仲冬艷

（蘇州大學(xué)骨科研究所，江蘇蘇州 215000）

兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離提取與培養(yǎng)

仲冬艷

（蘇州大學(xué)骨科研究所，江蘇蘇州 215000）

在組織工程發(fā)展中，軟骨組織因其成分簡單首先被研究用來做體外組織工程軟骨的構(gòu)建。但由于自體軟骨組織取材小，獲得活細(xì)胞數(shù)量較少，且體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞易發(fā)生“去分化”現(xiàn)象，限制了其后期應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化提取方法，獲得大量活性好、增殖能力強(qiáng)的軟骨細(xì)胞；并且發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加HEPES液、非必需氨基酸、脯氨酸以及抗壞血酸后，軟骨細(xì)胞的貼壁及增殖能力明顯增強(qiáng)。

軟骨細(xì)胞 提取 培養(yǎng)

軟骨細(xì)胞作為軟骨組織在軟骨基質(zhì)中唯一存在的特定的細(xì)胞種類，在軟骨組織再生與代謝方面起到了重要作用。但因軟骨組織中缺少血管和神經(jīng)系統(tǒng)，其自身修復(fù)方面存在一定的局限性。近些年，生物組織工程學(xué)將工程學(xué)和生命科學(xué)的方法原理相互結(jié)合構(gòu)建人體組織或器官的功能替代物。在軟骨組織工程中，體外構(gòu)建的自體軟骨細(xì)胞組織復(fù)合物可移植到機(jī)體受損關(guān)節(jié)修復(fù)其結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有功能。自體軟骨組織移植技術(shù)已引起人們越來越多的重視，但由于機(jī)體軟骨組織中的軟骨細(xì)胞相對較少，無法滿足機(jī)體受損關(guān)節(jié)修復(fù)和愈合所需的軟骨細(xì)胞數(shù)量；并且軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增的過程中，會發(fā)生“去分化”現(xiàn)象。發(fā)生了去分化現(xiàn)象的軟骨細(xì)胞則不宜再用于軟骨組織工程。因此，本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)，試圖探討通過簡易的方法來獲取大量活性化、增殖能力強(qiáng)的軟骨細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和試劑

2月齡新西蘭大白兔1只（由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中學(xué)提供），體重1.5kg。II型膠原酶（collagenase type II）、HEPES液、脯氨酸、抗壞血酸及非必須氨基酸均由Sigma公司提供；高糖DMEM、PBS從Hyclone購買；胎牛血清、青鏈霉素由Gibco公司提供；cck8試劑購自國產(chǎn)碧云天。

1.2 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

耳緣靜脈空氣栓塞法處死新西蘭兔，75%酒精消毒雙側(cè)膝關(guān)節(jié)。將關(guān)節(jié)以及周圍肌肉組織完全離斷，75%醫(yī)用酒精浸泡消毒后，放入含有雙抗的PBS液中。在超凈臺上分離關(guān)節(jié)，剔除周圍的軟組織。仔細(xì)清除軟骨表面的滑膜，用刀片削下透明軟骨，放入含2ml PBS的5ml EP管中，并用PBS清洗3次。去掉PBS后，加入4ml 0.2%II型膠原酶，并移入15ml離心管中，放入37℃恒溫?fù)u床振蕩消化。消化過程中，觀察到約3h，軟骨組織已全部變?yōu)樾鯛睢⒓?xì)胞懸濁液經(jīng)過200目濾網(wǎng)過濾，收集到的軟骨細(xì)胞分別按2000個(gè)/孔接種于96孔板、5000個(gè)/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并每3天換液一次。

1.3 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液的組成

對照組：高糖DMEM培養(yǎng)基，添加10% FBS和1%雙抗。實(shí)驗(yàn)組是在對照組的基礎(chǔ)上，添加0.1mM非必須氨基酸、10mM HEPES液、0.4mM脯氨酸、50mg/L抗壞血酸。

