傅 強(qiáng)，陳 康，黃福達(dá)，繆麗韶，楊山虹，張秀明

(廣東省中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心 528403)

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·論 著·

β-catenin在銅綠假單胞菌角膜炎中的調(diào)控研究*

傅 強(qiáng)，陳 康，黃福達(dá)，繆麗韶，楊山虹，張秀明△

(廣東省中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心 528403)

目的 探討β-catenin在銅綠假單胞菌角膜炎中發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制。方法 Western-blot檢測(cè)β-catenin慢病毒應(yīng)用的效果，臨床評(píng)分觀察疾病進(jìn)展；Real-time 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)炎性因子和抗菌肽的表達(dá)；平板細(xì)菌計(jì)數(shù)檢測(cè)角膜細(xì)菌清除情況。結(jié)果 β-catenin延緩角膜炎的疾病進(jìn)展；隨后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-catenin抑制促炎因子的分泌，并上調(diào)抗菌肽CRAMP表達(dá)，促進(jìn)細(xì)菌清除。結(jié)論 β-catenin通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)并促進(jìn)細(xì)菌清除，在銅綠假單胞菌角膜炎中發(fā)揮角膜保護(hù)作用。

β-catenin； 角膜炎； 炎性反應(yīng)； 細(xì)菌清除

銅綠假單胞菌(PA)是革蘭陰性條件致病菌，當(dāng)角膜發(fā)生損傷時(shí)易感染角膜誘發(fā)角膜炎，其致病機(jī)制是過(guò)度炎性反應(yīng)和細(xì)菌侵襲導(dǎo)致的角膜病理?yè)p傷[1-2]。因此，如何抑制過(guò)度炎性反應(yīng)并清除角膜細(xì)菌是治療疾病的關(guān)鍵。β-catenin是經(jīng)典Wnt通路中核心分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增殖、腫瘤形成等，參與機(jī)體眾多生理和病理過(guò)程[3]。作為1個(gè)多功能分子，β-catenin可以參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的定植和機(jī)體的炎性反應(yīng)[4-5]。研究報(bào)道β-catenin可在沙門(mén)菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)抑制炎性反應(yīng)[4-5]，并抑制細(xì)菌定植，然而其在PA感染中的作用尚屬未知。本研究構(gòu)建PA角膜炎的動(dòng)物模型，觀察β-catenin對(duì)該疾病的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin通過(guò)抑制促炎因子的分泌，促進(jìn)細(xì)菌清除，延緩角膜炎疾病進(jìn)展，在PA角膜炎中發(fā)揮角膜保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 用乙醚麻醉小鼠后，在體視顯微鏡40倍放大倍數(shù)下用25 G的針頭在小鼠的左側(cè)眼角膜上連續(xù)劃3下，每次劃痕約1 mm。用移液器滴加入5 μL的1×106CFU/mL菌量于劃傷角膜，右側(cè)眼未經(jīng)任何處理作為正常對(duì)照。感染PA的小鼠角膜于1、3、5 d觀察角膜病變情況。根據(jù)已建立的角膜疾病臨床分級(jí)評(píng)分如下：0級(jí)，角膜清澈或輕度渾濁，渾濁范圍部分或完全遮蓋瞳孔；+1級(jí)，角膜輕度渾濁，渾濁范圍部分或完全遮蓋眼前段；+2級(jí)，角膜渾濁度增高，渾濁范圍部分或完全遮蓋眼前段；+3級(jí)，角膜高度渾濁，渾濁范圍完全遮蓋眼前段；+4級(jí)，角膜穿孔。感染后5 d，裂隙燈顯微鏡觀察并拍攝細(xì)菌感染后小鼠角膜的炎性狀態(tài)，用臨床評(píng)分法確定角膜疾病的嚴(yán)重程度。

1.2 方法

1.2.1 Western-blot 結(jié)膜下注射β-catenin慢病毒β-catenin lentivirus、β-cat-lentivirus及對(duì)照慢病毒control lentivirus、Ctl-lentivirus，收集角膜的蛋白樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜上，分別孵育5%脫脂奶粉、β-catenin(1∶1 000)的一抗、抗兔二抗。經(jīng)曝光后檢測(cè)目的蛋白的量。

