付 敏，金正漢, 朱永哲*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109；2.首爾大學(xué) 農(nóng)業(yè)生命科學(xué)學(xué)院 ，韓國 首爾 151742)

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雅致小克銀漢霉菌ATCC36112對除草劑莎稗磷的降解測定

付 敏1，金正漢2, 朱永哲1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109；2.首爾大學(xué) 農(nóng)業(yè)生命科學(xué)學(xué)院 ，韓國 首爾 151742)

為利用生物降解修復(fù)莎稗磷殘留污染，以雅致小克銀漢霉菌ATCC36112為微生物對象，通過建立莎稗磷的高效液相色譜方法，探究其對莎稗磷的降解效果。結(jié)果表明:莎稗磷為0.1～50.0 mg/L時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 1，檢出限為0.1 mg/L；當(dāng)添加農(nóng)藥為5和25 mg/L時，回收率分別為93.30%和104.64%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.86 %，符合農(nóng)藥殘留的檢測要求；采用此方法測定莎稗殘留濃度，第10天時，莎稗磷殘留為0.19 mg/L，降解率在98%以上，符合一級動力學(xué)模型，方程為Ct=13.69×e-0.43 t，半衰期為1.61 d。雅致小克銀漢霉菌可以為莎稗磷殘留污染的生物修復(fù)提供適宜的菌種資源。

雅致小克銀漢霉菌ATCC36112；莎稗磷；HPLC；生物降解

莎稗磷，商品名為阿羅津(圖1)，是德國艾格福公司研制的由亞磷酸酯、硫代磷酸酯和含磷雜環(huán)有機化合物構(gòu)成的有機磷類除草劑；因其優(yōu)良的廣譜除草性能以及對雜草沒有抗性的特點而廣泛用于國內(nèi)外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如水稻、棉花、油菜或玉米田中的禾本科雜草和莎草等，特別適用于稗草為主的插秧田[1]。作為有機磷類除草劑的主要品種，莎稗磷為選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，主要通過根、胚芽鞘及幼葉吸收，抑制細胞分裂過程，導(dǎo)致雜草植株褪色，抑制生根而死亡[2]。為安全使用農(nóng)藥，日本和韓國規(guī)定了莎稗磷在糙米中的殘留限量為0.05 mg/kg，印度使用量較大，規(guī)定MRL為0.1 mg/kg，這就對分析檢測提出了更高的要求[3]。

圖1 阿羅津結(jié)構(gòu)式

盡管普遍認為除草劑的毒性較低，但其潛在危害不可忽視[4]：莎稗磷在雌雄大白鼠中蓄積系數(shù)均為4.8，屬中等蓄積，對魚類毒性很大，96 h 的耐受中限，金魚為4.6 mg/kg ，鱒魚為2.8 mg/kg[5]。同時，農(nóng)藥噴施后，超過90%的農(nóng)藥散落于土壤環(huán)境中，隨著生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)，其富集的殘留污染對人類和生態(tài)系統(tǒng)的危害不言而喻。另一方面，莎稗磷屬于硫代磷酸酯，其殘留可以通過多功能氧化酶的催化生成氧化物，最終導(dǎo)致哺乳動物中的膽堿能危象[6]。近年來，莎稗磷的研究熱點多集中在植物、環(huán)境中的消解動態(tài)或分析方法方面[7]，對其殘留降解的研究極少見報道，探究莎稗磷的殘留降解成為環(huán)境保護的一個重要課題。

多方研究表明：微生物降解是環(huán)境中農(nóng)藥殘留污染修復(fù)的核心技術(shù)[8-11]。雅致小克銀漢霉菌(CunninghamellaelegansATCC36112)，屬于霜霉目，白銹科，接合菌類，是一類絲狀真菌，由于與人體細胞色素P450具有相似的作用，所以在藥物及污染物代謝方面有很大潛力，但是在有機磷農(nóng)藥的降解中較為少見[12-15]。為利用生物降解修復(fù)環(huán)境中的阿羅津殘留污染，豐富降解有機磷農(nóng)藥的微生物資源，本研究以雅致小克銀漢霉菌ATCC36112為研究對象，探究其對莎稗磷除草劑的生物降解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 微生物 雅致小克銀漢霉菌CunninghamellaelegansATCC36112從美國模式培養(yǎng)物寄存庫(American Type Culture Collection,Manassas,USA)獲得。真菌培養(yǎng)基通常在PDA中培養(yǎng)，而相應(yīng)的液體培養(yǎng)基在PDB中實現(xiàn)，培養(yǎng)條件為27 ℃，170 r/min。

3) 儀器 高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測器，安捷倫1100系列(USA)；HM-200電子分析天平(日本A&D公司)；HK-AC60高壓滅菌鍋；VS-8480SR恒溫培養(yǎng)箱(韓國 Lab Tech公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超高速低溫離心機；機械震蕩儀；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器(金壇市榮華儀器制造有限公司)；

