曹宗喜，焦培榮，譚樹義，葉保國，亓文寶，張桂紅*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南?？?571100；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室/國家生豬種業(yè)工程中心，廣東廣州 510642)

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研究論文

基于DNA-launched的豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立

曹宗喜1,2，焦培榮2，譚樹義1，葉保國1，亓文寶2，張桂紅2*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南?？?571100；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室/國家生豬種業(yè)工程中心，廣東廣州 510642)

為構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)反向遺傳操作系統(tǒng)，將PRRSV全基因組分6段克隆，構(gòu)建獲得6個重組質(zhì)粒，先由A1和A2片段或B1和B2片段連接構(gòu)成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亞克隆入pOKq載體。在基因組5′端和3′端分別加上CMV啟動子序列和BGH終止信號肽，全基因組510位核苷酸突變引入遺傳標記位點FseⅠ。測序正確的全基因組質(zhì)粒命名為pOK-A2BCD。再將pOK-A2BCD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，拯救病毒通過PCR、酶切、測序和間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定，結(jié)果表明拯救病毒成功，為進一步研究PRRSV致病性等相關分子機制奠定了基礎。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；反向遺傳操作系統(tǒng)；構(gòu)建

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染豬所致的一種急性傳染病。該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙，各年齡階段豬呼吸道癥狀，哺乳仔豬高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征[1-2]，是目前嚴重危害我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)最重要傳染病。而高致病性PRRSV 2006年在我國首次出現(xiàn)，造成嚴重經(jīng)濟損失[3-4]，其致病能力顯著增強現(xiàn)象引起高度關注。

根據(jù)轉(zhuǎn)染的核酸不同，反向遺傳操作平臺可以分為基于RNA-launched和基于DNA-launched兩種?；赗NA-launched的反向遺傳操作平臺是RNA病毒基因組先經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄成為病毒cDNA，接著克隆到合適的轉(zhuǎn)錄載體上，克隆到T7或SP6轉(zhuǎn)錄啟動子下游，在體外轉(zhuǎn)錄合成病毒的基因組RNA，然后再將這些體外轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染宿主細胞，使之在宿主細胞內(nèi)包裝形成具有感染性的病毒粒子，最后從細胞培養(yǎng)物中回收病毒，得到感染性分子克隆?；贒NA-launched的反向遺傳操作平臺是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA克隆到表達載體上獲得具有感染性的cDNA，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成具有感染性的病毒RNA，獲得重組病毒。與基于RNA-launched的方法相比，基于DNA-launched的拯救效率高10倍～50倍，且繞過RNA體外轉(zhuǎn)錄這一步驟，使得拯救病毒的過程大大減低了成本和節(jié)省了時間。

目前，反向遺傳技術在PRRSV的研究中已廣泛應用，對病毒蛋白功能、病毒致弱作用、基因缺失標記疫苗等研究產(chǎn)生巨大的推動作用[5-10]。雖然本課題組已構(gòu)建了基于RNA-launched的反向遺傳操作平臺[11]，但此平臺存在著操作要求嚴格，成本高等不利之處，因此試圖建立基于DNA-launched的感染性克隆。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、質(zhì)粒、毒株 由pOK12 改造具有多克隆位點的低拷貝載體pOKq、PRRSV XH-GD株病毒和其分段基因組質(zhì)粒pJET-A1(q)、pJET-A2(q)、pOK-B(q)、pJET-C(q)和pJET-D(q)由華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部新獸藥研制重點實驗室保存。

