黃姍芬，李云亮，楊 雪，王禹程，馬海樂(lè)

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

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脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠免疫功能的影響

黃姍芬，李云亮，楊 雪，王禹程，馬海樂(lè)*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

[目的]研究脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠免疫功能的影響。[方法]試驗(yàn)組以低、中、高劑量組0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)的脫毒菜籽多肽灌胃小鼠，對(duì)照組以等體積純凈水灌胃，30 d后進(jìn)行二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、ConA 誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和血清溶血素測(cè)定試驗(yàn)、小鼠碳廓清試驗(yàn)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測(cè)定試驗(yàn)、試驗(yàn)前后小鼠體重以及臟器/體重比值試驗(yàn)。[結(jié)果]脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠的耳廓腫脹、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、吞噬指數(shù)a和NK細(xì)胞活性均有顯著影響，但對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、脾抗體生成細(xì)胞量、血清溶血素水平和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力均無(wú)影響。[結(jié)論]脫毒菜籽多肽具有增強(qiáng)免疫力的功能。

脫毒菜籽；多肽；鼠；免疫功能；影響

我國(guó)的油菜籽資源豐富，產(chǎn)量位居世界第一，油菜籽年產(chǎn)量高達(dá)1 300萬(wàn)t以上。菜籽粕是油菜籽經(jīng)榨油后剩下的副產(chǎn)物，菜籽粕中蛋白含量高達(dá)35%～45%[1]，氨基酸含量豐富且組成較均衡，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，但菜籽粕中含有大量的硫苷、芥酸等有毒有害物質(zhì)，極大地限制其利用程度。目前大多先對(duì)菜籽粕進(jìn)行脫毒處理[2]，經(jīng)脫毒后的菜籽粕，無(wú)論是生物效價(jià)還是利用率均很高，是一種非常優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。近年來(lái)，為促進(jìn)脫毒菜籽蛋白高值化利用，采用酶解法制備菜籽功能性多肽已成為研究熱點(diǎn)問(wèn)題之一[3-6]。大量研究表明，菜籽多肽具有降血壓[7-11]、抗氧化[12-16]、抗腫瘤[17-18]、提高免疫力[19]等功效。

免疫力是人體的防御機(jī)制，是人體抵抗外來(lái)疾病的關(guān)卡。人體通過(guò)免疫系統(tǒng)識(shí)別自身和異己物質(zhì)，并破壞和排斥異己的物質(zhì)，以維持健康。人體免疫力低下，容易感染細(xì)菌、病毒和真菌，導(dǎo)致患病。免疫力低下的癥狀通常不易被人們察覺(jué)，但它卻會(huì)嚴(yán)重威脅人體健康。目前對(duì)于菜籽多肽增強(qiáng)免疫功能的研究較少[20]，且大多數(shù)文獻(xiàn)關(guān)于菜籽多肽對(duì)免疫功能影響的研究不透徹[18，21]。筆者以脫毒菜籽多肽灌胃小鼠，研究試驗(yàn)前后動(dòng)物體重、臟器/體重比值、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫，探索菜籽多肽對(duì)小鼠免疫功能的影響，為菜籽多肽高值化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品與試劑。脫毒菜籽多肽購(gòu)自江蘇天琦生物科技有限公司，多肽含量≥85%。小牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、四氮唑藍(lán)(MTT)、2-硫基乙醇(2-ME)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)均購(gòu)自Sigma試劑公司。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。MSS全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)熱電·芬蘭雷勃(Thermo Labsystems Co)；SPX-250B生化培養(yǎng)箱，常州國(guó)華電器有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)施。選用上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的18.0～22.0 g健康雌性清潔級(jí)ICR小鼠[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002號(hào)]。全部動(dòng)物均給予滅菌鼠飼料和滅菌水自由取用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 受試物和脫毒菜籽多肽劑量設(shè)計(jì)。

1.2.1.1 動(dòng)物分組試驗(yàn)。分批按體重隨機(jī)分為4組試驗(yàn)：①二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)；②抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和血清溶血素測(cè)定試驗(yàn)；③小鼠碳廓清試驗(yàn)；④小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。

