尹 曼，王一俠，唐秉華，陳麗萍，谷瑞增，蔡木易，魏 穎

(1中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；2北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；3宏樂集團有限公司，廣州 510000)

?

學(xué)齡兒童奶粉中添加食源性生物活性肽對免疫調(diào)節(jié)作用的影響

尹 曼1，2，王一俠1，2，唐秉華3，陳麗萍3，谷瑞增1，2，蔡木易1，2，魏 穎1，2

(1中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；2北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015；3宏樂集團有限公司，廣州 510000)

應(yīng)用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞，檢測其中性紅吞噬能力和NO釋放量，應(yīng)用刀豆蛋白A(Concanavalin A，Con A)和LPS誘導(dǎo)小鼠T/B淋巴細胞檢測其增殖能力，通過與4種常見市售學(xué)齡兒童奶粉的免疫調(diào)節(jié)能力作比較，評價學(xué)齡兒童奶粉中添加食源性生物活性肽對的免疫調(diào)節(jié)能力。結(jié)果表明：學(xué)齡兒童奶粉中添加食源性生物活性肽對能夠提高腹腔巨噬細胞的吞噬能力、NO釋放量和淋巴細胞的增殖能力，說明添加食源性生物活性肽的學(xué)齡兒童奶粉具有較好的增強免疫的功能。

學(xué)齡兒童奶粉；免疫調(diào)節(jié)；腹腔巨噬細胞；脾淋巴細胞

學(xué)齡兒童處于生長發(fā)育的突增高峰期，必須供給足夠的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)素，其中奶類是蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的重要來源。學(xué)齡兒童奶粉主要包括牛乳、乳清蛋白、聚葡萄糖、低聚半乳糖、?；撬?、維生素和礦物質(zhì)等，保證學(xué)齡兒童能夠及時補充生長所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)。乳清蛋白易于消化吸收，在提供優(yōu)質(zhì)蛋白的同時具有清除體內(nèi)自由基、抑菌防癌，其含有較高谷氨酸，能夠保證免疫細胞的功能[1，2]；脂肪酸主要指不飽和脂肪酸，在補充學(xué)齡兒童生長所需大量能量的同時有助于兒童大腦發(fā)育并對自閉癥、多動癥學(xué)習(xí)能力障礙等有一定緩解作用[3]，還可調(diào)節(jié)免疫、脂肪和血糖血脂的代謝[4]；低聚糖中聚葡萄糖在保證產(chǎn)品穩(wěn)定性的同時兼具益生功效[5]，低聚半乳糖作為母乳中的重要的雙歧因子，可以促進胃腸道的消化，調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[6]；?；撬嶙鳛轶w內(nèi)必需的一種氨基酸，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)，調(diào)節(jié)機體正常的生理活動，并發(fā)揮多種益生功效[7]；微量元素的補充主要來自飲食，是體內(nèi)多種酶的關(guān)鍵組成部分，與機體的免疫功能及體格智力發(fā)育等關(guān)系密切[8]。

學(xué)齡期兒童的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，補充足夠的營養(yǎng)物質(zhì)對其生長發(fā)育具有重要的促進和保障作用。目前已研究的免疫增強劑主要包括微生物類、生物因子類、人工合成類、微量元素類以及天然類藥物[9]，微量元素主要為礦物質(zhì)和維生素；其中我國已將維生素和礦物質(zhì)作為營養(yǎng)補充劑，可以維生素和礦物質(zhì)為原料，制備兒童增免類營養(yǎng)補充劑[10]。近年來，隨著易吸收食源性生物活性肽的研究與發(fā)展，其免疫調(diào)節(jié)等功能越來越引起關(guān)注，有大量研究表明，大豆肽、小麥肽、酪蛋白肽等均具有刺激機體淋巴細胞的增殖、NK細胞的活性、釋放免疫因子等增強機體免疫功能的功效[11-13]。

配合其他營養(yǎng)素，希望能夠增強學(xué)齡兒童的免疫調(diào)節(jié)能力。本實驗從腹腔巨噬細胞吞噬能力和脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化率入手，探討添加易于人體胃腸道吸收的食源性生物活性肽的學(xué)齡兒童奶粉對免疫調(diào)節(jié)的影響，通過與4種常見市售奶粉作對比，評價自制學(xué)齡兒童奶粉的免疫調(diào)節(jié)功能，為后期奶粉配方的調(diào)整提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種市售學(xué)齡兒童奶粉：購于超市，主要含牛乳、脂肪酸、低聚糖、?；撬?、維生素和礦物質(zhì)；添加FDBP學(xué)齡兒童奶粉：自制產(chǎn)品。小鼠(Balb/c，6～8w齡)，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；刀豆蛋白A、脂多糖、MTT，Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、青霉素鏈霉素溶液(雙抗)，四季青公司；紅細胞裂解液、CCK-8、緩沖液PBS、Griess試劑，碧云天生物技術(shù)研究所；DMSO，西隴化工股份有限公司；中性紅，Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗方法

