曹宗喜，焦培榮，譚樹(shù)義，葉保國(guó)，亓文寶，張桂紅*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571100；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家生豬種業(yè)工程中心，廣東廣州 510642)

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研究論文

基于DNA-launched的豬繁殖與呼吸綜合征病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立

曹宗喜1,2，焦培榮2，譚樹(shù)義1，葉保國(guó)1，亓文寶2，張桂紅2*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571100；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家生豬種業(yè)工程中心，廣東廣州 510642)

為構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)反向遺傳操作系統(tǒng)，將PRRSV全基因組分6段克隆，構(gòu)建獲得6個(gè)重組質(zhì)粒，先由A1和A2片段或B1和B2片段連接構(gòu)成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亞克隆入pOKq載體。在基因組5′端和3′端分別加上CMV啟動(dòng)子序列和BGH終止信號(hào)肽，全基因組510位核苷酸突變引入遺傳標(biāo)記位點(diǎn)FseⅠ。測(cè)序正確的全基因組質(zhì)粒命名為pOK-A2BCD。再將pOK-A2BCD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，拯救病毒通過(guò)PCR、酶切、測(cè)序和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定，結(jié)果表明拯救病毒成功，為進(jìn)一步研究PRRSV致病性等相關(guān)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；反向遺傳操作系統(tǒng)；構(gòu)建

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染豬所致的一種急性傳染病。該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙，各年齡階段豬呼吸道癥狀，哺乳仔豬高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征[1-2]，是目前嚴(yán)重危害我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)最重要傳染病。而高致病性PRRSV 2006年在我國(guó)首次出現(xiàn)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3-4]，其致病能力顯著增強(qiáng)現(xiàn)象引起高度關(guān)注。

根據(jù)轉(zhuǎn)染的核酸不同，反向遺傳操作平臺(tái)可以分為基于RNA-launched和基于DNA-launched兩種?；赗NA-launched的反向遺傳操作平臺(tái)是RNA病毒基因組先經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄成為病毒cDNA，接著克隆到合適的轉(zhuǎn)錄載體上，克隆到T7或SP6轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游，在體外轉(zhuǎn)錄合成病毒的基因組RNA，然后再將這些體外轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使之在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝形成具有感染性的病毒粒子，最后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收病毒，得到感染性分子克隆?；贒NA-launched的反向遺傳操作平臺(tái)是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA克隆到表達(dá)載體上獲得具有感染性的cDNA，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成具有感染性的病毒RNA，獲得重組病毒。與基于RNA-launched的方法相比，基于DNA-launched的拯救效率高10倍～50倍，且繞過(guò)RNA體外轉(zhuǎn)錄這一步驟，使得拯救病毒的過(guò)程大大減低了成本和節(jié)省了時(shí)間。