1.1.2 試劑 Platinum pfx DNA聚合酶和lipofectamine 2 000為Invitrogen 公司產(chǎn)品；CloneJET PCR Cloning Kit購自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ、AflⅡ、BamHⅠ、Hind Ⅲ、KpnⅠ均為NEB公司產(chǎn)品；EZNA TM Gel Extraction Kit和EZNA TM Plasmid Mini Kit購自Omega公司；Endo Free plasmid Maxi kits購自QIAGEN公司；抗PRRSV N蛋白單克隆抗體(MAb)由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所童光志研究員惠贈。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建策略 PRRSV全長cDNA的構(gòu)建見圖1，先由A1和A2片段或B1和B2片段連接構(gòu)成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亞克隆入pOKq載體。根據(jù)這一構(gòu)思設計引物：以pcDNA3.1-myc-His為模板，設計引物擴增CMV基因和BGH基因；以PRRSV XH-GD株的全基因組序列和本實驗室保存的PRRSV XH-GD株分段基因組質(zhì)粒pJET-A1(q)和pJET-D(q)的序列為模板[11]，設計D片段的回復突變引物，將RNA-launched的反向遺傳操作平臺引入的遺傳標記NotⅠ突變回來；同時設計A1片段的引物在PRRSV全基因組510位核苷酸突變引入遺傳標記FseⅠ。為了便于區(qū)分拯救病毒和親本毒，基于引入的遺傳標記設計1對鑒定引物(表1)，由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。

1.2.2 融合CMV啟動子的A1片段基因的擴增 以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物CMV-F和CMV-R對CMV基因進行PCR擴增。以PRRSV分段基因組質(zhì)粒pJET-A1(q)為模板，用引物A1a-F2和A1a-R或A1b-F和A1b-R分別對A1片段基因進行定點突變PCR擴增得到A1a片段或A1b片段。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測和回收純化。以得到的CMV片段、A1a片段和A1b片段為模板，用引物CMV-F和A1b-R對融合CMV啟動子的A1片段基因進行融合PCR擴增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測和回收純化。

圖1 PRRSV全長cDNA的構(gòu)建策略

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')擴增片段大小/bpAmplifyinglengthCMV-FCMV-RAGTCgcggccgcCGATGTACGGGCCAGATATACTCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC717A1a-F2A1a-RCGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCCATGACGTATAGGTGTTGGCTCGCCGGCCCTGTAGATTTCAGCTGCG545A1b-FA1b-RGAAATCTACAGGGCCGGCCAACTTACAGGTGCAGGCGTGTGAGGTAACATC2961Da-FDa-RCAGGTGTTTGCCATTTTCCCAACCCCTGGCCCTAGCAGTCGGCCGCGAC1818Db-FDb-RGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCggatgcccaggtcggaccacggggaggtggagatgccatgccgaccTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT1014BGH-FBGH-RacctgggcatccgaaggaggacggacgtccactcggatggctaagggagtgcGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTAGTCggtaccCAGAAGCCATAGAGCCCAC298Det-FDet-RCTGAGCTTGGGGTGCTGATGGCGAATTTCTTTGTACTG743pJET+pJET-AACTTGGAGCAGGTTCCATTCTTAATATACAGCCTGAAAATC254空載體BlankvectorpOK+pOK-TCAGGCGTGGAATGAGACAAACAAGCTCATTCGCCATTCAGGCT485空載體Blankvector

1.2.3 融合BGH終止信號肽的D片段基因的擴增 以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物BGH-F和BGH-R對BGH基因進行PCR擴增。以PRRSV分段基因組質(zhì)粒pJET-D(q)為模板，用引物Da-F和Da-R或Db-F和Db-R分別對D片段基因進行定點突變PCR擴增得到Da片段或Db片段PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測和回收純化。以Da片段、Db片段和BGH片段為模板，用引物Da-F和BGH-R對融合BGH終止信號肽的D片段基因進行融合PCR擴增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測和回收純化。

1.2.4 質(zhì)粒pJET-A1和pJET-D的構(gòu)建 將1.2.2和1.2.3得到的PCR純化產(chǎn)物分別與pJET1.2/blunt載體連接。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后，用滅菌牙簽挑取可疑菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)4 h～6 h，取適量菌液進行PCR鑒定。PCR鑒定的陽性重組菌液送上海英濰捷基生物技術有限公司測序進一步驗證，測序正確的重組質(zhì)粒命名分別為pJET-A1和pJET-D。

1.2.5 PRRSV全長cDNA的構(gòu)建 先由A1和A2片段或B1和B2片段連接構(gòu)成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亞克隆入pOKq載體(圖1)。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定。鑒定陽性的重組菌液送上海英濰捷基生物技術有限公司測序進一步驗證，測序正確的重組質(zhì)粒命名分別為pOK-A2BCD。