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

依照純度，準(zhǔn)確稱取5.1 mg (精確至0.1 mg)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈定容至5.0 mL，得到1 000 mg/L的莎稗磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃避光密封儲存。再用乙腈稀釋得到50.0,20.0,10.0,5.0,2.0, 1.0,0.5,0.2,0.1 mg/L 的莎稗磷標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，-4 ℃避光密封儲存。依次用高效液相色譜儀檢測，以農(nóng)藥含量為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值峰面積為縱坐標(biāo)，繪制農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 農(nóng)藥添加回收率試驗

向100 mL空白培養(yǎng)基中添加0.5和2.5 mg農(nóng)藥，于27 ℃，170 r/min條件下震蕩2 h；前處理方法：取5.0 mL培養(yǎng)液至50 mL具塞試管中，添加2.5 g 氯化鈉和10 mL乙腈，劇烈震蕩，取上層有機相，過無水硫酸鈉層，收集至平底燒瓶中，萃取2次，合并有機層；旋蒸至干，用5.0 mL乙腈定容，過0.2 μm聚四氟乙烯(PTFE)濾膜，待高效液相色譜檢測農(nóng)藥含量。每個水平平行處理3次。

1.2.3 微生物對農(nóng)藥降解能力的測定

將冷藏菌種接種至新鮮PDA培養(yǎng)基上，于27 ℃，170 r/min條件下培養(yǎng)2 d，然后挑取菌絲體(約2 g)接種到新鮮PDB培養(yǎng)基中(100 mL)；將2.5 mg莎稗磷添加到250 mL含微生物的PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期取樣(2 h,1 d,3 d,5 d,7 d,10 d)，按1.2.2前處理方法處理樣品，使用高效液相色譜法測定農(nóng)藥殘留濃度；分別設(shè)置只添加微生物和農(nóng)藥的處理作為對照，每個水平平行處理3次，試驗中所有培養(yǎng)基在使用前均以121 ℃滅菌處理15 min。

2.2.4 秸稈禁燒工作存在季節(jié)性和滯后性 焚燒秸稈的現(xiàn)象實則由來已久，然而卻一直未能引起政府部門的重視。近幾年由于焚燒秸稈給交通安全，人體健康帶來了許多的負面影響，從而政府開始實行嚴厲的秸稈禁燒政策。秸稈也屬于季節(jié)性產(chǎn)物，迫使禁燒政策只是在夏收、秋收季節(jié)焚燒秸稈的有效，相關(guān)配套措施也并不能真正解決農(nóng)作物秸稈露天焚燒的問題。對于在非農(nóng)忙時焚燒的現(xiàn)象管制不嚴，未能疏堵并濟從根源上解決農(nóng)作物秸稈露天焚燒的問題。僅在問題出現(xiàn)時，以片面禁止的方式去解決，不能持久有效的禁止秸稈焚燒。

1.2.4 HPLC條件

色譜柱：Kinetex C18 柱(100×2.1 mm,2.6 μm,100 A)；流動相A：水(含0.1%甲酸)溶液，B：乙腈(含0.1%甲酸)溶液；柱溫40 ℃；流速為0.2 mL/min；進樣體積為5 μL；線性梯度洗脫程序：0～1 min，5% B；1～40 min, 5%～95% B;40～45 min，95% B；45～47 min,95%～5%B;47～55 min,5% B。阿羅津在245 nm處有最大吸收，保留時間為35.979 min(圖2)。

圖2 莎稗磷標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系和檢出限

用1.2.1中系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積(y)對濃度 (x,mg/L) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，莎稗磷為0.1～50.0 mg/L時線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y=38.36 x+8.25，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 1(圖3)。按照信噪比(S/N)>3，計算檢出限(LOD)為0.1 mg/L。

圖3 莎稗磷標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 農(nóng)藥添加回收率試驗

用添加回收率來表示方法的準(zhǔn)確度，用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來衡量方法的精密度[16]。向空白培養(yǎng)基中添加0.5和2.5 mg農(nóng)藥時(按照2.2.2節(jié)前處理方法，即理論濃度分別為5 mg/L和25 mg/L)，農(nóng)藥回收率為93.30%～104.64%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.86%，其準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測要求(表1)。

表1 莎稗磷添加回收率

2.3 農(nóng)藥降解試驗

按照1.2.2和1.2.3方法，對每個處理定期取樣測定農(nóng)藥殘留含量，作為衡量微生物對農(nóng)藥降解的依據(jù)，色譜圖如圖4所示。以2 h的數(shù)據(jù)作為初始值，分別計算各個時期的殘留濃度。