目前，反向遺傳技術(shù)在PRRSV的研究中已廣泛應(yīng)用，對(duì)病毒蛋白功能、病毒致弱作用、基因缺失標(biāo)記疫苗等研究產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用[5-10]。雖然本課題組已構(gòu)建了基于RNA-launched的反向遺傳操作平臺(tái)[11]，但此平臺(tái)存在著操作要求嚴(yán)格，成本高等不利之處，因此試圖建立基于DNA-launched的感染性克隆。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、質(zhì)粒、毒株 由pOK12 改造具有多克隆位點(diǎn)的低拷貝載體pOKq、PRRSV XH-GD株病毒和其分段基因組質(zhì)粒pJET-A1(q)、pJET-A2(q)、pOK-B(q)、pJET-C(q)和pJET-D(q)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部新獸藥研制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Platinum pfx DNA聚合酶和lipofectamine 2 000為Invitrogen 公司產(chǎn)品；CloneJET PCR Cloning Kit購(gòu)自Fermentas公司；限制性?xún)?nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ、AflⅡ、BamHⅠ、Hind Ⅲ、KpnⅠ均為NEB公司產(chǎn)品；EZNA TM Gel Extraction Kit和EZNA TM Plasmid Mini Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；Endo Free plasmid Maxi kits購(gòu)自QIAGEN公司；抗PRRSV N蛋白單克隆抗體(MAb)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所童光志研究員惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建策略 PRRSV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建見(jiàn)圖1，先由A1和A2片段或B1和B2片段連接構(gòu)成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亞克隆入pOKq載體。根據(jù)這一構(gòu)思設(shè)計(jì)引物：以pcDNA3.1-myc-His為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CMV基因和BGH基因；以PRRSV XH-GD株的全基因組序列和本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV XH-GD株分段基因組質(zhì)粒pJET-A1(q)和pJET-D(q)的序列為模板[11]，設(shè)計(jì)D片段的回復(fù)突變引物，將RNA-launched的反向遺傳操作平臺(tái)引入的遺傳標(biāo)記NotⅠ突變回來(lái)；同時(shí)設(shè)計(jì)A1片段的引物在PRRSV全基因組510位核苷酸突變引入遺傳標(biāo)記FseⅠ。為了便于區(qū)分拯救病毒和親本毒，基于引入的遺傳標(biāo)記設(shè)計(jì)1對(duì)鑒定引物(表1)，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 融合CMV啟動(dòng)子的A1片段基因的擴(kuò)增 以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物CMV-F和CMV-R對(duì)CMV基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以PRRSV分段基因組質(zhì)粒pJET-A1(q)為模板，用引物A1a-F2和A1a-R或A1b-F和A1b-R分別對(duì)A1片段基因進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增得到A1a片段或A1b片段。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)和回收純化。以得到的CMV片段、A1a片段和A1b片段為模板，用引物CMV-F和A1b-R對(duì)融合CMV啟動(dòng)子的A1片段基因進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)和回收純化。

圖1 PRRSV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建策略

引物名稱(chēng)Primername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')擴(kuò)增片段大小/bpAmplifyinglengthCMV-FCMV-RAGTCgcggccgcCGATGTACGGGCCAGATATACTCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC717A1a-F2A1a-RCGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCCATGACGTATAGGTGTTGGCTCGCCGGCCCTGTAGATTTCAGCTGCG545A1b-FA1b-RGAAATCTACAGGGCCGGCCAACTTACAGGTGCAGGCGTGTGAGGTAACATC2961Da-FDa-RCAGGTGTTTGCCATTTTCCCAACCCCTGGCCCTAGCAGTCGGCCGCGAC1818Db-FDb-RGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCggatgcccaggtcggaccacggggaggtggagatgccatgccgaccTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT1014BGH-FBGH-RacctgggcatccgaaggaggacggacgtccactcggatggctaagggagtgcGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTAGTCggtaccCAGAAGCCATAGAGCCCAC298Det-FDet-RCTGAGCTTGGGGTGCTGATGGCGAATTTCTTTGTACTG743pJET+pJET-AACTTGGAGCAGGTTCCATTCTTAATATACAGCCTGAAAATC254空載體BlankvectorpOK+pOK-TCAGGCGTGGAATGAGACAAACAAGCTCATTCGCCATTCAGGCT485空載體Blankvector

1.2.3 融合BGH終止信號(hào)肽的D片段基因的擴(kuò)增 以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物BGH-F和BGH-R對(duì)BGH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以PRRSV分段基因組質(zhì)粒pJET-D(q)為模板，用引物Da-F和Da-R或Db-F和Db-R分別對(duì)D片段基因進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增得到Da片段或Db片段PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)和回收純化。以Da片段、Db片段和BGH片段為模板，用引物Da-F和BGH-R對(duì)融合BGH終止信號(hào)肽的D片段基因進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)和回收純化。

1.2.4 質(zhì)粒pJET-A1和pJET-D的構(gòu)建 將1.2.2和1.2.3得到的PCR純化產(chǎn)物分別與pJET1.2/blunt載體連接。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α后，用滅菌牙簽挑取可疑菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)4 h～6 h，取適量菌液進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定的陽(yáng)性重組菌液送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名分別為pJET-A1和pJET-D。

1.2.5 PRRSV全長(zhǎng)cDNA的構(gòu)建 先由A1和A2片段或B1和B2片段連接構(gòu)成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亞克隆入pOKq載體(圖1)。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定。鑒定陽(yáng)性的重組菌液送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名分別為pOK-A2BCD。

