王 巖(黑龍江省環(huán)境應急與事故調查中心 黑龍江 哈爾濱 150040)

低溫淀粉菌群篩選及對降解率的影響

王 巖(黑龍江省環(huán)境應急與事故調查中心 黑龍江 哈爾濱 150040)

北方大量農業(yè)廢棄物堆積，通過對農業(yè)廢棄物篩選，得到淀粉的低溫降解單菌。將這些單菌進行混合、復配，得到低溫淀粉菌群，使降解率提高12.81％。同時低溫淀粉降解菌群可使物料升溫，從而進入中溫期，帶動中溫菌株和高溫菌株生長、繁殖，產(chǎn)生大量的生物能，進入高溫階段，完成物料的無害化處理。

低溫菌株；降解菌；混合發(fā)酵劑；淀粉；溫度

黑龍江省處于中國最北端，是高寒高緯度地區(qū)，同時作為全國的產(chǎn)糧大省，每年有大量的秸稈、畜禽糞便等農業(yè)廢棄物無法得到及時有效的處置，致使大量秸稈焚燒造成環(huán)境嚴重污染和資源浪費。提高溫度是低溫發(fā)酵技術的關鍵，快速進入高溫期決定整個發(fā)酵的周期和無害化進程。

多數(shù)淀粉降解菌屬于嗜冷菌，嗜冷菌通過自身特殊的生理機制在低溫條件下能夠降解淀粉并使物料溫度迅速升高，從而帶動其他有機物降解菌，如纖維素降解菌等中溫菌進入中溫期。纖維素降解菌的分解作用可以繼續(xù)提升物料溫度，進入高溫期完成物料無害化處理。

本試驗從實驗室中長期保存的土壤、堆肥樣品中篩選出不同菌株，根據(jù)溫度對其的影響，篩選出具有協(xié)同作用的低溫復合淀粉降解菌劑，用于農業(yè)廢棄物中淀粉的降解。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試驗試劑

乳糖、氯化鉀、硝酸鈉、氫氧化鈉、乙酸鈉、羧甲基纖維素鈉、硫酸亞鐵、苯酚、冰乙酸等分析純試劑。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、微晶纖維素等生物試劑。

乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、羧甲基纖維素培養(yǎng)基、Hutchison液體培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基等培養(yǎng)基。

1.1.2 試驗儀器

YXQ-SG56-480S型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器、SPX-460D-Z型生化培養(yǎng)箱、THZ-56D型氣浴恒溫振蕩器、TGL-34E高速臺式離心機、856N型可見分光光度計等儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

樣品取自于哈爾濱市信義村的自然堆肥堆，主要成分為牛糞、秸稈等農業(yè)廢棄物，以及大慶雙榆樹鄉(xiāng)的堿性土壤。

1.2.2 菌株的分離與提純

取10g樣品加入100ml蒸餾水于錐形瓶中，置于120r/min、20℃的搖床中，充分搖動，使菌種完全游離。3d后，按照濃度梯度將菌液進行稀釋，并在LB培養(yǎng)基上均勻涂布。菌落生長茂盛后，將單體菌落轉接到LB培養(yǎng)基上，反復劃線后，得到純菌落。

1.2.3 低溫淀粉降解菌的篩選

將分離、提純的單菌菌株于15℃條件下，點接在淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌落生長茂盛后滴加少量碘液，并使碘液均勻布滿培養(yǎng)基上。具有分解淀粉能力的菌落周圍會出現(xiàn)透明圈，用劃線法將其純化。

1.2.4 低溫淀粉降解單菌的混合

將得到的低溫淀粉降解單菌進行混合培養(yǎng)，8℃恒溫條件下培養(yǎng)5d后觀察生長情況。若在兩株菌株仍能正常生長則代表此兩株菌株間不存在拮抗反應，反之則存在拮抗反應。

1.2.5 低溫淀粉降解菌降解率的測定

通過滴定法測定淀粉降解菌的降解率。取菌液10ml，定容至100ml。添加30ml 6mol·L-1的HCl溶液，沸水浴中冷凝回流2h。待冷卻后，添加兩滴甲基紅試劑，再添加10mol·L-1的NaOH溶液，滴加5mol·L-1的HCl溶液使溶液變紅，最后添加2.5mol·L-1的NaOH溶液使溶液紅色消失，定容至500ml。空白組取100ml蒸餾水，進行相同操作。根據(jù)公式計算淀粉含量。

式中：

X—樣品中淀粉含量，％；

F—10ml堿性酒石酸銅相當?shù)钠咸烟橇浚琺g；

V—滴定時樣品水解液消耗量，ml；

V0—滴定時空白溶液消耗量，ml；

500—樣品水解液總體積，ml；

0.9—還原糖換算淀粉的系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 低溫淀粉降解菌株的分離和純化

