白桂芬，張小燕

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

杰功對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)及蛋白質(zhì)含量的影響

白桂芬，張小燕

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

本實(shí)驗(yàn)以赤峰市周邊地區(qū)蔬菜大棚蚯蚓為研究對(duì)象，研究了杰功對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)和蛋白質(zhì)含量的影響.經(jīng)實(shí)驗(yàn)得知：不同濃度的杰功對(duì)蚯蚓處理24h和48h，蚯蚓的死亡情況和蛋白質(zhì)含量的變化均有明顯的差異，處理24h時(shí)，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的變化趨勢(shì)為：先上升后下降，蚯蚓死亡數(shù)量較少；處理48h時(shí)，其蛋白質(zhì)含量總體表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，其死亡數(shù)量增多.而且相同濃度杰功對(duì)蚯蚓處理24h和48h也存在差異性.

杰功；蚯蚓；蛋白質(zhì)含量；毒性效應(yīng)

1 引言

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，人們?yōu)榱俗非蟾笪镔|(zhì)利益，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用大量的農(nóng)藥和化肥，使中國(guó)的農(nóng)藥使用量居世界前列[1].隨著農(nóng)藥的大量使用，土壤中聚集了多種有害物質(zhì)使土壤環(huán)境的污染程度日趨嚴(yán)重[2-3]，因而土壤中的動(dòng)植物受到了一定的毒害作用，尤其是影響了蚯蚓的生存和繁殖.蚯蚓是土壤中重要的環(huán)節(jié)動(dòng)物，可以維持土壤肥力、活化土壤中的養(yǎng)分，是生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈中傳遞污染物的橋梁，蚯蚓對(duì)土壤中一些污染物有較強(qiáng)的敏感性，可以為土壤質(zhì)量的退化提供早期預(yù)警[4,5,6].而且土壤中許多動(dòng)物以蚯蚓為食，一旦蚯蚓體內(nèi)積累了土壤中的有害物質(zhì)，就會(huì)使污染物在食物鏈中傳遞和富集，可能威脅到食物鏈中更高級(jí)的生物.目前，土壤環(huán)境的質(zhì)量和污染物毒性的測(cè)定已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，以蚯蚓為載體，研究環(huán)境污染的生物效應(yīng)和對(duì)土壤質(zhì)量的影響[7,8,9].杰功，是一種高效、廣譜的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，以觸殺為主，噴灑時(shí)不能與堿性物質(zhì)混用以免分解失效；它屬于中等神經(jīng)毒劑，主要對(duì)昆蟲具有毒殺、趨避的作用，抑制其神經(jīng)傳導(dǎo).

蚯蚓是最好的動(dòng)物性蛋白質(zhì)飼料，體內(nèi)富含構(gòu)成組織細(xì)胞的有機(jī)大分子蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)主要承擔(dān)者；當(dāng)外界某些理化因素變化時(shí)，蛋白質(zhì)可能發(fā)生變性，而且多數(shù)蛋白質(zhì)的變性是不可逆的，生物體的生命活動(dòng)也受到一定影響.研究表明，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在某種程度上也受農(nóng)藥的影響[10]，農(nóng)藥對(duì)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響可以作為土壤質(zhì)量狀況評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[11].經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，希望可以為赤峰地區(qū)土壤環(huán)境的安全性檢測(cè)和農(nóng)業(yè)害蟲的生物學(xué)防治提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

蚯蚓來源于赤峰市周邊的蔬菜大棚，挑選有明顯生殖環(huán)帶，體重為0.3～0.5g，健康且大小基本一致的蚯蚓用于實(shí)驗(yàn).

2.1.2 實(shí)驗(yàn)農(nóng)藥

杰功，為白色水乳型殺蟲劑，生產(chǎn)于成都皇牌作物科學(xué)有限公司；高效氯氟氰菊酯是杰功的有效成分，分子式為：C23H19ClF3NO3；生產(chǎn)日期：2016年1月20日，登記證號(hào)：LS20090432，生產(chǎn)批準(zhǔn)證號(hào)：HNP51087-A7638，產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/66047041 -1.61-2009.