1.4 原代軟骨細(xì)胞貼壁和增殖情況

（1）細(xì)胞貼壁情況：原代細(xì)胞接種24h后，每天于倒置顯微鏡下觀察貼壁生長情況并拍照。

（2）cck8法檢測細(xì)胞增殖：原代細(xì)胞按2000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，接種后1-10d每天測得其吸光值（OD490）。測定前每孔加入10ul cck8溶液，放置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。2h后于酶標(biāo)儀檢測OD490。

2 結(jié)果

2.1 原代軟骨細(xì)胞的貼壁情況及形態(tài)學(xué)觀察

原代軟骨細(xì)胞接種后，分別按實(shí)驗(yàn)組和對照組的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)觀察7d。原代分離的軟骨細(xì)胞為圓球形，懸浮于培養(yǎng)基中；實(shí)驗(yàn)組，24h后細(xì)胞開始貼壁，逐漸展開，第3天時(shí)細(xì)胞基本均已展開呈多角形，在增殖過程中，出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，至第6天，細(xì)胞可長滿瓶底，單層生長的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)；而對照組的細(xì)胞，在48h才開始貼壁，第4天細(xì)胞基本展開呈多角形，第7天時(shí)呈現(xiàn)“鋪路石”樣。

2.2 原代軟骨細(xì)胞的增殖情況

通過cck8法檢測了實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞連續(xù)9d的增殖情況。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在接種第2天即開始增殖，而對照組的細(xì)胞從第4天才開始明顯增殖，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖率明顯高于對照組。

3 討論

隨著社會快速發(fā)展，人口老齡化的問題日趨嚴(yán)重，伴隨而來的關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)病率也出現(xiàn)持續(xù)升高。因軟骨組織缺乏血液和神經(jīng)供應(yīng)，其自身修復(fù)能力較差，故軟骨損傷的治療問題一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。近年來，軟骨組織工程技術(shù)已成為治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的重要手段，而足夠數(shù)量的高質(zhì)量種子細(xì)胞的來源則是組織工程軟骨構(gòu)建的關(guān)鍵。

本研究在軟骨細(xì)胞的消化分離過程中，清除軟骨表面的滑膜組織后，采用對細(xì)胞毒性較小的0.2% II型膠原酶消化，可以減輕胰酶對軟骨細(xì)胞的傷害。置于37℃恒溫?fù)u床振蕩，可以在較短時(shí)間內(nèi)使軟骨消化更徹底。本實(shí)驗(yàn)中，1只兔的雙膝關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)3h左右的消化后已可完全消化，收集細(xì)胞后計(jì)數(shù)可達(dá)500萬，且細(xì)胞的活性較高，貼壁率達(dá)90%以上。本消化方法較很多文獻(xiàn)報(bào)道中的聯(lián)合酶消化法等，具有步驟簡單、耗時(shí)短、污染率低、獲取細(xì)胞數(shù)量多等特點(diǎn)。

在軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)，使用添加了HEPES液、非必須氨基酸、脯氨酸及抗壞血酸的培養(yǎng)基可以促進(jìn)原代軟骨細(xì)胞的貼壁和增殖，且pei等表明這種培養(yǎng)基可以利于軟骨細(xì)胞表型的維持。因此，在軟骨組織工程中體外準(zhǔn)備種子細(xì)胞時(shí)可以考慮使用該培養(yǎng)基，以獲取更多具有軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞。

［1］趙強(qiáng)，王一洲.兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型的建立及軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)［J］.天津中醫(yī)藥，2013（03）.

［2］丁萬軍，劉世清，賀斌，鄧明.大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)去分化時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012（01）.

［3］張志光，鄭衛(wèi)平，蘇凱，許躍.兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2004（01）.

仲冬艷（1987—），江蘇沭陽人，女，碩士研究生，助理實(shí)驗(yàn)師，初級，研究方向：生物力學(xué)。