王亞美, 黃麗娜, 艾新宇, 魏原杰, 劉小寧*, 高希武

(1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046；2.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，北京100193)

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棉蚜細胞色素P450CYP6J1的克隆與表達

王亞美1, 黃麗娜1, 艾新宇1, 魏原杰1, 劉小寧1*, 高希武2*

(1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046；2.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，北京100193)

為了深入了解細胞色素P450 CYP6J1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，本實驗克隆獲得了棉蚜AphisgossypiiP450CYP6J1基因，對該基因進行信息學及原核表達分析，通過SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達結(jié)果，并用Western-blot進行驗證。結(jié)果表明，P450CYP6J1序列長1 398 bp，編碼氨基酸數(shù)為465，理論分子量為53.67 kD，理論等電點為8.80。氨基酸序列分析表明該序列具有完整的開放閱讀框，且沒有信號肽。同源性分析表明，棉蚜cDNA序列推導的氨基酸與豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的保守性最為接近，一致性可達92%。在大腸桿菌EscherichiacoliBL21中表達獲得的His-CYP6J1蛋白，并用Western-blot檢測目的蛋白大小正確。這些研究結(jié)果為棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體制備提供了基礎。

棉蚜；P450CYP6J1；克??；蛋白表達

細胞色素P450(cytochrome P450，cytochrome CYPs，簡稱P450)是一類以血紅素為輔基的B族細胞色素超家族(Kubotaetal.，2009)。P450基因是一個超家族，包括CYP4、CYP6、CYP9和CYP12共48個家族(Amenyaetal.，2008)，其中CYP4(Snyder & Van Antwerpen，1998)和CYP6(Feyereisenetal.，1995；Wang & Hobbs，1995)的表達過量與昆蟲抗性品系的出現(xiàn)有關。昆蟲P450參與外源性化合物和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝解毒過程(Tan & Guo，1996)。早在20世紀就有研究表明其代謝解毒作用是多種昆蟲獲得殺蟲藥劑抗性的普遍機制(Eldefrawietal.，1960)。P450參與殺蟲劑抗藥性是由于其解毒作用的增強，表現(xiàn)為相應的P450酶活性或其表達量的增加(Scott & Wen, 2001)以及作用部位的敏感性降低(Denholm & Rowland，1992)。另外也有文獻報道稱昆蟲存在行為抗性，通過改變自身的習性和行為以逃避殺蟲劑的作用(Ahujaetal.，2010)。在所有表達系統(tǒng)中，大腸桿菌Escherichiacoli表達系統(tǒng)在蛋白質(zhì)表達方面有很多優(yōu)點，本實驗以P450 CYP6J1的異源表達為主要目標，通過融合表達(Deenietal.，2001)的技術手段建立簡單、有效的P450酶系原核表達系統(tǒng)。

棉蚜Aphisgossypii是一種多食性害蟲，繁殖能力極高，容易猖獗發(fā)生。棉蚜在我國是棉花苗期的一種重要害蟲，也是影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的一個主要因素。由于化學殺蟲劑的不科學使用造成棉蚜抗藥性的增強，對棉蚜的防治帶來了巨大的困難，而化學藥品的大規(guī)模應用會導致環(huán)境惡化和食品污染，嚴重影響人體健康(Crinnion，2009；Komareketal.，2010)，越來越不被大眾接受，同時也讓害蟲承受很高的選擇壓力(張學濤等，2012)。棉蚜抗性的發(fā)展主要與其體內(nèi)解毒酶的變化有關，這為我們調(diào)控棉蚜體內(nèi)解毒酶的表達，延緩害蟲抗藥性的發(fā)展提供新思路。因此本研究對棉蚜P450CYP6J1基因進行克隆和原核表達，并對表達的融合蛋白His-CYP6J1進行鑒定，為后期棉蚜的研究提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲、菌株和載體