1.2.6 病毒拯救 將質(zhì)粒pOK-A2BCD轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72 h，凍融3次，4℃、7 000 r/min離心7 min，取上清，接種Marc-145細胞，連續(xù)傳12代。拯救的病毒命名為rXH-GD。

1.2.7 拯救病毒的鑒定 取第3代的病毒細胞培養(yǎng)物懸液進行RNA的提取和DNaseⅠ消化，再取2 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板，Det-F和Det-R為引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測和回收純化。將純化后的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物技術有限公司測序鑒定，同時進行FseⅠ酶切鑒定。

將質(zhì)粒pOK-A2BCD轉(zhuǎn)染BHK-21細胞72 h后，分別以鼠抗PRRSV N蛋白單克隆抗體和Anti-Mouse IgG/DyLight488為一抗和二抗，參考曹宗喜等[12]的方法進行IFA檢測。

1.2.8 拯救病毒的穩(wěn)定性 將1.2.6得到的病毒，選擇第1、3、6、9和12代病毒進行TCID50測定。

1.2.9 拯救病毒的生長曲線 測定rXH-GD 第3代病毒和親本毒XH-GD第8代病毒的生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 融合CMV啟動子的A1片段基因的擴增

以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物CMV-F和CMV-R對CMV基因進行PCR擴增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見相應的目的條帶，CMV基因的擴增產(chǎn)物長度約為720 bp，與預期大小相符(圖2A)。以質(zhì)粒pJET-A1(q)為模板，用引物A1a-F2和A1a-R或A1b-F和A1b-R分別對A1片段基因進行定點突變PCR擴增得到A1a片段或A1b片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見相應的目的條帶，分別約為0.5 kb和3.0 kb的擴增產(chǎn)物，與預期大小相符(圖2B)。以得到的CMV片段、A1a片段和A1b片段為模板，用引物CMV-F和A1b-R對融合CMV啟動子的A1片段基因進行融合PCR擴增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見約為4.2 kb的擴增片段，與預期大小相符(圖2D)。

2.2 融合BGH終止信號肽的D片段基因的擴增

以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物BGH-F和BGH-R對BGH基因進行PCR擴增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見相應的目的條帶， BGH基因的擴增產(chǎn)物長度約為300 bp，與預期大小相符(圖2A)。以PRRSV分段基因組質(zhì)粒pJET-D(q)為模板，用引物Da-F和Da-R或Db-F和Db-R分別對D片段基因進行定點突變PCR擴增得到Da片段或Db片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見相應的目的條帶，分別約為1.8 kb和1.0 kb的擴增產(chǎn)物，與預期大小相符(圖2C)。以得到的BGH片段、Da片段和Db片段為模板，用引物Da-F和BGH-R對融合BGH終止信號肽的D片段基因進行融合PCR擴增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見約為3.1 kb的擴增片段，與預期大小相符(圖2D)。

2.3 pOK-A2BCD質(zhì)粒的鑒定

以CMV-F和CMV-R、BGH-F和BGH-R為引物進行PCR鑒定pOK-A2BCD質(zhì)粒。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見約為720 bp或300 bp的擴增片段，與預期大小相符(圖3A)。同時，進行NotⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，可見約為10.6 kb的片段(載體pOKq和PRRSV B1部分片段、C片段、D片段的雙酶切條帶)、4.1 kb的片段(PRRSV A1片段的雙酶切條帶)和3.5 kb的片段(PRRSV A2片段和B1部分片段的限制性內(nèi)切酶XhoⅠ雙切條帶)，與預期大小相符(圖3B)。鑒定陽性的重組菌液送上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序進一步驗證，測序正確的重組質(zhì)粒命名分別為pOK-A2BCD。