低溫條件下，降解菌能夠保持一定的活性，通過對物料中的淀粉、糖等簡單有機物的降解產(chǎn)生生物能并使肥堆升溫。選擇培養(yǎng)基中透明圈直徑D與菌落直徑d的比值大小則代表著降解淀粉的能力。

通過表1得知，由樣品分離得到的13株單菌中有8株單菌在淀粉培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈，其中D2和D6的透明圈與菌落直徑比值較大，其中D2的D/d為5.86，D6的D/d為5.74。由此可知，D2、D6具有較強的淀粉降解能力。

2.2 低溫淀粉降解菌株的混合

表1 菌株的初篩結果

當菌株生長緩慢被其他菌株覆蓋時，或是由于相互接觸菌株收到抑制無法生長，都說明在菌株間存在拮抗作用。

通過拮抗試驗觀察，D2與D6單菌菌株混合培養(yǎng)后仍能正常生長，不存在拮抗現(xiàn)象。

2.3 混合低溫淀粉降解菌菌群降解率的測定

由于淀粉的結構相對簡單，所以分解時容易產(chǎn)生生物熱能并提高物料溫度。由圖1可知，D2和D6兩株單菌的淀粉分解能力分別為38.82％和35.48％，明顯高于不接菌的對照組，說明這兩株菌都具有較強的淀粉降解能力?；旌暇闐2+D6的淀粉降解率達到了48.29％，較D2和D6分別提高了9.47％和12.81％。

3 結論

圖1 D2、D6及其組合在低溫下的淀粉降解率

(1)從普通農業(yè)廢棄物中篩選出13株單菌，8株具有降解物料中淀粉的功能。其中D2、D6菌株具有較強的降解能力。

(2)混合培養(yǎng)的低溫淀粉降解菌的淀粉降解率達到48.29％，相比低溫淀粉降解單菌分別提升了9.47％和12.81％。同時提高物料溫度，進入中溫期，從而帶動中溫菌株和高溫菌株生長、繁殖，產(chǎn)生大量的生物能，進入高溫階段，完成無害化處理。

〔1〕劉耀堂，李曉夢.我國農業(yè)秸稈的現(xiàn)狀與利用方法〔J〕.北方環(huán)境，2011，23(7)：150-155.

〔2〕張華.生物秸稈固化燃料-農作物秸稈綜合利用新途徑〔J〕..農業(yè)科技推廣，2009，(3)：39-40.

〔3〕席北斗，劉鴻亮，白慶中，等.堆肥中纖維素和木質素的生物降解研究現(xiàn)狀〔J〕.環(huán)境污染治理技術與設備，2002，3，3(3)：19-23.

〔4〕郭德憲，曹健，鮑宇茹.利用生物技術降解纖維素的研究進展〔J〕.鄭州工程學院學報，2001，22(3)：84-85.

〔5〕Klemm D，Heublein B，F(xiàn)ink H P，et al.Cellulose：fascinating biopolymer and sustainable raw material〔J〕.Angew.Chem.Int.Ed.，2005，44：3358-3393.

〔6〕瞿禮嘉，顧紅雅，胡蘋，等.現(xiàn)代生物技術第二版〔M〕.北京：高等教育出版社，2004.

〔7〕Van Wyk，J.P..Biotechnology and the utilization of biowaste as a resource forbioproductdevelopment〔J〕.Trends Biotechnol.2001，19，172-l77.

〔8〕CRAWFORD R L.1ingin biodegradation of lignin—derived molecules under anaerobic condition〔J〕.Canadian Journal of Microbiology，1982(5)：886—889.

Screening of Low Temperature Starch Bacteria and Its Effect on Degradation Rate

WangYan(Environmental Emergency and Accident Investigation Center of HeiLongjiang Province Harbin Hei-Longjiang 150040)

In the north，a lot of agricultural wastes are accumulated.Low temperature degradation monoxenies of starch are obtained by screening the agricultural wastes.The monoxenies are mixed to obtain bacterial flora of low temperature starch，and the degradation rate is increased by 12.81％.Low temperature starch degradation flora can heat material to mesothermal condition and drive the growth and reproduction of mesothermal and mesophilic strains.The process produces a large number of biological energy，enters high temperature stage and completes material harmless treatment.

Low temperature bacteria Degrading bacteria Mixed leavening agent Starch Temperature

X835

A

1674-263X(2016)03-0074-03

2016-09-30

王巖(1989-)男，碩士，助理工程師，從事環(huán)境應急管理工作。