棉蚜采自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市烏魯木齊縣安寧渠鎮(zhèn)，并于室內(nèi)用棉苗長期飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：室溫25 ℃，相對濕度75%，光周期(L∶D)16 h∶8 h。表達載體pET28a質(zhì)粒由本實驗室保藏，為原核表達載體，卡納(Kana)抗性?？寺【闑.coliDH5α和表達菌株E.coliBL21感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 實驗試劑與儀器

DNA Marker、Oligo d(T)18Primers、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase Hˉ)、Recombinant Ribonuclease Inhibitor、pMD19-T(simple)、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶和dNTP(10 mM)購于寶生物工程(大連)有限公司；RNA-Solv Reagent提取液為Omega Bio-tek公司產(chǎn)品，蛋白Marker購于Thermo Scientific；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、PCR回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、實驗引物合成、DNA序列測定均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；一抗鼠抗His-Tag單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；醋酸纖維素膜購自Merck Millipore；實驗引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其余所用的化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法1.3.1 棉蚜總RNA提取及cDNA合成 使用RNA-Solv Reagent提取液，約50只棉蚜用于提取總RNA。棉蚜總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外/可見分光光度計檢測總RNA的濃度(ng·μL-1)和純度(OD260/280)。當提取的RNA較純時，取1 μg總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄反應的模板，Oligo d(T)18為下游引物逆轉(zhuǎn)錄合成棉蚜cDNA。

1.3.2 棉蚜P450CYP6J1基因的克隆 根據(jù)前期得到的P450CYP6J1基因全長序列(GenBank登錄號：JN989967.1)，設計合成了P450CYP6J1 PCR擴增所需的2個引物，擴增的片段約為1 398 bp。下劃線為引入的酶切位點(BamHI和XhoI)序列：上游引物：5′-CGCGGATCCATGAAAAC-3′，下游引物：5′-CCTCGAGTTAGTTTTTTCTCTTGGTAAC-3′。以棉蚜cDNA為模板擴增P450CYP6J1基因序列。擴增反應條件為：94 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR回收試劑盒回收后與pMD19-T(simple)載體16 ℃過夜連接并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子，正確的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-CYP6J1，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3.3 棉蚜P450CYP6J1基因的生物信息學分析對獲得的棉蚜P450CYP6J1基因進行生物信息學分析，使用DNAMAN將開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，進行理論蛋白分子量、等電點的預測；利用SignalP 4.1查找信號肽；利用ExPASy(ProtScale)進行蛋白的親水性和疏水性分析；在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST分析棉蚜P450CYP6J1基因與不同物種氨基酸序列的相似性；利用MEGA 5對不同物種P450 CYP6J1氨基酸序列進行多重比對，通過鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建氨基酸的系統(tǒng)進化樹。

1.3.4 原核表達質(zhì)粒pET28a-CYP6J1的構(gòu)建 將pMD19-T-P450 CYP6J1和含His-Tag的pET28a載體分別用BamHI和XhoI進行雙酶切，P450 CYP6J1與pET28a經(jīng)回收試劑盒回收后，16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組子，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-CYP6J1，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3.5 含His-Tag的融合蛋白His-CYP6J1的表達及Western-blot鑒定 將測序結(jié)果正確的陽性克隆轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)，將菌液PCR鑒定正確的陽性克隆活化到對數(shù)期OD600=0.4～0.6后，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h后超聲破碎至相對透亮，并將上清和沉淀分開處理，以同時轉(zhuǎn)化BL21的空載體pET28a及未誘導的菌液作對照，用15% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測重組蛋白的表達。

通過Western-blot檢驗目的蛋白在BL21菌株中的正確表達。將未經(jīng)IPTG誘導的菌液及空載體pET28a和誘導的融合蛋白His-CYP6J1及空載體pET28a經(jīng)15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，使用Mini-PROTEAN 3 Trans-Blot系統(tǒng)將融合蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)沖洗3次，加入1∶3 000稀釋的抗His-Tag的抗體(一抗)，室溫孵育2 h；PBST沖洗3次后加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(二抗)，室溫孵育1 h；PBST沖洗3次后采用DAB法顯色后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜P450CYP6J1基因的克隆