1.2.2 Real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 用TRIzol法提取細(xì)胞RNA。1 g RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-2、抗菌肽(如CRAMP、β-defensin 1～3、mBD 1～3)和β-actin的引物序列，見(jiàn)表1。

1.2.3 角膜活細(xì)菌平板計(jì)數(shù) 于感染后5 d收集β-catenin慢病毒注射組和對(duì)照組的小鼠角膜，用含有0.85%(w/v)NaCl和0.25%牛血清清蛋白(BSA)的無(wú)菌水碾磨，10倍系列稀釋樣品，涂布于PA分離平板，37 ℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)板，第2天計(jì)數(shù)平板菌落。

表1 引物列表

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)膜下注射慢病毒的效果 為了研究β-catenin在PA角膜炎中的調(diào)控作用，結(jié)膜下注射β-catenin慢病毒或?qū)φ章《?，Western-blot顯示，PA感染小鼠角膜后，β-catenin的表達(dá)低于正常角膜，結(jié)膜下注射β-catenin慢病毒后，β-catenin的表達(dá)水平顯著上調(diào)。見(jiàn)圖1。

注：泳道1為正常對(duì)照；泳道2為對(duì)照慢病毒+PA；泳道3為β-catenin慢病毒+PA。圖1A為結(jié)膜下注射β-catenin慢病毒的效果圖；圖1B為β-catenin相對(duì)于β-actin 的灰度掃描結(jié)果。數(shù)據(jù)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)5只小鼠角膜。**P<0.05。

2.2 β-catenin延緩角膜炎疾病進(jìn)展 臨床評(píng)分結(jié)果顯示，在PA感染后1、3、5 d，β-catenin慢病毒注射組疾病的嚴(yán)重程度減輕，1、3、5 d的臨床評(píng)分分別為+1、+2、+3，而對(duì)照組的臨床評(píng)分分別為+2、+3、+4。裂隙燈顯微鏡照片顯示，β-catenin慢病毒注射組角膜中/重度渾濁遮蓋瞳孔區(qū)；對(duì)照組膜潰瘍穿孔。臨床表現(xiàn)結(jié)果提示β-catenin能夠延緩PA角膜炎的疾病進(jìn)程，在PA角膜炎中發(fā)揮角膜保護(hù)作用。見(jiàn)圖2。

注：圖2A為臨床評(píng)分顯示β-catenin慢病毒注射組在小鼠感染后1、3、5 d臨床評(píng)分均低于對(duì)照組(P<0.05)，**P<0.05，***P<0.05，橫線表示中位線評(píng)分；圖2B為對(duì)照組感染后5 d的小鼠角膜照片；圖2C為β-catenin慢病毒注射組感染后5 d的小鼠角膜照片。數(shù)據(jù)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)5只小鼠角膜。

2.3 β-catenin抑制促炎因子的分泌 炎性因子的分泌是引起角膜過(guò)度炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因素。為全面了解角膜的炎性反應(yīng)情況，筆者檢測(cè)β-catenin慢病毒注射組和對(duì)照組促炎因子的表達(dá)。結(jié)果顯示，在PA感染后5 d，β-catenin抑制促炎因子IL-1β、TNF-α和MIP-2的表達(dá)，而對(duì)IL-6的表達(dá)無(wú)影響。在未感染時(shí)，2組的炎性因子分泌無(wú)差別。見(jiàn)圖3。

注：圖3A為Real-time PCR檢測(cè)β-catenin慢病毒注射組和對(duì)照組感染角膜炎性因子IL-6的表達(dá)；圖3B為IL-1β的表達(dá)；圖3C為T(mén)NF-β的表達(dá)；圖3D為MIP-2的表達(dá)。數(shù)據(jù)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)5只小鼠角膜。*P<0.05；**P<0.05；***P<0.05。

