徐聆粵，姜 丹，郭夢(mèng)玉，黃圓博，樸一龍

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

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軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺含量的高效液相色譜檢測(cè)

徐聆粵，姜 丹，郭夢(mèng)玉，黃圓博，樸一龍*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

植物體內(nèi)源多胺含量與植物性別有關(guān)，為了鑒定軟棗獼猴桃雌雄株性別，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)始花期軟棗獼猴桃雌雄株葉片測(cè)定了腐胺、亞精胺和精胺的含量。結(jié)果表明：檢測(cè)條件以苯甲?；磻?yīng)溫度37 ℃，25 min，色譜柱為 C18(150 mm×4.6 mm 3 μ)柱，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為甲醇，B為水，體積比為64∶36，流動(dòng)相的流速0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm為最佳。軟棗獼猴桃始花期雄雌株中，雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株，雌雄株葉片中亞精胺含量無(wú)顯著差異。

軟棗獼猴桃；雌雄株；高效液相色譜法；多胺；苯甲?；?/p>

軟棗獼猴桃是一種光果獼猴桃種類之一，被譽(yù)為“世界之珍果”[1]，是獼猴桃屬中在我國(guó)地域分布最廣泛的野生果樹之一[2]。目前軟棗獼猴桃在世界各地被稱為第3代獼猴桃，與我們所熟知的中華獼猴桃、美味獼猴桃相比更具有保健價(jià)值。其植株為雌雄異株植物，不同性別的植株中各種內(nèi)源物質(zhì)的含量及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力也有差異。

多胺是高等植物體內(nèi)不可缺少的生理活性物質(zhì)，其種類主要有腐胺(Put)、亞精胺(Spd)和精胺(Spm)，它們不僅參與了植物各種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[3]，還與抗逆性密切相關(guān)[4]。研究表明，多胺在一定濃度范圍內(nèi)有促進(jìn)植物生長(zhǎng)與分化、延緩許多雙子葉和單子葉植物離體葉片衰老的作用[5-6]。多胺還與植物的性別分化有關(guān)，對(duì)植物雌雄蕊的發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。大量研究表明,外源噴施腐胺、亞精胺與精胺能夠增加植物花芽的數(shù)目,特別是在內(nèi)源水平低的情況下,促進(jìn)花芽形成的效果更加明顯[7-8]。陳坤明等則認(rèn)為，亞精胺和精胺的累積是增強(qiáng)作物抗旱性的主要因素[9]。

多胺在人體內(nèi)也起到至關(guān)重要的作用。多胺主要存在于植物體內(nèi)，人類可以通過(guò)食物攝取多胺，人體內(nèi)少量的多胺可以通過(guò)自身代謝排出體外，但攝入量過(guò)多時(shí)會(huì)對(duì)身體造成傷害。因此，如何高效快速地檢測(cè)植物中的多胺含量成為了人們?cè)絹?lái)越關(guān)注的內(nèi)容。檢測(cè)多胺常采用化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)檢測(cè)法、薄層色譜法等，但是這些方法都存在實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確、檢測(cè)效率低等問(wèn)題。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究和技術(shù)更新，現(xiàn)在多采用高效液相色譜法或反高效液相色譜法檢測(cè)，效率高、結(jié)果精準(zhǔn)。劉俊等[10]研究了高效液相色譜法檢測(cè)組織中多胺含量的方法，但利用該方法檢測(cè)多胺含量也存在如何正確選擇色譜條件、異常峰的處理等多方面問(wèn)題。劉華英等[11]探討了苯甲?；磻?yīng)的最佳條件和色譜條件。在研究雌雄異株植物中多胺含量的差異時(shí)，不同植物種類的檢測(cè)結(jié)果不同，而且還存在一些爭(zhēng)議，對(duì)于軟棗獼猴桃雌雄株中多胺含量的檢測(cè)也少有相關(guān)研究。

本試驗(yàn)僅以始花期的軟棗獼猴桃雌雄株葉片為材料，采用高效液相色譜法測(cè)定其葉片中腐胺、亞精胺、精胺的含量并進(jìn)行比較，為今后軟棗獼猴桃多胺含量測(cè)定及雌雄株的鑒別提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料于2014年6月3日取自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院軟棗獼猴桃資源圃，選取8年生樹勢(shì)中庸、無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷的軟棗獼猴桃雌雄株各5株，摘取其雌雄株葉片若干，裝入冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，液態(tài)氮研磨后置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

高效液相色譜儀(日本島津公司的LC-2010A HT)，色譜柱(Adsorbosphere HS C18150 mm×4.6 mm 3 μ)，超聲波清洗器，渦旋儀，水浴鍋，離心機(jī)(Himac CR22G)，氮吹儀，電子天平，恒溫干燥箱，針筒式濾膜(0.45 μm，有機(jī)系)。