用設計的特異性引物，以棉蚜cDNA為模板PCR擴增棉蚜P450CYP6J1基因后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果顯示，在約1 400 bp處有1條明顯的特異性擴增帶(圖1：A)。經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收擴增的目的基因后與pMD19-T(simple)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR篩選陽性重組子(圖1：B)，經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序后，用DNAMAN與棉蚜P450CYP6J1基因序列比對，結(jié)果一致，說明獲得的目的基因大小正確。

A B

A：M.DL2000，1.PCR擴增產(chǎn)物，2.陰性對照；B： M.DL2000，1.陰性對照, 2.重組質(zhì)粒的PCR鑒定。

A： M.DL2000, 1.PCR amplification, 2.Negative control; B： M.DL2000, 1.Negative control, 2.PCR identification of recombinant plasmid (digested products of pET28a-CYP6J1 byBamHI andXhoI).

2.2 棉蚜P450CYP6J1 cDNA序列特征

在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST進行相似性比對，分析表明所得序列為P450超家族。利用DNAMAN 6分析P450CYP6J1 cDNA序列，結(jié)果表明棉蚜P450CYP6J1基因有完整的開放閱讀框，全長1 398 bp。起始密碼自ATG至終止密碼子TAA，共編碼465個氨基酸。P450的特有結(jié)構(gòu)域，血紅素結(jié)合區(qū)：FxxGxRxCxGx，螺旋K區(qū)：ExxR，螺旋I區(qū)：(A/G)Gx(D/E)T(T/S)。理論分子量53.67 kD，理論等電點8.80(圖2)。利用MEGA 5對蚜蟲不同物種的P450氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，通過NJ法Bootstrap重復1 000次，其他參數(shù)設置均采用默認設置。結(jié)果表明，蚜蟲不同物種間P450保守區(qū)較穩(wěn)定，其中所得棉蚜cDNA序列推導的氨基酸與豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的保守性最為接近，一致性可達92%(圖3)。

2.3 棉蚜His-CYP6J1蛋白的信號肽及親水性分析

經(jīng)SignalP 4.1預測，棉蚜His-CYP6J1蛋白無信號肽序列，因此該蛋白屬包內(nèi)分泌蛋白(圖4：A)。用ExPASy ProtParam預測其總平均疏水性指數(shù)(GRAVY)為-0.249，顯示該蛋白屬親水性蛋白(圖4：B)。

2.4 原核表達質(zhì)粒pET28a-CYP6J1的構(gòu)建

P450CYP6J1經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后與原核表達載體pET28a連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒后用BamHI和XhoI雙酶切鑒定，酶切出約1 400 bp的目的條帶(圖5：A)。雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序后用DNAMAN對氨基酸序列進行分析，測序結(jié)果與棉蚜P450 CYP6J1氨基酸序列一致，說明原核表達質(zhì)粒pET28a-CYP6J1構(gòu)建成功。

2.5 含His-Tag的融合蛋白His-CYP6J1的表達及Western-blot鑒定

通過15%的SDS-PAGE檢測融合蛋白His-CYP6J1的表達顯示(圖5：B)，與誘導表達前相比，重組質(zhì)粒pET28a-CYP6J1轉(zhuǎn)化到表達菌BL21經(jīng)IPTG誘導表達后有1條蛋白質(zhì)增強條帶，表達載體分子量約為57 kD，與預期的His-CYP6J1蛋白相對分子量相似，初步說明融合蛋白His-CYP6J1誘導表達成功。菌體超聲破碎后的上清和沉淀分別處理后經(jīng)15%的SDS-PAGE檢測顯示，表達的融合蛋白實線下劃線的ATG和TAA分別表示起始密碼子和終止密碼子, 實線框表示血紅素結(jié)合區(qū), 虛線框表示螺旋Ⅰ區(qū), 虛線下劃線表示螺旋K區(qū)。

圖2 棉蚜P450CYP6J1基因的cDNA核苷酸序列及其推導的氨基酸序列

Fig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of P450CYP6J1 gene fromAphisgossypii

Solid lines underlined ATG and TAA represent initiation codon and termination codon, respectively; solid box represents the heme-binding domain, dash box represents a screw Ⅰ area, dashed line underlined represents a screw K area.