1.2.6 病毒拯救 將質(zhì)粒pOK-A2BCD轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72 h，凍融3次，4℃、7 000 r/min離心7 min，取上清，接種Marc-145細(xì)胞，連續(xù)傳12代。拯救的病毒命名為rXH-GD。

1.2.7 拯救病毒的鑒定 取第3代的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物懸液進(jìn)行RNA的提取和DNaseⅠ消化，再取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板，Det-F和Det-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳檢測(cè)和回收純化。將純化后的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定，同時(shí)進(jìn)行FseⅠ酶切鑒定。

將質(zhì)粒pOK-A2BCD轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞72 h后，分別以鼠抗PRRSV N蛋白單克隆抗體和Anti-Mouse IgG/DyLight488為一抗和二抗，參考曹宗喜等[12]的方法進(jìn)行IFA檢測(cè)。

1.2.8 拯救病毒的穩(wěn)定性 將1.2.6得到的病毒，選擇第1、3、6、9和12代病毒進(jìn)行TCID50測(cè)定。

1.2.9 拯救病毒的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 測(cè)定rXH-GD 第3代病毒和親本毒XH-GD第8代病毒的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 融合CMV啟動(dòng)子的A1片段基因的擴(kuò)增

以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物CMV-F和CMV-R對(duì)CMV基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)相應(yīng)的目的條帶，CMV基因的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為720 bp，與預(yù)期大小相符(圖2A)。以質(zhì)粒pJET-A1(q)為模板，用引物A1a-F2和A1a-R或A1b-F和A1b-R分別對(duì)A1片段基因進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增得到A1a片段或A1b片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)相應(yīng)的目的條帶，分別約為0.5 kb和3.0 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符(圖2B)。以得到的CMV片段、A1a片段和A1b片段為模板，用引物CMV-F和A1b-R對(duì)融合CMV啟動(dòng)子的A1片段基因進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)約為4.2 kb的擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖2D)。

2.2 融合BGH終止信號(hào)肽的D片段基因的擴(kuò)增

以質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-His為模板，用引物BGH-F和BGH-R對(duì)BGH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)相應(yīng)的目的條帶， BGH基因的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為300 bp，與預(yù)期大小相符(圖2A)。以PRRSV分段基因組質(zhì)粒pJET-D(q)為模板，用引物Da-F和Da-R或Db-F和Db-R分別對(duì)D片段基因進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增得到Da片段或Db片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)相應(yīng)的目的條帶，分別約為1.8 kb和1.0 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符(圖2C)。以得到的BGH片段、Da片段和Db片段為模板，用引物Da-F和BGH-R對(duì)融合BGH終止信號(hào)肽的D片段基因進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)約為3.1 kb的擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖2D)。

2.3 pOK-A2BCD質(zhì)粒的鑒定

以CMV-F和CMV-R、BGH-F和BGH-R為引物進(jìn)行PCR鑒定pOK-A2BCD質(zhì)粒。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)約為720 bp或300 bp的擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖3A)。同時(shí)，進(jìn)行NotⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)約為10.6 kb的片段(載體pOKq和PRRSV B1部分片段、C片段、D片段的雙酶切條帶)、4.1 kb的片段(PRRSV A1片段的雙酶切條帶)和3.5 kb的片段(PRRSV A2片段和B1部分片段的限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ雙切條帶)，與預(yù)期大小相符(圖3B)。鑒定陽(yáng)性的重組菌液送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名分別為pOK-A2BCD。

A.CMV和BGH基因PCR擴(kuò)增圖。M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.CMV擴(kuò)增產(chǎn)物；2.BGH擴(kuò)增產(chǎn)物；3.以水為模板的陰性對(duì)照。B.A1片段基因引入遺傳標(biāo)記的PCR擴(kuò)增圖。M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；M2.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.A1a擴(kuò)增產(chǎn)物；2.A1b擴(kuò)增產(chǎn)物。C.D片段基因恢復(fù)突變的PCR擴(kuò)增圖。M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Da擴(kuò)增產(chǎn)物；2.Db擴(kuò)增產(chǎn)物；3.以水為模板的陰性對(duì)照。D.融合PCR擴(kuò)增圖。M.λ-EcoT14 I digest DNA 標(biāo)準(zhǔn)；1.CMV和A1融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.以水為模板的陰性對(duì)照；3.D和BGH融合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.以水為模板的陰性對(duì)照