1.2.2 試劑

腐胺(put)、亞精胺(spm)、精胺(spd)3種標(biāo)準(zhǔn)品均為sigma公司產(chǎn)品，甲醇為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和測(cè)定

材料處理方法參考Flores H E等[12]的方法并稍作改動(dòng)。選取軟棗獼猴桃雌雄株葉片各1.60 g，用液態(tài)氮充分研磨至粉末，加入2 mL預(yù)冷的5%高氯酸溶液繼續(xù)研磨后，轉(zhuǎn)入14 mL離心管中，再用2 mL的5%高氯酸溶液沖洗研缽并轉(zhuǎn)入離心管中渦旋混勻，冰浴浸提1 h，再以10 000 r/min、4 ℃的條件下離心40 min，取500 μL上清液，加入1 mL 2 M的NaOH和7 μL的苯甲酰氯渦旋20 s充分混合均勻，37 ℃水浴反應(yīng)25 min完成后，加入2 mL飽和NaCl渦旋混勻、再加入2 mL乙醚，以5 000 r/min離心5 min，收集1 mL上層醚相，用氮吹儀吹干，再次加入1 mL乙醚吹干，用500 μL甲醇溶解后，過(guò)0.45 μm濾膜，取10 μL進(jìn)樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

混標(biāo)配制參考趙雪萍等[13-14]的方法，并略加改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取腐胺、亞精胺、精胺0.004 5、0.005 4和0.006 8 g，用預(yù)冷的5%高氯酸溶液溶解定容至10 mL容量瓶中，放進(jìn)超聲波清洗器中3 min后，準(zhǔn)確移取以上3種多胺標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL混合均勻制成混合母液，再取100 μL母液進(jìn)行苯甲?；磻?yīng)，步驟同上。分別取苯甲?；蟮亩喟窐?biāo)準(zhǔn)液依次稀釋1倍、5倍、12.5倍、25倍和50倍配制成混合標(biāo)準(zhǔn)系列，取10 μL進(jìn)樣，用液相色譜儀分析測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度分別繪制腐胺、亞精胺、精胺的工作曲線。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為 C18(150 mm×4.6 mm 3μ) 柱，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。以甲醇和水作為流動(dòng)相，體積比設(shè)定為V甲醇∶V水= 64∶36，流速為0.6、0.7和0.8 mL/min。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

樣品重復(fù)3次，取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)作顯著性差異分析，顯著水平為0.05、0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

在波長(zhǎng)230 nm、甲醇濃度64%條件下，不同流速對(duì)3種多胺分離的影響結(jié)果如表1。流速V=0.6 mL/min時(shí)，3種多胺峰面積表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，各胺峰面積均大于流速V=0.7 mL/min和V=0.8 mL/min時(shí)各峰面積值，通常用分離度R=1.5作為兩峰完全分離的標(biāo)志，而流速V=0.7、0.8 mL/min時(shí)，分離度過(guò)小，保留時(shí)間過(guò)于相近，3種多胺不能較好地分離。綜合考慮，以流速V=0.6 mL/min作為分離條件效果較好。3種多胺的檢測(cè)可以得到滿意的基線分離(圖1)，樣品也可在15 min內(nèi)完成檢測(cè)。

表1 不同流速對(duì)多胺檢測(cè)的影響

圖1 多胺標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

2.2 軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺的測(cè)定

2.2.1 軟棗獼猴桃雌株葉片中多胺的測(cè)定

由圖2可知，軟棗獼猴桃雌株葉片中的亞精胺出峰面積顯著高于其他2種多胺，精胺出峰面積小于亞精胺但大于腐胺，腐胺峰面積相對(duì)最少。腐胺、亞精胺、精胺的出峰時(shí)間分別為4.55、5.91和12.47 min。

圖2 軟棗獼猴桃雌株葉片中多胺的液相色譜圖

2.2.2 軟棗獼猴桃雄株葉片中多胺的測(cè)定

由圖3可知，在軟棗獼猴桃雄株始花期葉片中3種多胺的峰面積差異顯著，腐胺出峰面積最高，顯著高于亞精胺和精胺，精胺出峰面積相對(duì)最小。腐胺和亞精胺、精胺的出峰時(shí)間分別為4.55、5.90和2.47 min。

圖3 軟棗獼猴桃雄株葉片中多胺的液相色譜圖

2.3 軟棗獼猴桃雌雄株葉片中多胺含量差異

由表2可知，在軟棗獼猴桃雌雄株始花期階段，雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株(P<0.05)，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株(P<0.01)，雌雄株葉片中亞精胺含量無(wú)顯著差異。因此，在始花期軟棗獼猴桃雌雄株葉片中腐胺、精胺含量可作為雌雄株差異的鑒別指標(biāo)。