圖3 昆蟲細胞色素P450超家族系統(tǒng)進化樹

分支上數(shù)字代表從1 000次重復中得到的相應的P450分為同一分支的置信水平; 標尺顯示了對應分支上單個位點發(fā)生氨基酸位點變異的估計值。

The branch number represents from 1 000 times of the corresponding P450s, which is divided into the confidence level of the same branch; Scale shows the estimates on a single site of amino acid sites mutation.

His-CYP6J1主要存在于沉淀中，說明該蛋白屬于包涵體。

用鼠抗His-Tag單克隆抗體對IPTG誘導表達的融合蛋白做進一步驗證(圖5：C)，Western-blot檢測結(jié)果顯示經(jīng)IPTG誘導表達后與誘導表達前相比，誘導表達后有1條57 kD明顯的條帶，說明融合蛋白His-CYP6J1表達正確，為棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體制備提供了素材。

A.棉蚜His-CYP6J1蛋白的信號肽分析，B.棉蚜His-CYP6J1蛋白的親疏水性分析。

A.Signal peptide analysis of His-CYP6J1 fromA.gossypii, B.Hydrophobic analysis of His-CYP6J1 fromA.gossypii.

A B C

A.重組質(zhì)粒pET28a-CYP6J1雙酶切鑒定： M.Mark 15 000, 1.重組質(zhì)粒pET28a-CYP6J1, 2.重組質(zhì)粒pET28a-CYP6J1的雙酶切產(chǎn)物; B.蛋白His-CYP6J1的誘導表達： M.180.0 kD, 1.BL21-pET28a誘導前, 2.BL21-pET28a誘導后, 3.BL21-His-CYP6J1誘導前, 4.BL21-His-CYP6J1誘導后總蛋白, 5.BL21-His-CYP6J1誘導后上清, 6.BL21-His-CYP6J1誘導后沉淀; C.融合蛋白His-CYP6J1的Western-blot鑒定： M.180.0 kD, 1.pET28a誘導前, 2.pET28a誘導后, 3.His-CYP6J1誘導前, 4.His-CYP6J1誘導后總蛋白。

A.Double enzyme digestion of recombinant plasmid pET28a-CYP6J1： M.Mark 15 000, 1.pET28a-CYP6J1, 2.Digested products of pET28a-CYP6J1 byBamHI andXhoI; B.The induction expression of His-CYP6J1 protein： M.180.0 kD, 1.BL21-pET28a without IPTG, 2.BL21-pET28a with IPTG, 3.BL21-His-CYP6J1 without IPTG, 4.BL21-His-CYP6J1 with IPTG, 5.BL21-His-CYP6J1 supernatant with IPTG, 6.BL21-His-CYP6J1 precipitation with IPTG; C.Identification of fusion protein by Western-blot： M.180.0 kD, 1.pET28a without IPTG, 2.pET28a with IPTG, 3.His-CYP6J1 without IPTG, 4.His-CYP6J1 with IPTG.

3 討論

幾乎所有的生物都存在P450酶系，包括動物、植物、昆蟲等。一般認為昆蟲P450的各家族中CYP6和CYP4家族與殺蟲劑抗性有關(Scott & Lee，1993；Carinoetal.，1994；邱星輝等，2003)。P450氧化酶在昆蟲的生長、發(fā)育及對外源有毒物質(zhì)的脅迫下發(fā)揮重要作用。要了解生物體是通過哪些方式降解這些外源物質(zhì)的毒性，尤其是對于農(nóng)業(yè)害蟲來說，了解其解毒機制對于害蟲的治理至關重要。