2.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

玻璃培養(yǎng)皿（直徑15cm，高2.5cm），中速濾紙（直徑15cm），試劑瓶(250mL)，容量瓶（500mL），燒杯（1L），離心機(jī)（DD—5M低速臺(tái)式離心機(jī)），注射器（10mL），分光光度計(jì)（UV-9600），玻璃比色皿，電子天平(SL2001N)，量筒（25mL,100mL)，移液槍（1-50uL,5000uL)，離心管（50mL），試管等.

2.1.4 蛋白測(cè)定試劑盒

規(guī)格：100T/96樣，產(chǎn)地：南京建成生物工程研究所.生產(chǎn)批號(hào)：20160308；有效期至：2016年09月07日.試劑一：考馬斯亮蘭貯備液60ml×1瓶，在4℃條件下保存6個(gè)月.

試劑二：0.563g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0.5ml×1支，在4℃條件下保存1個(gè)月.

2.1.5 杰功濃度的設(shè)計(jì)

參照杰功的說明書用藥量（120-150克/公頃，8-10克/畝），設(shè)置杰功的濃度范圍，做多次預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.杰功的濃度范圍為：0.002g/L，0.004g/L，0.006g/L，0.008g/L，0.01g/L.

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 濾紙接觸法對(duì)蚯蚓急性毒理

清腸：用清水洗凈蚯蚓，放入鋪有雙層濾紙的燒杯中，噴灑適量的水使濾紙完全浸濕，最后用保鮮膜封口、解剖針扎孔，保證蚯蚓可進(jìn)行正常呼吸，將燒杯置于避光處清腸24h.

注入農(nóng)藥：首先在每個(gè)玻璃培養(yǎng)皿中鋪三層濾紙，使其恰好遮住皿底，然后用注射器從每個(gè)濃度的杰功溶液中分別取10ml，分別均勻注入培養(yǎng)皿中，恰好使濾紙浸透，給每個(gè)培養(yǎng)皿做好標(biāo)記，每個(gè)濃度設(shè)置3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組.

放入蚯蚓：將清腸的蚯蚓洗干凈，用濾紙吸去體表的水分，每個(gè)培養(yǎng)皿放入10條蚯蚓，然后用保鮮膜封口、橡皮筋固定，以防蚯蚓逃逸，最后用解剖針扎孔.

記錄與觀察:將培養(yǎng)皿置于鋪有棉花的試驗(yàn)臺(tái)上，同時(shí)保證室內(nèi)溫度在25℃左右.24h、48h分別觀察1次,觀察蚯蚓在不同時(shí)間段的中毒癥狀，記錄蚯蚓的死亡條數(shù),若對(duì)其頭部或尾部刺激無反應(yīng)則視為死亡，48h后結(jié)束試驗(yàn)，并分別計(jì)算蚯蚓死亡率[12-13].

2.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

2.2.2.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定依據(jù)

當(dāng)考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，由于蛋白質(zhì)分子含有一個(gè)—NH3+基團(tuán)，考馬斯亮蘭染液上的陰離子與蛋白質(zhì)的—NH3+結(jié)合，溶液呈藍(lán)色，通過測(cè)定吸光值可計(jì)算出蛋白質(zhì)含量[14].

2.2.2.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法

研磨：分別取染毒24h、48h后每一個(gè)濃度存活的蚯蚓，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，按質(zhì)量（g）：體積(mL)=1：9加入生理鹽水進(jìn)行研磨，制成10%的樣液.

離心：以2500r/min，離心10min，取上清液，用生理鹽水按1:9的比例稀釋成1%的樣液，混勻，靜置10min.

測(cè)定OD值：在595nm處、1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，按試劑盒說明方法依次測(cè)定各管吸光值（見表1）.