1.3.1 基礎(chǔ)理化分析 蛋白質(zhì)含量的測定[16]采用國際GB/T 22492—2008《大豆肽粉》測定。水分含量的測定[17]采用國際GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》測定學(xué)齡兒童奶粉中水分含量。

1.3.2 學(xué)齡兒童奶粉對小鼠腹腔巨噬細胞的影響

(1)小鼠腹腔巨噬細胞懸液的制備：制備方法參考文獻[14]。小鼠腹腔注射1.5 mL 4 %肉湯淀粉溶液，誘導(dǎo)3d后拉頸處死，無菌收集腹腔液，離心收集細胞，流式細胞儀計數(shù)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清、1%雙抗)調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，100μL /孔加入96 孔細胞培養(yǎng)板中，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2.5 h，制備96 孔板巨噬細胞單層。

(2)學(xué)齡兒童奶粉對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響：將細胞分為空白對照組和實驗組，實驗組加入奶粉樣品，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄上清，PBS洗2 次，加入MTT溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO 100 μL，震蕩使溶解，用酶標(biāo)儀測定OD490nm值。增殖率計算公式如(1)式：

(1)

(3)學(xué)齡兒童奶粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的測定：將細胞分為空白對照組、模型組和實驗組，模型組加入LPS(終濃度30 μg/mL)，試驗組分為2 種，即LPS與奶粉共同作用組和奶粉單獨添加組。每組各設(shè)6 個復(fù)孔，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。之后，洗滌細胞2 次，每孔加入100 μL 0.1 %中性紅溶液，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h，棄上清，每孔加入100 μL細胞溶解液[含體積分數(shù)1 %乙酸的50 %(體積分數(shù))乙醇溶液]，室溫放置2 h，待細胞溶解后，酶標(biāo)儀測定OD550nm值。吞噬指數(shù)(Pinocytosis index，PI)計算如(2)、(3)式：

俄羅斯認為俄羅斯是歐洲的俄羅斯，但是卻注定漂泊。橫跨歐亞的國土和以前蠻荒的歷史讓他之于亞洲、歐洲仿佛是禽鳥、野獸之間的蝙蝠?？v使它歷史綿長，自認承拜占庭之正統(tǒng)；縱使它幅員遼闊，坐擁世界上最大的版圖。

(2)

(3)

(4)學(xué)齡兒童奶粉對小鼠腹腔巨噬細胞NO生成量的測定：小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)樣品干預(yù)24 h后，取各孔培養(yǎng)上清液，Griess法檢測細胞NO生成量。

1.3.3 學(xué)齡兒童奶粉對T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖的影響

(1)小鼠脾細胞懸液的制備：制備方法參考文獻[15]。將小鼠拉頸處死，無菌取脾臟研磨，離心，收集細胞，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸。流式細胞儀調(diào)整細胞濃度。

(2)學(xué)齡兒童奶粉對脾淋巴細胞增殖的影響：將調(diào)整好細胞濃度的脾細胞懸液(2.25×106個細胞/mL)90 μL/孔接入到96 孔板中，將細胞分為空白對照組和實驗組，實驗組加入奶粉樣品，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，加入CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀測定OD450nm值，按(1)式計算細胞增殖率。

(3)學(xué)齡兒童奶粉對B淋巴和T淋巴細胞增殖的影響：將調(diào)整好細胞濃度的脾細胞懸液(2.5×106個細胞/mL)80 μL/孔接入到96 孔板中，添加 ConA/LPS(LPS終濃度5 μg/mL、ConA終濃度10 μg/mL)、設(shè)置模型組，ConA/LPS、不同濃度的樣品溶液設(shè)置樣品組，20不完全培養(yǎng)基為空白對照組，每組4個復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。CCK-8法測定細胞增殖率，結(jié)果用刺激指數(shù)(Stimulation index，SI)表示T/B淋巴細胞增殖的結(jié)果，計算如(4)、(5)式：

(4)

(5)

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 學(xué)齡兒童奶粉基礎(chǔ)理化性質(zhì)分析

學(xué)齡兒童奶粉中總蛋白含量占27.96%±0.08%，其中酸溶蛋白即包括肽及氨基酸等較低分子量的蛋白水解物占6.916%±0.721%，極顯著高于4種市售奶粉(附表)，說明自制奶粉中含有較高含量的生物活性肽，更易于學(xué)齡兒童的吸收，補充生長發(fā)育所需的蛋白質(zhì)。