A.CMV和BGH基因PCR擴增圖。M.DNA 標準DL 2 000；1.CMV擴增產(chǎn)物；2.BGH擴增產(chǎn)物；3.以水為模板的陰性對照。B.A1片段基因引入遺傳標記的PCR擴增圖。M1.DNA標準DL 2 000；M2.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.A1a擴增產(chǎn)物；2.A1b擴增產(chǎn)物。C.D片段基因恢復突變的PCR擴增圖。M.DNA標準DL 2 000；1.Da擴增產(chǎn)物；2.Db擴增產(chǎn)物；3.以水為模板的陰性對照。D.融合PCR擴增圖。M.λ-EcoT14 I digest DNA 標準；1.CMV和A1融合PCR擴增產(chǎn)物；2.以水為模板的陰性對照；3.D和BGH融合PCR擴增產(chǎn)物；4.以水為模板的陰性對照

A.PCR amplification of CMV and BGH genes.M.DNA Marker DL 2 000；1.CMV PCR products；2.BGH PCR products；3.Negative control.B.PCR amplification of A1 fragment of PRRSV.M1.DNA Marker DL 2 000；M2.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.Amplification of A1a；2.PCR amplification of A1b.C.PCR amplification of D fragment of PRRSV.M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR amplification of Da；2.PCR amplification of Db；3.Negative control.D.Fusion PCR amplification.M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.Fusion PCR amplification of the CMV and A1fragment of PRRSV；2.Negative control；3.Fusion PCR amplification of the BGH and D fragments of PRRSV；4.Negative control

圖2 融合CMV啟動子的A1片段基因和融合BGH終止信號肽的D片段基因的擴增

Fig.2 Fusion PCR amplification of the CMV and A1 fragment of PRRSV or the BGH and D fragments of PRRSV

2.4 拯救病毒的鑒定

將pOK-A2BCD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞72 h后，凍融后取上清，接種Marc-145細胞，連續(xù)傳3代。取第3代的樣品進行PCR擴增目的條帶，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠回收后，進行FseⅠ酶切鑒定。拯救病毒rXH-GD和親本毒XH-GD均可以擴增出約740 bp的目的條帶；拯救病毒rXH-GD的PCR產(chǎn)物經(jīng)FseⅠ酶切后，可見約540 bp和200 bp的目的條帶，與預期結(jié)果一致(圖4A)。

將純化后的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序鑒定，結(jié)果顯示拯救病毒rXH-GD的全基因組第510位核苷酸為G，該位點由A變?yōu)镚，對應的閱讀框從AGA變?yōu)锳GG，而推導氨基酸均為精氨酸(R)，為沉默突變；同時，該位點突變后引入酶切位點FseⅠ(GGCCGGCC)，與預期結(jié)果一致(圖4B)。將pOK-A2BCD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞72 h后，IFA檢測可知，拯救病毒rXH-GD有綠色熒光出現(xiàn)(圖4C)。

A.pOK-A2BCD菌液PCR鑒定圖。M.λ-EcoT14 I digest DNA標準; 1～8.以BGH-F和BGH-R為引物的pOK-A2BCD菌液PCR擴增產(chǎn)物; 9～16.以CMV-F和CMV-R為引物的pOK-A2BCD菌液PCR擴增產(chǎn)物。B.pOK-A2BCD質(zhì)粒酶切鑒定圖。M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1.pOK-A2BCD質(zhì)粒對照; 2.pOK-A2BCD質(zhì)粒NotⅠ/XhoⅠ酶切產(chǎn)物

A.PCR amplification of pOK-A2BCD.M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1-8.PCR amplification (primer:BGH-F and BGH-R) of pOK-A2BCD; 9-16.PCR amplification (primer:CMV-F and CMV-R) of pOK-A2BCD.B.Restricted enzymatic digestion of pOK-A2BCD.M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1.Plasmid pOK-A2BCD; 2.Enzyme (NotⅠ/XhoⅠ) digestion of pOK-A2BCD

