／p-p66Shc和PKCβ／p-PKCβ Western blot檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與0h組相比：*，0.01＜P＜0.05；n＝3Fig.5　Effect of high concentration urea on the levels of p66Shc，p-p66Shc，PKCβ and p-PKCβ in HUVECs.A，Western blot detection of p66Shc，pp66Shc，PKC and p-PKC；B，statistical analysis of p66Shc／p-p66Shc；C，statistical analysis of PKCβ／p-PKCβ；*，0.01＜P＜0.05，compared with the 0h group；n＝3

圖6　PKCβ抑制劑對高濃尿素上調(diào)HUVECs中p-p66Shc水平作用的影響；A，HUVECs中p-p66Shc水平的免疫熒光檢測；比例尺，50 μm；B，HUVECs中p-p66Shc水平的 Western blot檢測；*，與尿素組相比：0.01＜P＜0.05；n＝3Fig.6　Effect of PKCβ inhibitor on urea-induced up-regulation of p-p66Shc level in HUVECs.A，immunofluorescent detection of the level of p-p66Shc in HUVECs；scale bar，50 μm；B，Western blot detection of the level of p-p66Shc in HUVECs；*，0.01＜P＜0.05，compared with the urea group；n＝3

討　論

尿素是體內(nèi)氮質(zhì)潴留的主要形式。盡管尿素本身相對無毒，但目前的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的尿素可引發(fā)ROS大量產(chǎn)生，通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致腎髓質(zhì)細(xì)胞損傷、胰島素抵抗等多種病理改變的發(fā)生［12］。正常人體內(nèi)尿素水平約為 5mmol／L，而ESRD患者血漿尿素水平可升至80mmol／l；心血管系統(tǒng)作為尿素運(yùn)輸?shù)闹饕緩?，高濃度的尿素可能直接作用于血管?nèi)皮，引起細(xì)胞損傷而觸發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn)，25mmol／L尿素能明顯的抑制HUVECs活力，并可引起細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大、排列紊亂等形態(tài)學(xué)改變，證實(shí)了高濃度尿素卻可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

活性氧是指含有氧分子的自由基，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、烷氧基和O2衍生的原子種類。生理?xiàng)l件下的活性氧作為重要的信號分子參與了體內(nèi)多種生理活動的調(diào)控；而異常堆積的ROS可能會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和DNA的損傷，引起細(xì)胞或組織的損傷［13］。本研究中，對照組和25mmol／L甘露醇組未見ROS產(chǎn)生，采用甘露醇組作對照排除了滲透壓改變引起ROS產(chǎn)生的可能；25mmol／L尿素引起HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨時間延長明顯升高，6 h達(dá)到峰值，但12 h仍高于對照組，這可能與后期線粒體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的激活有關(guān)，與臨床報(bào)道ESRD患者體內(nèi)ROS水平的結(jié)果相符［14］。因此，高濃度尿素誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的機(jī)制是值得探討的問題。

線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所。在高血糖、腫瘤等不同病理因素刺激下，p66Shc（銜接蛋白SHC的一個亞型）在ROS產(chǎn)生過程中具有關(guān)鍵作用，其通過S36位點(diǎn)的磷酸化引起蛋白由胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入線粒體，氧化細(xì)胞色素C而誘導(dǎo)ROS大量產(chǎn)生及氧化應(yīng)激的發(fā)生。本研究采用25mmol／L尿素負(fù)荷 HUVECs后，出現(xiàn)胞漿內(nèi)p66Shc的磷酸化表達(dá)上調(diào)，提示高濃度尿素可能通過p66Shc引起線粒體ROS的產(chǎn)生。

蛋白激酶C（PKC）作為一種鈣磷脂依賴性磷酸化酶，是應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞生理功能的主要調(diào)節(jié)器，其因同工酶結(jié)構(gòu)、特性以及激活劑的不同大致分為4類，PKCβ是其中的一個亞型。PKCβ作為p66Shc上游的信號分子在多種病理生理過程中發(fā)揮作用。氧化型低密度脂蛋白可通過PKCβ激活p66Shc促進(jìn)內(nèi)皮的吸收，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生［15］。在小腸缺血再灌注損傷中，PKCβ抑制劑LY333531可抑制p66Shc的磷酸化以及隨后的線粒體易位氧化細(xì)胞色素C等病理過程，從而緩解缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［16］，而PKCβ／p66Shc信號通路在高濃度尿素引起HUVECs損傷的過程中的作用還未見報(bào)道。本研究PKCβ抑制劑LY333531可明顯阻斷高濃度尿素上調(diào)HUVECs內(nèi)p66Shc磷酸化水平的作用，提示PKCβ是p66Shc的上游信號分子，調(diào)控其表達(dá)水平及磷酸化過程可影響尿素誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。