2.2 學(xué)齡兒童奶粉對腹腔巨噬細胞的影響

巨噬細胞屬于機體固有免疫細胞，在非特異免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，巨噬細胞具有可塑性，受到不同抗原刺激會分化為不同類型的巨噬細胞，起到促進或抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。經(jīng)典的巨噬細胞的激活方式是受LPS、干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子(TNF)的激活，巨噬細胞會增加細胞毒性物質(zhì)NO和活性氧中間體的釋放，清除細胞內(nèi)的病原體[16]。本實驗通過LPS誘導(dǎo)腹腔巨噬細胞，通過細胞對中性紅的吞噬能力和NO釋放量的檢測結(jié)果，來評價自制奶粉和常見市售奶粉的免疫調(diào)節(jié)能力。在3個樣品濃度下5種奶粉均能極顯著的促進正常腹腔巨噬細胞的增殖(P<0.01)，說明幾種奶粉均有很好的增強免疫的能力，具體可通過LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞中性紅吞噬能力和NO釋放量來進一步表現(xiàn)出來(圖1)。

附表 學(xué)齡兒童奶粉基礎(chǔ)理化成分含量 單位：%

圖1 學(xué)齡兒童奶粉對小鼠正常腹腔巨噬細胞增殖的影響

對正常腹腔巨噬細胞而言，3 個濃度的5 種奶粉均能提高其吞噬中性紅的能力，自制奶粉組的PI檢測結(jié)果呈“倒U”型，在400 μg/mL時達到最大PI值，并優(yōu)于其他幾種市售奶粉組，在200 μg/mL時優(yōu)于奶粉4，在800 μg/mL時優(yōu)于奶粉1和奶粉3；對LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞的吞噬能力，幾種奶粉并沒有表現(xiàn)出很好的增強作用，自制奶粉能夠提高LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞的吞噬能力，但相比于模型組而言并沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，在200、400 μg/mL時優(yōu)于奶粉3，在800 μg/mL時優(yōu)于奶粉2、奶粉3和奶粉4(圖2、圖3)。

圖2 學(xué)齡兒童奶粉對小鼠正常腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

圖3 學(xué)齡兒童奶粉對LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

3個濃度下5種奶粉均能促進LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞NO的釋放，且促進NO釋放的能力與樣品濃度正相關(guān)。在400、800 μg/mL時自制奶粉能夠極顯著的促進LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞釋放NO(P<0.01)，并與奶粉3相當(dāng)(圖4)。

圖4 學(xué)齡兒童奶粉對LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞NO釋放量的影響

綜合腹腔巨噬細胞中性紅吞噬能力和NO釋放量檢測結(jié)果，添加FDBP學(xué)齡兒童奶粉對腹腔巨噬細胞的吞噬能力具有一定的增強作用，奶粉4相對來說對腹腔巨噬細胞的作用效果最好，奶粉4含有相對較高含量的鐵、鋅，豐富的維生素和?；撬?；而礦物質(zhì)、維生素作為營養(yǎng)補充劑可以增強腹腔巨噬細胞的吞噬能力及T/B淋巴細胞的增殖能力和CD4/CD8的比值[17，18]，同時，?；撬峥赏ㄟ^增強免疫細胞的抗氧化能力來增強機體免疫[19]，此結(jié)果說明，較高含量的礦物質(zhì)、維生素以及較高含量的?；撬釋υ鰪娒庖吡τ幸欢ㄓ绊?，可作為后期奶粉配方調(diào)整的依據(jù)。

2.3 學(xué)齡兒童奶粉對脾淋巴細胞增殖的影響

脾臟在特異性免疫反應(yīng)中具有重要的作用，其中B淋巴細胞的轉(zhuǎn)化能力是反映機體體液免疫的重要方法、T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化能力是反映機體細胞免疫的重要方法。LPS可以通過Toll樣受體4(TLR4)和另一種Toll樣受體蛋白RP105的表達直接促進B淋巴細胞的分化成熟[20]；Con A可以通過促進T淋巴細胞活化過程中重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)膜分子CD3ε以及相關(guān)趨化因子的表達來促進T淋巴細胞的活化[21]。本實驗采用LPS和ConA對提取的脾淋巴細胞進行誘導(dǎo)，通過MTT增殖實驗來判斷奶粉對T-/B-淋巴細胞增殖的影響，評價自制學(xué)齡兒童奶粉和市售奶粉的免疫調(diào)節(jié)功能。

由圖5可看出，3個濃度的5 種奶粉均能極顯著的促進正常脾淋巴細胞的增殖(P<0.01)，且促進增殖的能力與樣品濃度正相關(guān)。在200 μg/mL時自制奶粉組促進脾淋巴細胞增殖的能力高于其他幾種市售奶粉，在400、800 μg/mL時的促進增殖能力僅低于奶粉2。