圖3 pOK-A2BCD質(zhì)粒的構(gòu)建

Fig.3 Construction of plasmid pOK-A2BCD

A.遺傳標記位點區(qū)域的PCR擴增和酶切鑒定。M.DNA標準DL 2 000 ；1.rXH-GD PCR擴增產(chǎn)物；2.rXH-GD PCR擴增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物；3.XH-GD PCR擴增產(chǎn)物；4.XH-GD PCR擴增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物。B.PCR產(chǎn)物的測序分析。C.BHK-21轉(zhuǎn)染pOK-A2BCD質(zhì)粒72 h后，進行IFA分析(100×)

A.Identification of genetic marker by RT-PCR and restricted enzymes digestion.M.DNA Marker DL2000；1.PCR amplification of rXH-GD；2.Restricted enzymatic digestion of PCR amplification of rXH-GD；3.PCR amplification of XH-GD；4.Restricted enzymatic digestion of PCR amplification of XH-GD.B.Sequence analysis of PCR products.C .BHK-21 cells transfected with pOK-A2BCD examined by immunofluorescence assays 72 h postinoculation(100×)

圖4 拯救病毒的鑒定

Fig.4 Identification of the rescued viruses

2.5 拯救病毒的穩(wěn)定性

將拯救病毒rXH-GD在Marc-145細胞上連續(xù)傳12代，均有細胞病變出現(xiàn)(圖5)。第1、3、6、9和12代rXH-GD的病毒滴度分別為5.02、4.85、5.12、5.43和5.33，和親本毒XH-GD的(XH-GD 8f的病毒滴度為4.80)相似。

圖5 拯救病毒的細胞病變(200×)

2.6 拯救病毒的生長曲線

用104TCID50的拯救病毒rXH-GD或親本毒XH-GD感染Marc-145細胞6、12、24、36、48、60、72 h后，收集上清進行TCID50測定。結(jié)果表明，rXH-GD和XH-GD的生長曲線相似，病毒達到最高滴度的時間相同(圖6)。

圖6 拯救病毒的生長曲線

3 討論

本研究中選擇48株不同年代不同地域分離的北美型PRRSV序列和4株歐洲型PRRSV序列，通過Lasergene 7.1的MegAlign方法比對發(fā)現(xiàn)，PRRSV XH-GD株全基因組的第510位核苷酸在北美型PRRSV中很保守，其堿基均為A；而在此位點歐洲型PRRSV的堿基為T。同時，應用weblogo 3方法(Schneider and Stephens,1990)對這些序列進行比較分析，PRRSV基因組510位以堿基A為主(圖略)。因此，選擇此位點引入遺傳標記位點(A510G)，該位點對應的閱讀框從AGA變?yōu)锳GG，這2個密碼子對應的氨基酸均為精氨酸(R)，為沉默突變；同時，該位點突變后引入酶切位點FseⅠ(GGCCGGCC)。

本研究中所要擴增的兩個融合DNA片段長度大于3 kb。對于大片段，在PCR擴增過程中，隨著擴增片段長度的增加，往往會出現(xiàn)基因突變、缺失等保真性降低的現(xiàn)象。因此，在構(gòu)建感染性克隆的過程中必須使用高保真DNA聚合酶來減少PCR過程中出現(xiàn)的基因突變。本研究選擇Platinum pfx DNA聚合酶進行PCR擴增或融合PCR擴增。此外，在PCR反應過程中還應該盡可能的縮短循環(huán)數(shù)目，盡量減少核酸在紫外線下照射的時間。在后續(xù)的PCR鑒定中需要擴增更大片段，本研究選用ExTaqDNA聚合酶進行擴增，且通過兩步法進行擴增。

融合PCR技術是在不需要限制性內(nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下，采用具有互補末端的引物將不同來源的擴增片段連接起來，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑。本研究構(gòu)建兩段基因時，均采用了融合PCR技術對3個片段進行擴增，即在原有的兩步反應中增加了一個步驟，將各待融合片段等摩爾混合，在不添加引物的條件下先進行11～13個循環(huán)，這種方法大大地提高了產(chǎn)物的特異性，減少了非特異性條帶的產(chǎn)生[13]。