1.2.1.2 劑量設(shè)計(jì)。成人(按60 kg體重計(jì))每日推薦攝入量為4 g，相當(dāng)于0.066 7 g/(kg·d)。試驗(yàn)按低、中、高設(shè)置0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)3個(gè)劑量組，分別相當(dāng)于人體推薦量的5、10和30倍。溶劑對(duì)照組以等體積純凈水灌胃。

1.2.1.3 受試物的前處理。稱取樣品3.34、6.67和20.00 g，分別加純凈水至200 mL配制成各組受試液(存放于4 ℃冰箱，每2 d配制1次)。各組小鼠以0.02 g/(kg·d)的灌胃容積，連續(xù)經(jīng)口灌胃30 d后測(cè)其各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1.2.2 體重及臟器指數(shù)試驗(yàn)。

1.2.2.1 體重測(cè)定。稱量受試物經(jīng)灌胃脫毒菜籽多肽前后的體重。

1.2.2.2 臟器指數(shù)。參照白玉[22]的方法檢測(cè)受試物的臟器/體重比值(胸腺指數(shù)和脾指數(shù))。

1.2.3 細(xì)胞免疫功能試驗(yàn)。

1.2.3.1 二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。參照葛飛等[23]的方法略有改動(dòng)。采用1% DNFB丙酮麻油溶液涂抹受試物耳廓，使其致敏。

1.2.3.2 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。采用MTT測(cè)定法[22]，略有改動(dòng)。用于顯色測(cè)定受試物脾淋巴細(xì)胞的增殖數(shù)量。

1.2.4 體液免疫功能試驗(yàn)。

1.2.4.1 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)。采用Jerne改良載片測(cè)定法[24]。通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射SRBC，刺激其脾細(xì)胞產(chǎn)生SRBC抗體，將該脾細(xì)胞與SRBC進(jìn)行溶血空斑試驗(yàn)，并計(jì)算溶血空斑數(shù)。

1.2.4.2 血清溶血素測(cè)定。采用半數(shù)溶血值(HC50)測(cè)定法[23]，略有改動(dòng)，其中以SA緩沖液代替血清設(shè)為對(duì)照。通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射SRBC，使其血清產(chǎn)生SRBC抗體，其血清與SRBC發(fā)生溶血反應(yīng)，并釋放血紅蛋白，檢測(cè)其半數(shù)溶血時(shí)的光密度值。

1.2.5 非特異性免疫功能試驗(yàn)。

1.2.5.1 小鼠碳廓清試驗(yàn)。參照白玉[22]的方法略有改動(dòng)，其中印度墨汁∶生理鹽水調(diào)整為1∶7(V/V)。在一定濃度范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒被清除的速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。從小鼠尾靜脈注射墨汁，2和10 min后分別測(cè)其血液的光密度值。

1.2.5.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。采用滴片法[24]。通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射SRBC，激活巨噬細(xì)胞，取出該細(xì)胞后與雞紅細(xì)胞反應(yīng)，經(jīng)染色后用顯微鏡觀察平均每個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

1.2.5.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定。參照白玉[22]的方法略有改動(dòng)。其中靶細(xì)胞最大釋放孔加2.5% Triton。通過(guò)脾細(xì)胞懸液與靶細(xì)胞反應(yīng)，釋放乳酸脫氫酶，發(fā)生顯色反應(yīng)，檢測(cè)其光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠體重的影響(表1) 5組免疫試驗(yàn)結(jié)束后，各劑量組小鼠體重均有所增長(zhǎng)，但小鼠體重的增長(zhǎng)均與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明低、中、高劑量脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠體重的增長(zhǎng)無(wú)明顯作用。

表1 脫毒菜籽多肽對(duì)每組免疫試驗(yàn)前后小鼠體重的影響

2.2 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響(表2) 各劑量組小鼠與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明低、中、高劑量脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠的機(jī)體免疫器官的增重?zé)o明顯作用。