圖5 學(xué)齡兒童奶粉對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

學(xué)齡兒童奶粉對LPS誘導(dǎo)的小鼠B淋巴增殖的影響結(jié)果見圖6。由圖6可看出，3 個濃度下5 種奶粉均能促進LPS誘導(dǎo)的B淋巴細胞的增殖。自制奶粉組在3個濃度下對B淋巴細胞增殖的能力相差不大，與奶粉4相當(dāng)，且均優(yōu)于奶粉2。由圖7可看出，3 個濃度下5 種奶粉均能促進ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞的增殖，且促進增殖的能力與樣品濃度正相關(guān)，這與奶粉對脾淋巴細胞增殖的實驗結(jié)果相一致，說明這幾種奶粉具有很好的促進T淋巴細胞增殖的能力。在200 μg/mL時自制奶粉促進T淋巴細胞增殖的能力與奶粉2相當(dāng)，在400 μg/mL時優(yōu)于奶粉3并與其他幾種奶粉，在800 μg/mL時的促增殖能力要遠高于其他幾種市售奶粉。

圖6 學(xué)齡兒童奶粉對LPS誘導(dǎo)的B淋巴細胞增殖的影響

圖7 學(xué)齡兒童奶粉對ConA誘導(dǎo)的T淋巴細胞增殖的影響

綜合脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果，添加FDBP學(xué)齡兒童奶粉可促進T、B淋巴細胞的增殖，在800μg/mL時既能顯著促進B淋巴細胞增殖(P<0.05)又能極顯著促進T淋巴細胞增殖(P<0.01)，且至少優(yōu)于1種奶粉對學(xué)齡兒童來說，優(yōu)質(zhì)的蛋白對其生長發(fā)育、認知能力和免疫功能是必需的[22]，生物活性肽易于人體吸收，在供給兒童生長發(fā)育所需蛋白質(zhì)和氨基酸的同時，可發(fā)揮其生理功效，將其添加到營養(yǎng)輔食中，對學(xué)齡兒童的生長發(fā)育具有一定促進作用。

3 結(jié)論

對自制研發(fā)學(xué)齡兒童奶粉的免疫調(diào)節(jié)能力進行了研究，結(jié)果表明：對經(jīng)LPS誘導(dǎo)和正常的小鼠腹腔巨噬細胞，自制奶粉均能提高其中性紅吞噬能力，促進LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞NO的釋放，并極顯著促進腹腔巨噬細胞的增殖(P<0.01)；自制奶粉對 ConA和LPS 誘導(dǎo)的小鼠T和B淋巴細胞增殖均有促進作用，并極顯著的促進脾淋巴細胞的增殖(P<0.01)，說明自制學(xué)齡兒童奶粉具有較好的增強免疫的功效。與其他4種市售奶粉相比，除了LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞NO釋放量外，其他檢測指標(biāo)都至少優(yōu)于一種奶粉，這可能與其小分子生物活性肽有關(guān)。

生物活性肽由于易于吸收且具有一定的功效性，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白，同時作為營養(yǎng)補充劑的微量元素的加入，可協(xié)同增強產(chǎn)品的功效。本次實驗為后期奶粉配方的調(diào)整提供一定的實驗依據(jù)。相關(guān)增免奶粉的專利中包括維生素與礦物質(zhì)的配[23]比，胡蘿卜素和多不飽和脂肪酸的配比[24]以及從調(diào)節(jié)腸道菌群入手的復(fù)合益生元的配比等，這些均為配方的優(yōu)化提供一定參考，進一步去提高產(chǎn)品的功效。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Effect of School-age Children Milk Powder Added with Food Borne Bioactive Peptides on Immunoregulation in Vitro

YIN Man1，2，WANG Yi-xia1，2，TANG Bing-hua3，CHEN Li-ping3，GU Rui-zeng1，2，CAI Mu-yi1，2，WEI Ying1，2

(1Beijing Engineering Research Center of Protein & Functional Peptides，Beijing 100015，China；2China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China；3Wineer Wells Group Limited，Guangzhou 510000，China)

Totally three kinds of school-age children milk powder selected from market，the other one added with food borme bioactive peptides lab were selected as samples.The effect of school-age children milk powder on the proliferation of murine splenocytes was detected by WST-8.The effects of school-age children milk powder on phagocytic activity and the NO production by macrophages were studied in order to evaluate the cell viability of mouse peritoneal.Results showed that the school-age children milk powder added with food borne bioactive peptides had the better immunoregulationon effect，indicating that the milk powder added with food borme bioactive peptides had good immune-modulation.

school-age children milk powder；immunoregulation；macrophages；splenocytes

十三五國家重點研發(fā)計劃(項目編號：2016YFD0400604)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(項目編號：2013AA102205-02)。

尹曼(1991— )，女，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)。

魏穎(1981— )，女，博士，高級工程師，研究方向：功能食品。