A.PCR amplification of CMV and BGH genes.M.DNA Marker DL 2 000；1.CMV PCR products；2.BGH PCR products；3.Negative control.B.PCR amplification of A1 fragment of PRRSV.M1.DNA Marker DL 2 000；M2.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.Amplification of A1a；2.PCR amplification of A1b.C.PCR amplification of D fragment of PRRSV.M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR amplification of Da；2.PCR amplification of Db；3.Negative control.D.Fusion PCR amplification.M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1.Fusion PCR amplification of the CMV and A1fragment of PRRSV；2.Negative control；3.Fusion PCR amplification of the BGH and D fragments of PRRSV；4.Negative control

圖2 融合CMV啟動(dòng)子的A1片段基因和融合BGH終止信號(hào)肽的D片段基因的擴(kuò)增

Fig.2 Fusion PCR amplification of the CMV and A1 fragment of PRRSV or the BGH and D fragments of PRRSV

2.4 拯救病毒的鑒定

將pOK-A2BCD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞72 h后，凍融后取上清，接種Marc-145細(xì)胞，連續(xù)傳3代。取第3代的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的條帶，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠回收后，進(jìn)行FseⅠ酶切鑒定。拯救病毒rXH-GD和親本毒XH-GD均可以擴(kuò)增出約740 bp的目的條帶；拯救病毒rXH-GD的PCR產(chǎn)物經(jīng)FseⅠ酶切后，可見(jiàn)約540 bp和200 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4A)。

將純化后的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示拯救病毒rXH-GD的全基因組第510位核苷酸為G，該位點(diǎn)由A變?yōu)镚，對(duì)應(yīng)的閱讀框從AGA變?yōu)锳GG，而推導(dǎo)氨基酸均為精氨酸(R)，為沉默突變；同時(shí)，該位點(diǎn)突變后引入酶切位點(diǎn)FseⅠ(GGCCGGCC)，與預(yù)期結(jié)果一致(圖4B)。將pOK-A2BCD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞72 h后，IFA檢測(cè)可知，拯救病毒rXH-GD有綠色熒光出現(xiàn)(圖4C)。

A.pOK-A2BCD菌液PCR鑒定圖。M.λ-EcoT14 I digest DNA標(biāo)準(zhǔn); 1～8.以BGH-F和BGH-R為引物的pOK-A2BCD菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 9～16.以CMV-F和CMV-R為引物的pOK-A2BCD菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。B.pOK-A2BCD質(zhì)粒酶切鑒定圖。M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1.pOK-A2BCD質(zhì)粒對(duì)照; 2.pOK-A2BCD質(zhì)粒NotⅠ/XhoⅠ酶切產(chǎn)物

A.PCR amplification of pOK-A2BCD.M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1-8.PCR amplification (primer:BGH-F and BGH-R) of pOK-A2BCD; 9-16.PCR amplification (primer:CMV-F and CMV-R) of pOK-A2BCD.B.Restricted enzymatic digestion of pOK-A2BCD.M.λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1.Plasmid pOK-A2BCD; 2.Enzyme (NotⅠ/XhoⅠ) digestion of pOK-A2BCD

圖3 pOK-A2BCD質(zhì)粒的構(gòu)建

Fig.3 Construction of plasmid pOK-A2BCD

A.遺傳標(biāo)記位點(diǎn)區(qū)域的PCR擴(kuò)增和酶切鑒定。M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1.rXH-GD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.rXH-GD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物；3.XH-GD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.XH-GD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物。B.PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析。C.BHK-21轉(zhuǎn)染pOK-A2BCD質(zhì)粒72 h后，進(jìn)行IFA分析(100×)