2.4 β-catenin促進(jìn)角膜細(xì)菌的清除 除了過(guò)度炎性反應(yīng)，細(xì)菌侵襲也是導(dǎo)致角膜炎病理?yè)p傷的主要因素。平板計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PA感染后5 d，與對(duì)照組比較，β-catenin慢病毒注射組的角膜荷菌量顯著降低，提示β-catenin促進(jìn)細(xì)菌清除。為了探討β-catenin促進(jìn)細(xì)菌清除的機(jī)制，筆者檢測(cè)了抗菌肽的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-catenin促進(jìn)抗菌肽CRAMP的表達(dá)，而對(duì)抗菌肽mBD 1～3的表達(dá)無(wú)影響。見(jiàn)圖4。

注：圖4A為平板細(xì)菌計(jì)數(shù)檢測(cè)β-catenin慢病毒注射組和對(duì)照組的角膜荷菌量；圖4B為Real-time PCR的方法檢測(cè)抗菌肽CRAMP的表達(dá)；圖4C為mBD 1～3的表達(dá)。數(shù)據(jù)源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)5只小鼠角膜。**P<0.05。

3 討 論

β-catenin是一個(gè)多功能分子，參與眾多生理和病理過(guò)程，并可參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和細(xì)菌的定植。研究報(bào)道，在沙門(mén)菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)[4-5]，β-catenin有利于感染性疾病的恢復(fù)，然而其在PA感染中的作用尚未知。本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin通過(guò)抑制促炎因子的分泌并促進(jìn)角膜細(xì)菌的清除，延緩角膜炎的疾病進(jìn)展，發(fā)揮角膜保護(hù)作用。

據(jù)報(bào)道，在不同疾病中，β-catenin對(duì)機(jī)體炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用不同。β-catenin可在沙門(mén)菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)抑制炎性反應(yīng)[4-5]；然而，也有報(bào)道β-catenin可誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)如一氧化氮、IL-8、環(huán)氧合酶、前列腺素E2的表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體炎性反應(yīng)[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在PA感染角膜時(shí)，β-catenin通過(guò)抑制促炎因子的分泌發(fā)揮抑炎作用。

除了機(jī)體過(guò)度炎性反應(yīng)，角膜細(xì)菌侵襲也是導(dǎo)致角膜炎病理?yè)p傷的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin可促進(jìn)角膜細(xì)菌的清除，抗菌肽CRAMP和抗菌肽mBD可通過(guò)降低角膜荷菌量并抑制角膜炎性反應(yīng)[9-12]，延緩角膜炎疾病進(jìn)展。β-catenin可促進(jìn)抗菌肽CRAMP的表達(dá)，對(duì)抗菌肽mBD 1～3的表達(dá)無(wú)影響，提示β-catenin通過(guò)上調(diào)抗菌肽CRAMP的表達(dá)，促進(jìn)角膜細(xì)菌的清除。

綜上所述，本研究揭示了β-catenin在PA角膜炎中的調(diào)節(jié)作用，為角膜炎疾病的臨床輔助應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Study on regulatory role of β-catenin in Pseudomonas aeruginosa keratitis*

FUQiang,CHENKang,HUANGFuda,MIAOLishao,YANGShanhong,ZHANGXiuming△

(LaboratoryMedicineCenter,AffiliatedZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

Objective To explore the role of β-catenin in Pseudomonas aeruginosa(PA) keratitis and its regulatory mechanism.Methods Western-blot assay was used to detect the efficacy of β-catenin lentivirus application.The clinical score was used to observe the disease progression;the expression of inflammatory cytokines and antimicrobial peptides were examined by using real-time PCR;the corneal bacterial clearance was detected by using the plate bacterial count.Results β-catenin delayed the progression of keratitis;then the following experiment found that β-catenin suppressed the secretion of pro-inflammatory cytokines,up-regulated the antibacterial peptide cathelicidin-related antimicrobial peptide(CRAMP) expression and promoted the bacterial clearance.Conclusion β-catenin plays the corneal protective effect in PA keratitis by regulating inflammatory reactions and promoting the bacterial clearance.

β-catenin; keratitis; inflammation; bacterial clearance

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81401645)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(B2014447)；廣東省中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A1FC098)；廣東省中山市醫(yī)療科研項(xiàng)目(2015J004)。

傅強(qiáng)，男，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷方面的研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.0 01

A

1673-4130(2016)22-3093-03

2016-04-05

2016-06-11)