本實驗為今后進一步研究P450CYP6J1基因的結(jié)構(gòu)、功能及其蛋白在分子生物學研究中的作用提供基礎資料，同時也為棉蚜的防治做鋪墊。實驗中克隆得到了棉蚜P450CYP6J1基因，并將其構(gòu)建到表達載體pET28a上，0.5 mmol·L-1的IPTG誘導表達得到了棉蚜融合蛋白His-CYP6J1，為棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體的制備提供前提條件。棉蚜P450CYP6J1基因經(jīng)生物信息學分析結(jié)果顯示，該基因的開放閱讀框長1 398 bp，且沒有信號肽，共編碼465個氨基酸，理論蛋白分子量53.67 kD，理論等電點8.80。由棉蚜P450CYP6J1基因推導的氨基酸序列經(jīng)生物信息學分析，其具有P450超家族特有的結(jié)構(gòu)域，包括血紅素結(jié)合區(qū)、螺旋K區(qū)、螺旋I區(qū)，這與文獻報道的一致(賀麗虹等，2008；Liuetal.，2013)。同源性比對分析表明，所得棉蚜cDNA序列推導的氨基酸與豌豆蚜的保守性最為接近，一致性可達92%。

為進一步了解融合蛋白His-CYP6J1的特性，將克隆得到的P450CYP6J1基因與表達載體pET28a進行連接，構(gòu)建了棉蚜pET28a-CYP6J1重組表達質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21中，用IPTG誘導表達融合蛋白His-CYP6J1。由于pET28a上帶有6個His-Tag，它是最常用的純化蛋白的融合標簽，具有分子量相對小、不影響目的蛋白功能、免疫原性相對較低、成本低等優(yōu)點(Graslundetal.，2008；Uchinomiyaetal.，2013)，因此為我們后續(xù)實驗利用親和層析法純化目的蛋白提供素材。

賀麗虹, 趙淑娟, 胡之璧. 2008. 植物細胞色素P450基因與功能研究進展[J]. 藥物生物技術, 15(2): 142-147.

邱星輝, 何鳳琴, 李梅. 2003. 細胞色素P450介導的昆蟲抗藥性[J]. 生命的化學, 23(4): 279-281.

張學濤, 柳建偉, 李芬, 等. 2012. 北疆地區(qū)棉蚜對不同殺蟲劑敏感度水平測定[J]. 植物保護, 38(2): 163-166.

Ahuja I, Rohloff J, Bones AM. 2010. Defence mechanisms of Brassicaceae: implications for plant-insect interactions and potential for integrated pest management. A review[J]. Agronomy for Sustainable Development, 30(2): 311-348.

Amenya DA, Naguran R, Lo TC,etal. 2008. Over expression of a cytochrom P450 (CYP6P9) in major African malaria vector,Anophelesfunestus, resistant to pyrethroids[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 17(1): 19-25.

Carino FA, Koener JF, Plapp Jr. FW,etal. 1994. Constitutive overexpression of the cytochrome P450 gene CYP6A1 in a house fly strain with metabolic resistance to insecticides[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 24(4): 411-418.

Crinnion WJ. 2009. Chlorinated pesticides: threats to health and importance of detection[J]. Alternative Medicine Review, 14: 347-359.

Deeni YY, Paine MJ, Ayrton AD,etal. 2001. Expression, purification, and biochemical characterization of a human cytochrome P450 CYP2D6-NADPH cytochrome P450 reductase fusion protein[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 396(1): 16-24.

Denholm I, Rowland MW. 1992. Tactics for managing pesticide resistance in arthropods: theory and practice[J]. Annual Review of Entomology, 37(1): 91-112.

Eldefrawi ME, Miskus R, Sutcher V. 1960. Methylenedioxyphenyl derivatives as synergists for carbamate insecticides on susceptible, DDT and parathion-resistant house flies[J]. Economic Entomology, (53): 231-234.

Feyereisen R, Andersen JF, Carino FA,etal. 1995. Cytochrome-P450 in the house-fly-structure, catalyticactivity and regulation of expression ofCyp6a1 in an insecticide-resistant strain[J]. Pesticide Science, 43: 233-239.

Graslund S, Nordlund P, Weigelt J,etal. 2008. Protein production and purification[J]. Nature Methods, 5(2): 135-146.