表1 蛋白質(zhì)測(cè)定操作表

利用公式：

計(jì)算蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量

2.2.3 數(shù)據(jù)處理

將蚯蚓的死亡率和蛋白質(zhì)含量等數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用Microsoft Excel、WPS對(duì)其進(jìn)行處理.

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 杰功對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)

蚯蚓一開始接觸經(jīng)杰功處理的濾紙時(shí)，出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，身體呈卷曲狀態(tài)，活動(dòng)逐漸減弱，部分蚯蚓爬到濾紙下面.處理24h時(shí)，觸摸蚯蚓可明顯感覺到其變?nèi)彳洠糠煮w節(jié)出現(xiàn)紡錘狀的囊包，環(huán)帶變松弛，接觸高濃度杰功的蚯蚓有溶血現(xiàn)象，分泌少量黃色液體，有個(gè)別蚯蚓死亡；處理48h觀察時(shí)，部分蚯蚓生殖環(huán)腐爛，身體出現(xiàn)斷節(jié)現(xiàn)象.通過觀察得知，杰功的濃度越大，接觸時(shí)間越長(zhǎng)，蚯蚓的中毒癥狀愈加明顯，死亡數(shù)量越多，而無農(nóng)藥的空白組蚯蚓表現(xiàn)正常，基本全部存活.

通過記錄和計(jì)算（見表2），蚯蚓處理24h后，不含農(nóng)藥的對(duì)照組和濃度為0.002g/L組中的蚯蚓全部存活；在0.004g/L～0.01g/L濃度范圍內(nèi)，蚯蚓的死亡數(shù)目逐漸增多，部分蚯蚓出現(xiàn)輕微中毒現(xiàn)象.處理48h后，在0.002g/L濃度與對(duì)照組中，蚯蚓的死亡率由0%升高到3.3%，幾乎無致死效應(yīng)；在0.004g/L～0.01g/L濃度之間，較多蚯蚓出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，中毒癥狀明顯.其中在0.01g/L實(shí)驗(yàn)組，24h和48h死亡率分別為10%、53.3%，死亡率達(dá)到最大值.

表2 蚯蚓接觸杰功的死亡情況

根據(jù)表2，橫坐標(biāo)為杰功的濃度，縱坐標(biāo)為蚯蚓處理24h、48h的死亡率（見圖1），得出回歸方程：

方程中，D表示蚯蚓死亡率（%），X表示杰功濃度（g/L），R為相關(guān)系數(shù)，P為顯著性水平，n為實(shí)驗(yàn)處理數(shù).根據(jù)方程得出杰功的LC50為0.01g/L.

圖1 蚯蚓毒理24h、48h的死亡率

3.2 杰功對(duì)蚯蚓蛋白質(zhì)的影響

根據(jù)表3統(tǒng)計(jì)的蛋白質(zhì)濃度，得出不同濃度杰功對(duì)蚯蚓處理24h和48h后蛋白質(zhì)的變化趨勢(shì)圖（見圖2）.

表3 處理蚯蚓24h、48h后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量

圖2 杰功對(duì)蚯蚓蛋白質(zhì)的影響

圖2中的數(shù)據(jù)表明：未接觸農(nóng)藥時(shí)蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量為0.826g/L，而杰功處理蚯蚓24h、48h后其蛋白質(zhì)含量發(fā)生了不同的變化.處理24h后，蛋白質(zhì)含量的最大值和最小值分別為0.943g/L和0.818g/L，對(duì)應(yīng)的濃度分別為0.008g/L和0.01g/L，蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)；處理48h后，杰功濃度為0.008g/L時(shí)蛋白質(zhì)的含量為0.368g/L，是最小值，其峰值出現(xiàn)在濃度0.002g/L時(shí)，值為0.595g/L，在杰功最大濃度0.01g/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量略有上升，濃度為0.383g/L，蛋白質(zhì)含量隨杰功濃度的增大總體呈下降的趨勢(shì).