2.3 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響 遲發(fā)型超敏反應(yīng)是以單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織細(xì)胞損傷為主要特征的細(xì)胞免疫反應(yīng)[25]。由表3可見(jiàn)，各劑量組小鼠耳廓腫脹程度均高于溶劑對(duì)照組，且低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹程度與溶劑對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.01，P<0.05)，表明低、中、高劑量脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠細(xì)胞免疫具有增強(qiáng)作用。

2.4 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 從表4可看出，各劑量組光密度差值均高于溶劑對(duì)照組，僅低劑量組小鼠光密度差值與溶劑對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)，表明低劑量脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞具有增殖作用。

表2 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響

Table 2 Effect of detoxified rapeseed peptides on viscera/body weight ratio of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只脾臟/體重比值Spleen/bodyweightratio胸腺/體重比值Thymus/bodyweightratio對(duì)照組CK1040.86±7.9921.47±6.84低劑量組Lowdosegroup1039.28±5.1920.15±2.95中劑量組Mediumdosegroup1041.35±8.4220.65±2.99高劑量組Highdosegroup1039.08±6.4122.93±4.57

表3 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響

Table 3 Effect of detoxified rapeseed peptides onpinna delayed hypersensitivity of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只腫脹度Swellingdegreemg對(duì)照組CK1014.84±5.88低劑量組Lowdosegroup1023.41±4.98**中劑量組Mediumdosegroup1019.57±3.63*高劑量組Highdosegroup1019.68±5.61*

注：*、**分別表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：*，* * showed significant differences(P< 0.05)and extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group，respectively.

表4 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

Table 4 Effect of detoxified rapeseed peptides on spleen lymphocyte blastogenesis of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals只光密度值Opticaldensityvalue-ConA+ConA光密度差Opticaldensitydifference對(duì)照組CK100.177±0.0270.457±0.1160.280±0.107低劑量組Lowdosegroup100.202±0.0220.630±0.1090.428±0.100**中劑量組Mediumdosegroup100.187±0.0260.532±0.0910.345±0.086高劑量組Highdosegroup100.196±0.0200.545±0.1190.349±0.109

注：**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

Note：** showed extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group.

2.5 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量的影響 成熟的B細(xì)胞定居于脾臟，B細(xì)胞在抗原刺激下分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成和分泌抗體，主要執(zhí)行機(jī)體的體液免疫。由表5可見(jiàn)，各劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)均高于溶劑對(duì)照組，但與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠的體液免疫(抗原直接作用B細(xì)胞產(chǎn)生抗體)無(wú)促進(jìn)作用。

表5 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞量的影響

Table 5 Effect of detoxified rapeseed peptides on cells production of antibody of mouse spleen

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只空斑數(shù)∥×106脾細(xì)胞Plaquenumber∥×106Spleencells對(duì)照組CK10423.9±97.8低劑量組Lowdosegroup10498.7±152.3中劑量組Mediumdosegroup10476.3±157.4高劑量組Highdosegroup10496.9±131.2

2.6 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響 SRBC刺激T細(xì)胞的活化增殖，在T細(xì)胞的輔助下，B細(xì)胞活化分泌抗體[26]。從表6可看出，各劑量組小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)與溶劑對(duì)照組相比，均無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠的體液免疫(抗原作用T細(xì)胞，刺激B細(xì)胞間接產(chǎn)生抗體)無(wú)促進(jìn)作用。

表6 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

Table 6 Effect of detoxified rapeseed peptides on serum hemolysin level of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只HC50對(duì)照組CK10165.63±6.06低劑量組Lowdosegroup10167.91±1.89中劑量組Mediumdosegroup10168.02±1.26高劑量組Highdosegroup10166.96±2.09

2.7 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠碳廓清的影響 表7顯示，各劑量組小鼠吞噬指數(shù)a均高于溶劑對(duì)照組，低、中劑量組小鼠的吞噬指數(shù)a與溶劑對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01，P<0.05)。表明低、中劑量脫毒菜籽多肽對(duì)血液中的非特異性免疫具有促進(jìn)作用。

表7 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠碳廓清的影響

Table 7 Effect of detoxified rapeseed peptides on carbon clearance of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只吞噬速率(K值)Phagocyticrate吞噬指數(shù)aPhagocyticindexa對(duì)照組CK100.0376±0.01245.983±0.612低劑量組Lowdosegroup100.0485±0.01046.830±0.620**中劑量組Medi-umdosegroup100.0331±0.00656.567±0.514*高劑量組Highdosegroup100.0454±0.00796.326±0.527

注：*、**分別表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：*，** showed significant differences(P< 0.05)and extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group，respectively.