A.Identification of genetic marker by RT-PCR and restricted enzymes digestion.M.DNA Marker DL2000；1.PCR amplification of rXH-GD；2.Restricted enzymatic digestion of PCR amplification of rXH-GD；3.PCR amplification of XH-GD；4.Restricted enzymatic digestion of PCR amplification of XH-GD.B.Sequence analysis of PCR products.C .BHK-21 cells transfected with pOK-A2BCD examined by immunofluorescence assays 72 h postinoculation(100×)

圖4 拯救病毒的鑒定

Fig.4 Identification of the rescued viruses

2.5 拯救病毒的穩(wěn)定性

將拯救病毒rXH-GD在Marc-145細(xì)胞上連續(xù)傳12代，均有細(xì)胞病變出現(xiàn)(圖5)。第1、3、6、9和12代rXH-GD的病毒滴度分別為5.02、4.85、5.12、5.43和5.33，和親本毒XH-GD的(XH-GD 8f的病毒滴度為4.80)相似。

圖5 拯救病毒的細(xì)胞病變(200×)

2.6 拯救病毒的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

用104TCID50的拯救病毒rXH-GD或親本毒XH-GD感染Marc-145細(xì)胞6、12、24、36、48、60、72 h后，收集上清進(jìn)行TCID50測(cè)定。結(jié)果表明，rXH-GD和XH-GD的生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似，病毒達(dá)到最高滴度的時(shí)間相同(圖6)。

圖6 拯救病毒的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 討論

本研究中選擇48株不同年代不同地域分離的北美型PRRSV序列和4株歐洲型PRRSV序列，通過(guò)Lasergene 7.1的MegAlign方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PRRSV XH-GD株全基因組的第510位核苷酸在北美型PRRSV中很保守，其堿基均為A；而在此位點(diǎn)歐洲型PRRSV的堿基為T(mén)。同時(shí)，應(yīng)用weblogo 3方法(Schneider and Stephens,1990)對(duì)這些序列進(jìn)行比較分析，PRRSV基因組510位以堿基A為主(圖略)。因此，選擇此位點(diǎn)引入遺傳標(biāo)記位點(diǎn)(A510G)，該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的閱讀框從AGA變?yōu)锳GG，這2個(gè)密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸均為精氨酸(R)，為沉默突變；同時(shí)，該位點(diǎn)突變后引入酶切位點(diǎn)FseⅠ(GGCCGGCC)。

本研究中所要擴(kuò)增的兩個(gè)融合DNA片段長(zhǎng)度大于3 kb。對(duì)于大片段，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，隨著擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的增加，往往會(huì)出現(xiàn)基因突變、缺失等保真性降低的現(xiàn)象。因此，在構(gòu)建感染性克隆的過(guò)程中必須使用高保真DNA聚合酶來(lái)減少PCR過(guò)程中出現(xiàn)的基因突變。本研究選擇Platinum pfx DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增或融合PCR擴(kuò)增。此外，在PCR反應(yīng)過(guò)程中還應(yīng)該盡可能的縮短循環(huán)數(shù)目，盡量減少核酸在紫外線(xiàn)下照射的時(shí)間。在后續(xù)的PCR鑒定中需要擴(kuò)增更大片段，本研究選用ExTaqDNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，且通過(guò)兩步法進(jìn)行擴(kuò)增。

融合PCR技術(shù)是在不需要限制性?xún)?nèi)切酶消化和連接酶處理的條件下，采用具有互補(bǔ)末端的引物將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段連接起來(lái)，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡(jiǎn)捷的途徑。本研究構(gòu)建兩段基因時(shí)，均采用了融合PCR技術(shù)對(duì)3個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增，即在原有的兩步反應(yīng)中增加了一個(gè)步驟，將各待融合片段等摩爾混合，在不添加引物的條件下先進(jìn)行11～13個(gè)循環(huán)，這種方法大大地提高了產(chǎn)物的特異性，減少了非特異性條帶的產(chǎn)生[13]。