Komarek M, Cadkova E, Chrastny V,etal. 2010. Contamination of vineyard soils with fungicides: a review of environmental and toxicological aspects[J]. Environment International, 36: 138-151.

Kubota A, Kim EY, Jwata H. 2009. Alkoxyresorufin (methoxy-, ethoxy-, pentoxy- and bexzyloxyresorufin 0-dealkylase activities by in vitro-expressed cytochrome P450 1A4 and 1A5 from common cormorant (Phalacrocoraxcarbo)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 149: 544-551.

Liu XN, Zhang L, Zhang XT,etal. 2013. Molecular cloning and recombinant expression of cytochrome P450 CYP6B6 fromHelicoverpaarmigerainEscherichiacoli[J]. Molecular Biology Reports, 40: 1211-1217.

Scott JG, Lee SST. 1993. Purification and characterization of a cytochrome P450 from insecticide susceptible and resistant strains of housefly,MuscadomesticaL., before and after phenobarbital exposure[J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 24(1): 1-19.

Scott JG, Wen Z. 2001. Cytochromes P450 of insects: the tip of the iceberg[J]. Pest Management Science, 57(10): 958-967.

Snyder MJ, Van Antwerpen. 1998. Evidence for a diazepam-binding inhibitor (DBI) benzodiazepine receptor-like mechanism in ecdysteroidogenesis by the insect prothoracic gland[J]. Cell Tissue Research, 294: 161-168.

Tan W,Guo Y. 1996. Effects of host plant on susceptibility to deltamethrin and detoxification enzyme ofHeliothisarmigera(Lepidoptera: Noctuidea)[J]. Economic Entomology, 86: 11-14.

Uchinomiya S, Nonaka H, Wakayama S,etal. 2013. In-cell covalent labeling of reactive His-tag fused proteins[J]. Chemical Communications, 49: 5022-5024.

Wang XP, Hobbs AA. 1995. Isolation and sequence analysis of a cDNA clone for a pyrethroidinducible cytochrome P450 fromHelicoverpaarmigera[J]. Insect Biochemisry and Molecular Biology, 25(9): 1001-1009.

Cloning and Expression of Cytochrome P450CYP6J1 fromAphisgossypii

WANG Yamei1, HUANG Lina1, AI Xinyu1, WEI Yuanjie1, LIU Xiaoning1*, GAO Xiwu2*

(1.College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Urumqi 830046, China; 2.College of Agronomy and Biotechnology,China Agricultural University, Beijing 100193, China)

In order to understand the structure and function of cytochrome P450 CYP6J1 protein, P450CYP6J1 gene from cotton aphid (Aphisgossypii) was cloned and analyzed using bioinformatic method.P450 CYP6J1 protein was first expressed in prokaryotic, followed by SDS-PAGE and Western-blot detection.The results showed that the length of open reading frame region was 1 398 bp, encoding 465 amino acids residues with the predicted molecular weight of 53.67 kD and isoelectric point of 8.80.Amino acid sequence analysis showed that P450 CYP6J1 protein had no signal peptide.Homology analysis showed that the amino acids of P450 CYP6J1 ofA.gossypiiwas similar with that of pea aphid (Acyrthosiphonpisum) (homologous similarity 92%).The His-CYP6J1 protein was obtained after being expressed inEscherichiacoliBL21, and the target protein was proved by Western-blot.These results provided a foundation for preparation of P450 CYP6J1 polyclonal antibody fromA.gossypii.

Aphisgossypii; P450CYP6J1; cloning; protein expression

2015-12-08 接受日期：2016-01-30 基金項目：國家自然科學基金項目(31330064, 31471781)

王亞美(1990—), 碩士研究生, 研究方向： 生化與分子生物學, E-mail：wangyamei0114@sina.com

*通信作者Corresponding author，博士, 研究方向： 農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治, E-mail：liuxn0103@sina.com; gaoxiwu@263.net.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20150393

Q78; Q969.35

A

1000-7083(2016)03-0378-06