苗乘源，鄭 琳，程雅韻，金 清，崔泰花

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

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朝鮮族傳統(tǒng)米酒中的乳酸菌多樣性分析

苗乘源，鄭 琳，程雅韻，金 清，崔泰花*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為了分析米酒中乳酸菌的多樣性，從2種朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵米酒中利用平板稀釋法及菌落特征共分離出28株菌株，革蘭氏染色觀察形態(tài)后篩選出11株推定為乳酸菌菌株，再經(jīng)SDS-PAGE電泳法分析篩選菌株的全細(xì)胞蛋白模式，將其劃分為2大類，經(jīng)16s rRNA基因序列分析，確定為發(fā)酵乳桿菌，且在2種傳統(tǒng)發(fā)酵米酒中發(fā)酵乳桿菌均參與發(fā)酵。

米酒；乳酸菌；SDS-PAGE電泳；16s rRNA

朝鮮族傳統(tǒng)米酒是一種老少皆宜的低酒精度的發(fā)酵型飲料酒，其酒精含量一般為3%～14%，發(fā)酵的主要原料為糯米，經(jīng)浸米、蒸米、糖化、發(fā)酵等工序釀制而成，富含葡萄糖、麥芽糖、氨基酸、維生素、有機(jī)酸、多糖等多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]。其米香濃郁，口感醇和，具有補(bǔ)血養(yǎng)顏、舒筋活絡(luò)、強(qiáng)身健體和延年益壽的功效[2]。在米酒發(fā)酵過程中，乳酸菌起到了關(guān)鍵作用。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。乳酸菌可分為18個(gè)屬，共有200多種[3,4],具有防治乳糖不耐癥、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、改善人體腸道菌群平衡、抑制腐敗菌生長(zhǎng)、降血脂、降血壓的作用，同時(shí)還有增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功能[4]。

因此，為了分析米酒中乳酸菌的分布及乳酸菌對(duì)米酒的影響，該試驗(yàn)從朝鮮族傳統(tǒng)發(fā)酵米酒中按照乳酸菌的菌落特征初步分離篩選出乳酸菌，并運(yùn)用革蘭氏染色觀察菌株形態(tài)進(jìn)一步篩選乳酸菌,采用SDS-PAGE電泳法分析全細(xì)胞蛋白模式，根據(jù)蛋白質(zhì)條帶特點(diǎn)對(duì)菌株進(jìn)行歸類，最后經(jīng)16s rRNA基因序列分析對(duì)歸類菌株進(jìn)行鑒定。分析朝鮮族傳統(tǒng)米酒中乳酸菌的多樣性，對(duì)研究傳統(tǒng)發(fā)酵米酒中乳酸菌分布，從而進(jìn)一步了解乳酸菌分布對(duì)米酒發(fā)酵特性的影響，為有益乳酸菌的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

黑米米酒(由延吉市以勒公司提供)，善子米酒(由延吉市善子飯店提供)。

1.1.2 主要試劑

甘氨酸、丙烯酰胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘油、溴酚藍(lán)、四甲基乙二胺(TEMED)、2-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等試劑為Sigma公司產(chǎn)品，分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Promega公司產(chǎn)品，其他試劑均使用了分析純國(guó)產(chǎn)試劑。

1.1.3 主要儀器

PowerPac 3000電泳儀和3 Cell 電泳槽(美國(guó)伯樂公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司Scientz-ⅡD)；超凈工作臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司SW-CJ-1FD)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療設(shè)備有限公司DNP-9082BS-Ⅲ)；數(shù)字酸度計(jì)(上海鵬順科學(xué)儀器有限公司PHS-3C)；超低溫冷凍箱(美國(guó)NUAIRE公司NU-9668E)；高壓蒸汽滅菌器(日本TOMY公司SX-700)。

1.1.4 培養(yǎng)基

乳酸菌的篩選和培養(yǎng)選用了添加溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基[5]。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的篩選與純化

采用平板稀釋法[6,7]。

取2種傳統(tǒng)發(fā)酵米酒樣液作為初始倍數(shù)菌液(100)，按10倍梯度遞增稀釋后均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取乳酸菌菌落特征明顯的單個(gè)菌落在MRS培養(yǎng)基中37 ℃純化培養(yǎng)24 h，并按照不同樣品、不同稀釋度進(jìn)行編號(hào)(黑米米酒，善子米酒中所篩選出的菌株編號(hào)字母依次為J、K)。

1.2.2 乳酸菌菌種保藏

將已純化的乳酸菌菌種接種到1 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,將菌株培養(yǎng)液0.7 mL與0.3 mL 50%甘油混合，在-80 ℃冷凍冰箱中保存?zhèn)溆肹7]。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