2.8 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響 從表8可以看出，各劑量組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)均高于溶劑對(duì)照組，但與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。表明脫毒菜籽多肽對(duì)組織液中的非特異性免疫無(wú)明顯促進(jìn)作用。

表8 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

Table 8 Effect of detoxified rapeseed peptides on the function peritoneal macrophage phagocytosis of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只吞噬率Phagocyticrate∥%吞噬指數(shù)Phagocyticindex對(duì)照組CK1014.0±3.00.184±0.032低劑量組Lowdosegroup1014.5±2.70.185±0.040中劑量組Mediumdosegroup1015.4±2.70.207±0.044高劑量組Highdosegroup1015.8±2.40.204±0.044

2.9 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響 從表9可看出，低劑量組小鼠NK細(xì)胞活性最高，且與溶劑對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，表明低劑量脫毒菜籽多肽對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性有促進(jìn)作用。

表9 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

Table 9 Effect of detoxified rapeseed peptides on NK cell activity of mouse

組別Group動(dòng)物數(shù)Numberofanimals∥只NK細(xì)胞活性NKcellactivity%對(duì)照組CK1040.2±5.5低劑量組Lowdosegroup1051.7±13.1*中劑量組Mediumdosegroup1038.5±9.7高劑量組Highdosegroup1041.2±9.9

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

Note：*showed significant differences(P< 0.05)compared with control group.

3 小結(jié)

該研究以脫毒菜籽多肽灌胃小鼠，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)前后動(dòng)物體重、臟器/體重比值、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫的研究，探索菜籽多肽對(duì)小鼠免疫功能的影響。結(jié)果表明，經(jīng)口給予0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)菜籽多肽，灌胃30 d后，各劑量組菜籽多肽對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、抗體生成細(xì)胞數(shù)量、血清溶血素水平均無(wú)影響，但能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率、耳廓腫脹程度、單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性。根據(jù)保健食品增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，菜籽多肽能有效增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫力。

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Effect of Detoxified Rapeseed Peptides on Mouse Immune Function

HUANG Shan-fen, LI Yun-liang, YANG Xue, MA Hai-le*et al

(School of Food and Biology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013)

[Objective] The research aimed to study the effect of detoxified rapeseed peptides on immune function. [Method]Low-, medium- and high-dosage group were fed with 0.334, 0.667 and 2.000 g/(kg·d)detoxified rapeseed peptides, respectively, equal volume of pure water as control group. 30 days later, the following experiments were conducted: DNFB induced mouse delayed type hypersensitivity,mouse spleen lymphocyte transformation capacity induced by ConA,antibody forming spleen cells,serum hemolysin,mouse carbon clearance ability,mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes,NK cell activity,initial and terminal body weight of mice,viscera/body weight ratio.[Result]The detoxified rapeseed peptides on mouse carbon clearance ability, spleen lymphocyte transformation capacity, phagocytic index a and NK cell activity had significant impact. However rapeseed peptides had no significant effect on mouse weight gain, the thymus/body weight ratio, spleen/body weight ratio,cells production of spleen antibody, serum hemolysin leveland function of peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes.[Conclusion]The detoxified rapeseed peptides have effect on enhancing immunity.

Detoxified rapeseed; Peptides; Mouse; Immune function; Effect

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102203)；江蘇大學(xué)高級(jí)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(16JDG049)。

黃姍芬(1992-)，女，湖南郴州人，研究方向：多肽提取及功能評(píng)價(jià)。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事功能食品、食品物理學(xué)加工方法及裝備的開(kāi)發(fā)研究。

2016-08-31

S 565.4

A

0517-6611(2016)31-0126-03