4 討論與分析

4.1 杰功對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)通過使用濾紙接觸法，研究了不同濃度的杰功對(duì)蚯蚓的急性毒理作用，同時(shí)對(duì)杰功毒性的強(qiáng)弱有了進(jìn)一步的了解，該方法需要蚯蚓與農(nóng)藥直接接觸，操作簡(jiǎn)單.通過實(shí)驗(yàn)得知，當(dāng)蚯蚓死亡率達(dá)到53.5% 時(shí)，對(duì)應(yīng)的杰功濃度是0.01g/L，接觸時(shí)間為48h，故杰功對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)不僅與杰功濃度的大小有關(guān)，還與處理時(shí)間的長(zhǎng)短相關(guān)，即杰功濃度越大，處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)蚯蚓毒理效應(yīng)越明顯；同時(shí)證明蚯蚓對(duì)杰功具有一定耐受能力，但是有其耐受限度，如果杰功濃度太大就可能超出蚯蚓的耐受限度，就可能使蚯蚓的死亡率升高.杰功含有5%高效氟氯氰菊酯，通過觸殺的方式使蚯蚓中毒，破壞組織和器官的結(jié)構(gòu)，如上所述，接觸杰功后蚯蚓表現(xiàn)出不同程度的中毒癥狀，使其不能正常生存.故在田間使用這種藥物時(shí)可能會(huì)使動(dòng)物及人類中毒，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)和結(jié)論可以為實(shí)際操作提供一些依據(jù).

4.2 杰功對(duì)蚯蚓蛋白質(zhì)的影響

不同濃度的杰功對(duì)蚯蚓分別處理24h、48h后，對(duì)其蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定（見表3）.測(cè)定結(jié)果表明，杰功處理蚯蚓24h后其內(nèi)蛋白含量均發(fā)生了增加，除了濃度為0.01g/L時(shí)蛋白質(zhì)含量略低于對(duì)照組，而處理48h后體內(nèi)蛋白質(zhì)含量均減少了，且低于對(duì)照組，可見蚯蚓接觸杰功24h與48h對(duì)其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有不同程度的影響.研究資料表明，當(dāng)蚯蚓遭到外界某種因素脅迫時(shí)，內(nèi)環(huán)境可能出現(xiàn)紊亂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，其體內(nèi)少量蛋白質(zhì)性質(zhì)改變，同時(shí)在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，因此蚯蚓處理24h時(shí)體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量增加了[15].但是隨著杰功濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蚯蚓體內(nèi)較多蛋白質(zhì)變性，而變性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較松散易被蛋白酶水解，使蛋白質(zhì)含量下降；另外可能破壞了蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)的生成來源，從而影響了蛋白質(zhì)的含量，使得總蛋白質(zhì)含量降低.故杰功處理蚯蚓48h后，蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì).

5 展望

在本實(shí)驗(yàn)中，杰功濃度達(dá)到0.002g/L時(shí)，蚯蚓就出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象，且濃度為0.01g/L時(shí)蚯蚓死亡數(shù)目達(dá)到一半.實(shí)驗(yàn)中按照杰功的劑量說明配置的濃度可能低于田間使用的濃度，但是杰功對(duì)蚯蚓也起到了一定的觸殺作用，如果杰功處理蚯蚓的時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)或者杰功濃度適當(dāng)減小，對(duì)蚯蚓及其他的昆蟲能否起到較好的觸殺作用還有待進(jìn)一步研究.結(jié)果表明，同一濃度的杰功對(duì)蚯蚓處理不同時(shí)間其毒性效應(yīng)有顯著差異，蛋白質(zhì)含量也表現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)；不同濃度的杰功對(duì)蚯蚓的危害程度不相同，同理其蛋白質(zhì)含量的變化也不同，這些變化都是動(dòng)態(tài)過程，受外界各種因素的影響，除了受杰功濃度、處理時(shí)間的影響外，與溫度、濕度等條件也有關(guān)系.故隨著人們對(duì)環(huán)境質(zhì)量的高度重視，農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒理效應(yīng)及蛋白質(zhì)影響的研究會(huì)有很大的發(fā)展前景[16].

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