為觀察細(xì)菌形態(tài),對(duì)篩選菌株進(jìn)行革蘭氏染色[8]。

將純化菌種接種到MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。取生理鹽水1滴滴在載玻片上，用接種環(huán)取1個(gè)單一菌落溶于生理鹽水中，用火焰固定，草酸銨結(jié)晶紫染色2 min，碘液媒染2 min，95%酒精脫色30 s，蕃紅復(fù)染2 min，細(xì)水清洗干燥后，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.2.4 乳酸菌全細(xì)胞蛋白模式的分析

SDS-PAGE電泳法分析全細(xì)胞蛋白模式[9,10]。

將純化后的乳酸菌在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)后離心,沉淀物用生理鹽水清洗、離心，得到菌體加入生理鹽水混勻后用細(xì)胞粉碎機(jī)破碎,破碎溶液為樣品作凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。凝膠濃度分別為分離膠12.5%、濃縮膠5%。分離電壓分別為分離膠140 mV、濃縮膠70 mV。 考馬斯亮藍(lán)R250染色1 h后用10%乙酸脫色至凝膠背景清晰。

1.2.5 菌種鑒定

利用16s rDNA 基因序列測(cè)定方法進(jìn)行菌種鑒定。代表菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后離心得到菌體。使用試劑盒提取菌體總DNA[11],總DNA為模板27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACCTTGTTACGACTT)為引物進(jìn)行16s rDNA PCR擴(kuò)增。所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，由SolGent公司(韓國(guó)，大田)測(cè)定序列，經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性分析鑒定到種。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離和純化

將收集到的2種米酒梯度稀釋后涂布在MRS固體培養(yǎng)基，挑選具有明顯乳酸菌菌落特征的菌株，共分離28株菌株，其中，黑米米酒中12株，善子米酒中16株。

2.2 革蘭氏染色結(jié)果

圖1為對(duì)黑米米酒、善子米酒中分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色后的顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果表明，所分離的28株菌株中有11株具有乳酸菌形態(tài)特征，其中6株來自黑米米酒，5株來自善子米酒，11株菌株形態(tài)均呈桿狀。

圖1 黑米米酒(J)、善子米酒(K)中代表菌株革蘭氏染色 (10×100)

2.3 乳酸菌全細(xì)胞蛋白模式分析

根據(jù)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示的主要蛋白質(zhì)條帶厚度、位置、間隙、數(shù)量以及分子量差異對(duì)菌株進(jìn)行歸類，全細(xì)胞蛋白模式相同的菌株視為同類菌種[12]。由圖2可知，呈現(xiàn)乳酸菌形態(tài)的11株菌株主要為2大類型，具體劃分見表1。

圖2 SDS-PAGE電泳法分析的乳酸菌菌株的全細(xì)胞蛋白模式

2.4 菌種鑒定

對(duì)上述通過SDS-PAGE電泳法劃分的2大類乳酸菌代表菌株提取總DNA，以分別提取的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增16s rRNA基因片段后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行分析，將所得到的基因序列在 GenBank 中同源序列搜索的結(jié)果見表1。由表1可知，代表菌株被鑒定為發(fā)酵乳桿菌，且具有較高的同源性(99%以上)。

表1 運(yùn)用16s rRNA序列鑒定乳酸菌的種類

3 結(jié)論

本試驗(yàn)運(yùn)用平板稀釋法從2種傳統(tǒng)發(fā)酵米酒中分離出28株乳酸菌，經(jīng)革蘭氏染色觀察形態(tài)后篩選出11株具有乳酸菌形態(tài)特征的菌株，利用SDS-PAGE電泳法對(duì)菌株全細(xì)胞蛋白模式進(jìn)行分析后，11株菌株被劃分為2大類，最后對(duì)2大類的代表菌株16s rDNA基因序列進(jìn)行分析， 11株菌株均被鑒定為發(fā)酵乳桿菌，且2種傳統(tǒng)發(fā)酵米酒的發(fā)酵過程均有發(fā)酵乳桿菌的參與。

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Diversity analysis of lactic acid bacteria in traditional Chinese-Korean rice wine

MIAO Chengyuan, ZHENG Lin, CHENG Yayun, JIN Qing, CUI Taihua*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,JilinYanji133002,China)

In order to investigate lactic acid bacterial diversity, 28 strains were isolated from the traditional Chinese-Korean rice wine based on the colony morphological characteristics using the dilution plating method. Among these, 11 strains screened out based on the gram staining were inferred as lactate acid bacteria and divided into 2 patterns by whole-cell protein pattern analysis using SDS-PAGE. By 16S rRNA gene sequencing, the strains screened were identified asLactobacillusfermentumparticipating in the fermentation of both traditional rice wines.

rice wine; lactic acid bacteria; SDS-PAGE electrophoresis; 16S rRNA

2015-12-09 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31260362)；延邊大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(ydbksky2015249)

苗乘源(1993—)，女，吉林通化人，在讀學(xué)士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锇l(fā)酵。崔泰花為通信作者，

E-mail:Lich@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0248-03

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.012

TS262.4

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