結(jié)果表明：加入10 mg/L莎稗磷，降解開始時的速率要高于后期降解速率，在第3天時，莎稗磷的濃度由初始值10.12 mg/L 減少為5.39 mg/L，降解率為47.16%；第5天時，培養(yǎng)基中農(nóng)藥濃度為1.99 mg/L，降解率在80%以上；截止到第10天，莎稗磷甚至達到98.14%，幾乎完全降解，殘留濃度僅為0.19 mg/L。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.90～7.50，重現(xiàn)性良好。

圖4 莎稗磷降解實驗的HPLC色譜圖

農(nóng)藥的降解動力學(xué)分析通常采用一級降解動力學(xué)模型 Ct=C0×e-kt,式中，Ct為t時刻農(nóng)藥的殘留量(mg/L);C0為農(nóng)藥的初始濃度(mg/L)；k為降解速率常數(shù)(d-1)。農(nóng)藥的降解半衰期通過下式計算：T1/2=ln2/k，其中，T1/2為農(nóng)藥的降解半衰期；k為降解速率常數(shù)(d-1)。

試驗結(jié)果表明，莎稗磷的降解過程符合一級降解動力學(xué)模型，通過計算得出其降解速率常數(shù)為0.43，動力學(xué)方程為Ct=13.69×e-0.43 t，相關(guān)性系數(shù)為0.971 8；降解半衰期(T1/2)為1.61 d(表2,圖5)。

表2 雅致小克銀漢霉菌對莎稗磷的降解

圖5 莎稗磷的動力學(xué)降解曲線

3 討論與結(jié)論

利用高效液相色譜，建立了莎稗磷的分析方法，在此方法下，莎稗磷農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1；添加回收率試驗中，分別添加5和25 mg/L的莎稗磷，回收率為93.30%～104.64%， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.86 %，其準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

降解試驗表明，雅致小克銀漢霉菌對莎稗磷有良好的降解效果，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.90 ～ 7.50，重復(fù)性良好，實驗結(jié)果可信。降解動力學(xué)計算得出，其降解曲線方程為Ct=13.69×e-0.43 t，相關(guān)系數(shù)高,為0.971 8 ，雅致小克銀漢霉菌對有機磷農(nóng)藥顯示出明顯的降解效果。

張麗等[17]探究了阿羅津在水稻植株、稻米、土壤及田水中的殘留，結(jié)果顯示，阿羅津在稻田水、土壤和植株中的消解速率相當(dāng)快，其在水中半衰期為2.65 d，在土壤中為3.07 d，稻田水中的半衰期為3.76 d。這與本文的研究結(jié)果1.61天相比，在雅致小克銀漢霉菌作用下，莎稗磷的降解速率要高于環(huán)境中的自然消解速率。

本研究從試驗方面為環(huán)境中莎稗磷殘留污染的生物修復(fù)提供可能性，同時從降解試驗的色譜圖中可以看出明顯的未知代謝物，對此可以串聯(lián)質(zhì)譜儀和NMR進行產(chǎn)物鑒定等做進一步的研究。

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Degradation of a herbicide anilofos byCunninghamella elegans ATCC36112

FU Min1, Jeonghan Kim2, Zhu Yongzhe1*

(1.ChemistryandPharmaceuticalSciencesCollegeofQingdaoAgriculturalUniversity,QingdaoShandong266109,China;2.AgriculturalBiotechnologyDepartmentofSeoulNationalUniversity,Seoul151742,Korea)

In order to renovate anilofos residue contamination in environment through biodegradation，aimed to use theCunninghamellaelegansATCC36112 as microbial object to explore the degradation effect of anilofos with high performance liquid chromatography. Excellent linearity was achieved in the ranges 0.1～50.0 mg/L of anilofos standard solutions, with coefficients of determination of 0.999 1. Method limit of detection was 0. 1 mg/L; for recovery test, 5 and 25 mg/L of anilofos were added into blank culture, recoveries were obtained at 93.30% and 104.64%, respectively, while the corresponding RSD was less than 3.86%. The results demonstrated that the accuracy and precision of the method were in line with the requirement of pesticide residue analysis. This method has been applied to determine the degrading rate of anilofos. The degrading rate on day 10 was more than 98% while the residue concentration was 0.19 mg/L, the degradation conformed with first-order kinetic model. The equation and T1/2were Ct= 13.69 × e-0.43 tand 1.61 d, respectively. In conclusion, the straincunninghamellaelegansATCC36112 is a suitable candidate in bioremediation of anilofos residue contamination in environment.

CunninghamellaelegansATCC36112; anilofos; HPLC; biodegradation

2016-06-25 基金項目：Research Program for Agricultural Science & Technology Development (PJ012094)

付敏(1989—)，女，山東濟南人，在讀碩士，研究方向為環(huán)境中農(nóng)藥動態(tài)及農(nóng)藥殘留分析。朱永哲為通信作者，

E-mail: zhuyzh@qau.edu.cn

1004-7999(2016)03-0229-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.009

S451.21

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