關(guān)于大片段的連接，將A片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pOK-BCD中，即7 187 bp的片段和11 051 bp的片段相連接，本研究選擇高質(zhì)量的T4 DNA連接酶，以提高連接的效率；其次，減少連接體系中核酸量，增加克隆的效率；再次，調(diào)整載體DNA和插入DNA的摩爾比，本研究均取10 ng進(jìn)行連接。

對(duì)于建立反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)，保持克隆序列的完整性與準(zhǔn)確性是決定成敗的關(guān)鍵。對(duì)于PRRSV來(lái)說(shuō)，5′端序列更顯重要(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在本研究在基因組兩端均加上核酶序列，使全長(zhǎng)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出RNA后，在核酶的作用下直接剪切出不含外緣基因的病毒基因組。

PRRSV基因組3′端的poly A個(gè)數(shù)對(duì)病毒的拯救有重要意義。一般認(rèn)為，全長(zhǎng)cDNA克隆中的polyA的數(shù)量存在一個(gè)值，低于這個(gè)值，則其體外轉(zhuǎn)錄體的穩(wěn)定性很差，以至無(wú)法產(chǎn)生有感染性的恢復(fù)病毒。目前已成功建立的PRRSV反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)中，poly A個(gè)數(shù)從21到109個(gè)不等[14-15]。本課題組建立基于RNA-launched的反向遺傳操作平臺(tái)時(shí)，嘗試選取了39個(gè)poly A尾。因此，本研究依然選取了39個(gè)poly A尾。

鄭海紅等[16]采用Roche公司的FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PRRSV全長(zhǎng)質(zhì)粒到Marc-145細(xì)胞，獲得拯救病毒。而本文采用Invitrogen公司的lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PRRSV全長(zhǎng)質(zhì)粒到BHK-21細(xì)胞，獲得拯救病毒。筆者曾經(jīng)試圖直接轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，但轉(zhuǎn)染后進(jìn)行IFA檢測(cè)，僅可見(jiàn)到少量的熒光信號(hào)。與轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，可能這與不同公司試劑的轉(zhuǎn)染效率有關(guān)。

本研究成功拯救了PRRSV，這為進(jìn)一步研究PRRSV致病性等相關(guān)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of DNA-launched Reverse Genetics System of PRRSV

CAO Zong-xi1,2,JIAO Pei-rong2,TAN Shu-yi1,YE Bao-guo1,QI Wen-bao2,ZHANG Gui-hong2

(1.HainanProvincialKeyLaboratoryofTropicalAnimalReproductionandBreedingandVeterinaryMedicine,InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,HainanAcademyofAgriculturalSciences,Haikou,Hainan,571100,China；2.NationalEngineeringResearchCenterforBreedingSwineIndustry/KeyLaboratoryofZoonosisPreventionandControlofGuangdongProvince,CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

To establish a reverse genetic system of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),an DNA-launched (plasmid DNA transfection-based) reverse genetics system was developed for PRRSV by introduction of ribozyme elements at both termini of the viral genomic cDNA that were placed under the control of a CMV promoter.The strategy for construction of full-length cDNA clones:Capital letters (A1,A2,B1,B2,C,D) represent 6 overlapping fragments amplified from XH-GD genome according to the unique restriction enzyme cleavage sites in viral cDNA.An enzyme cleavage siteNotI was added to 5′end of A fragment,while 41 nucleotides of polyadenosine tail followed by BGH polyadenylation signal andKpnI were added to 3′end of D fragment by PCR mutagenesis.TheFseI in fragment A1 was created by mutation to be the genetic marker.A CMV promoter with T7 promotor preceded the viral genome.The fragments were inserted into the low-copy vector pOKq in the order of D to A.The completed full-length clone was named pOK-A2BCD.BHK cells were transfected with pOK-A2BCD,then the rescued viruses were identified by RT-PCR,restricted enzyme digestion,sequencing and IFA assays.The establishment of the reverse genetics system of PRRSV laid the foundation for further study on the molecular basis of the pathogenicity of PRRSV.

PRRSV; reverse genetics; establishment

2016-03-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272564)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-36)；海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目(13-214002-0002)

曹宗喜(1982-)，男，河南新鄉(xiāng)人，博士，副研究員，主要從事獸醫(yī)傳染病學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)11-0001-08