關于大片段的連接，將A片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pOK-BCD中，即7 187 bp的片段和11 051 bp的片段相連接，本研究選擇高質(zhì)量的T4 DNA連接酶，以提高連接的效率；其次，減少連接體系中核酸量，增加克隆的效率；再次，調(diào)整載體DNA和插入DNA的摩爾比，本研究均取10 ng進行連接。

對于建立反向遺傳操作技術平臺，保持克隆序列的完整性與準確性是決定成敗的關鍵。對于PRRSV來說，5′端序列更顯重要(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在本研究在基因組兩端均加上核酶序列，使全長質(zhì)粒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出RNA后，在核酶的作用下直接剪切出不含外緣基因的病毒基因組。

PRRSV基因組3′端的poly A個數(shù)對病毒的拯救有重要意義。一般認為，全長cDNA克隆中的polyA的數(shù)量存在一個值，低于這個值，則其體外轉(zhuǎn)錄體的穩(wěn)定性很差，以至無法產(chǎn)生有感染性的恢復病毒。目前已成功建立的PRRSV反向遺傳操作技術平臺中，poly A個數(shù)從21到109個不等[14-15]。本課題組建立基于RNA-launched的反向遺傳操作平臺時，嘗試選取了39個poly A尾。因此，本研究依然選取了39個poly A尾。

鄭海紅等[16]采用Roche公司的FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PRRSV全長質(zhì)粒到Marc-145細胞，獲得拯救病毒。而本文采用Invitrogen公司的lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PRRSV全長質(zhì)粒到BHK-21細胞，獲得拯救病毒。筆者曾經(jīng)試圖直接轉(zhuǎn)染Marc-145細胞，但轉(zhuǎn)染后進行IFA檢測，僅可見到少量的熒光信號。與轉(zhuǎn)染BHK-21細胞相比，轉(zhuǎn)染效率相對較低，可能這與不同公司試劑的轉(zhuǎn)染效率有關。

本研究成功拯救了PRRSV，這為進一步研究PRRSV致病性等相關分子機制奠定了基礎。

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Establishment of DNA-launched Reverse Genetics System of PRRSV

CAO Zong-xi1,2,JIAO Pei-rong2,TAN Shu-yi1,YE Bao-guo1,QI Wen-bao2,ZHANG Gui-hong2

(1.HainanProvincialKeyLaboratoryofTropicalAnimalReproductionandBreedingandVeterinaryMedicine,InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,HainanAcademyofAgriculturalSciences,Haikou,Hainan,571100,China；2.NationalEngineeringResearchCenterforBreedingSwineIndustry/KeyLaboratoryofZoonosisPreventionandControlofGuangdongProvince,CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

To establish a reverse genetic system of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),an DNA-launched (plasmid DNA transfection-based) reverse genetics system was developed for PRRSV by introduction of ribozyme elements at both termini of the viral genomic cDNA that were placed under the control of a CMV promoter.The strategy for construction of full-length cDNA clones:Capital letters (A1,A2,B1,B2,C,D) represent 6 overlapping fragments amplified from XH-GD genome according to the unique restriction enzyme cleavage sites in viral cDNA.An enzyme cleavage siteNotI was added to 5′end of A fragment,while 41 nucleotides of polyadenosine tail followed by BGH polyadenylation signal andKpnI were added to 3′end of D fragment by PCR mutagenesis.TheFseI in fragment A1 was created by mutation to be the genetic marker.A CMV promoter with T7 promotor preceded the viral genome.The fragments were inserted into the low-copy vector pOKq in the order of D to A.The completed full-length clone was named pOK-A2BCD.BHK cells were transfected with pOK-A2BCD,then the rescued viruses were identified by RT-PCR,restricted enzyme digestion,sequencing and IFA assays.The establishment of the reverse genetics system of PRRSV laid the foundation for further study on the molecular basis of the pathogenicity of PRRSV.

PRRSV; reverse genetics; establishment

2016-03-07

國家自然科學基金項目(31272564)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金項目(CARS-36)；海南省科學事業(yè)費項目(13-214002-0002)

曹宗喜(1982-)，男，河南新鄉(xiāng)人，博士，副研究員，主要從事獸醫(yī)傳染病學研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)11-0001-08