表2 軟棗獼猴桃雌雄株葉片多胺含量比較

注:*和**分別表示在P<0.05和P<0.01 水平上顯著性分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由于軟棗獼猴桃葉片中多胺的含量很低，在試驗(yàn)中選擇較低濃度的多胺進(jìn)樣，3種多胺的工作曲線見圖4。

腐胺、亞精胺、精胺的相關(guān)系數(shù)R2分別為為0.998 2，0.999 8和0.999 7。腐胺、亞精胺最低檢測(cè)限為0.3 μg/mL，精胺最低檢測(cè)限為0.4 μg/mL。腐胺、亞精胺、精胺3種多胺分別在0.3～7.5、0.4～11.3和0.3～9 μg/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系。

圖4 3種多胺標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線

3 討論與結(jié)論

植物性別和體內(nèi)多胺水平存在某種關(guān)系[15]。而且不同種類多胺在不同的植物種類或同一植物不同的器官中含量是不同的[16]。多胺的含量變化在不同育性的植物中存在一定差異，說(shuō)明多胺與雄性不育的發(fā)生存在著一定關(guān)系。在菜豆雌蕊中腐胺、亞精胺、精胺的水平分別比雄蕊高出5倍、6倍和25倍。該試驗(yàn)中，在軟棗獼猴桃始花期，雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株，雌雄株葉片中亞精胺含量無(wú)顯著差異。說(shuō)明腐胺含量的變化可能與雄花的分化有關(guān)，精胺含量的變化可能與雌花的發(fā)生與發(fā)育有一定的相關(guān)性。汪俏梅等[17]在苦瓜(MomordicacharantiaL.)性別分化研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。研究結(jié)果表明，栝樓植株在始花期階段，其內(nèi)源植物多胺的含量不同，雄株腐胺和精胺含量顯著高于雌株，雌株亞精胺含量顯著高于雄株[18]。但Rita等[19]研究結(jié)果表明，獼猴桃(Actinidiadeliciosa)雌雄花藥中多胺含量存在著差異，雄性不育的花藥中多胺的含量高于可育的花藥，尤其是植物接近開花時(shí)差異更大。Biasi等[20]研究獼猴桃生殖器官發(fā)育與多胺的關(guān)系表明，雌花比雄花含有更高的游離態(tài)多胺。多胺對(duì)高等植物性別分化的調(diào)控作用日益引起人們的重視，但研究結(jié)果還有分歧、或存在尚未開展的問(wèn)題，還需要繼續(xù)深入研究。

1) 在甲醇濃度為64%的條件下以流速V=0.6 mL/min作為分離條件效果較好。3種多胺的檢測(cè)可以得到滿意的基線分離，樣品也可在15 min內(nèi)完成檢測(cè)。

2) 雌株的腐胺、亞精胺、精胺含量分別為81.56、128.58和60.88 nmol/g。雄株的腐胺、亞精胺、精胺含量分別為362.97、153.03和30.59 nmol/g。

3) 軟棗獼猴桃始花期雄株葉片中腐胺含量顯著高于雌株，雌株葉片中精胺含量顯著高于雄株，雌雄株葉片中亞精胺含量無(wú)顯著差異。

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Determination of polyamine content in leaves of the male and female plants of Actinidia arguta by HPLC

XU Lingyue，JIANG Dan，GUO Mengyu，HUANG Yuanbo，PIAO Yilong*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

Endogenous polyamine content is related with sex development of plants. In order to identify male and female plants, contents polyamines including putrescine, spermidine polyamine and spermine in male and female plant leaves ofActinidiaargutaat the early flowering stage were determined by HPLC method. The results showed that the optimum determination condition was 37 ℃ for 25 min, chromatographic column C18 (150 mm × 4.6 mm 3μ) with column temperature 40 ℃ maintained, the mobile phase with the ratio of 64% methanol and 36% water, the flow velocity 0.6 mL/min and the detection wavelength 230 nm. At the early flowering stage ofActinidiaarguta, the putrescine content in female plant leaves was significantly higher than that in male plant leaves, the spermine content of male plant leaves was significantly higher than that in female plant leaves, whereas spermidine contents in male and female plant leaves were not significantly different.

Actinidiaarguta；male and female plants ；HPLC; polyamines；benzoylating

2016-05-12 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31160068)

徐聆粵(1992—)，女，吉林長(zhǎng)春人，在讀碩士,研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌怼阋积垶橥ㄐ抛髡撸?/p>

E-mail：piaoly@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0220-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.007

S663.4

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