我們的研究表明，高濃度尿素可能通過激活PKCβ，增加p66Shc蛋白水平及磷酸化水平，經(jīng)p66Shc線粒體轉(zhuǎn)位而誘導(dǎo)ROS的大量產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的發(fā)生，引起HUVECs細(xì)胞損傷。而高濃度尿素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否引起后續(xù)的炎癥反應(yīng)及其機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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《中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志》2017年度征訂啟事

《中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志》（Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry）是由中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會主管，中國解剖學(xué)會和華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院主辦，中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志編輯委員會編輯出版，國內(nèi)外公開發(fā)行的國家級刊物。國際標(biāo)準(zhǔn)刊號為ISSN1004-1850，國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)刊號為CN42-1300／Q。本刊為中國科技論文統(tǒng)計(jì)源（核心）期刊、中國生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫收錄期刊，全文入編《中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫》（CSCD）、中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫、美國《化學(xué)文摘》（CA）。

本刊涵蓋領(lǐng)域?yàn)椋簯?yīng)用組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)、酶組織化學(xué)、免疫熒光組織化學(xué)、超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞化學(xué)、放射自顯影、原位雜交組織化學(xué)、體視學(xué)及圖像分析等形態(tài)學(xué)相關(guān)技術(shù)、細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行基礎(chǔ)及臨床研究的相關(guān)論著?？茄芯糠秶ǖ幌薅ㄓ诩?xì)胞、組織、器官的形態(tài)及功能研究；炎癥、腫瘤、遺傳性疾病的病理改變及相關(guān)機(jī)制探討；感染性疾病的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)；免疫細(xì)胞治療、干細(xì)胞治療、腫瘤疫苗等生物學(xué)治療的相關(guān)研究。本刊辟有＂論著＂、＂綜述＂、＂研究通訊＂、＂新技術(shù)交流＂、＂教學(xué)改革＂等欄目，將會及時報(bào)道基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及其他生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的最新研究成果。

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《中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志》編輯部2016年10月

PKCβ／p66Shc pathway mediates the production of ROS induced by high concentration urea in human umbilical vein endothelial cells

He Fei1,2,Fan Chunhua1,2,Guo Pei1,2,Wang Hongkai1,2,Zhou Hongyu1,2,Chen Yi1,2,Li Jinfang3,Ran Jianhua1,2*
（1Department of Anatomy，College of Basic Medicine，2Neuroscience Research Center，3Department of Neurology，the 2nd Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing，400016，China）

Objective To investigate the role of PKCβ／p66Shc pathway in the production of reactive oxygen species(ROS)in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)treated with urea.Methods HUVECs cultured in vitro were randomly divided into normal control group,mannitol group,urea group,and urea＋LY333531(PKCβ inhibitor)group.The activities and morphological changes of the cells treated with high concentration urea were detected by the CCK 8 assay and observed under an inverted microscope. ROS content was measured by DCFH-DA method.The levels of p66Shc,p-p66Shc,PKCβ and p-PKCβ were detected by Western blot.Immunofluorescence assay was used to observe the level of p-p66Shc in the HUVECs.Results The vitality of HUVECs in culture was inhibited greatly by urea at the concentration of 25 mmol／L with morphological changes including disordered arrangement,enlarged cell gap and destructive cobblestone appearance.Compared with the control group,the fluorescence intensity of ROS in the cytoplasm was enhanced significantly in HUVECs treated with 25 mmol／L urea and reached peak at 6h treatment,while decreased obviously with the addition of PKCβ inhibitor LY333531.Western blot results showed the levels of p66Shc,p-p66Shc,PKCβ and p-PKCβ were increased by by 25mmol／L urea treatment,and enhanced gradually with time extension.The immunoreactivity of p-p66Shc in the cytoplasm increased significantly after 6h of 25 mmol／L urea treatment,and LY333531 could block this effect；western blot results also showed that increased expression of p-p66Shc induced by high concentration of urea was inhibited by LY333531.Conclusion PKCβ／p66Shc signaling pathway plays an important role in the excessive production of ROS in HUVECs treated with high concentration urea.

Urea；HUVECs；PKCβ／p66Shc；ROS

R363.1

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.001

2016-07-28

2016-10-09

重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2015jcyjA10036）；重慶市衛(wèi)生局項(xiàng)目（2012-1-038）；重慶市教委項(xiàng)目（KJ120330，KJ120314）；重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201403，201609）；國家（市）級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410631003）

何菲，女（1990年），漢族，碩士研究生

（To whom correspondence should be addressed）：ranjianhua＠cqmu.edu.cn