張一鳴，楊士花，黃佳琦，黃勇樺，李海平，李 淳，李永強

(1云南農業(yè)大學食品科學技術學院，昆明 650201;2云南農業(yè)大學外語學院，昆明 650201;3武定縣食品藥品監(jiān)督管理局，云南楚雄彝族自治州 651600;4永平縣食品藥品檢驗檢測院，云南大理白族自治州 672600)

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二次通用旋轉試驗設計優(yōu)化小米菜色素提取工藝

張一鳴1，楊士花2，黃佳琦1，黃勇樺1，李海平3，李 淳4，李永強1

(1云南農業(yè)大學食品科學技術學院，昆明 650201;2云南農業(yè)大學外語學院，昆明 650201;3武定縣食品藥品監(jiān)督管理局，云南楚雄彝族自治州 651600;4永平縣食品藥品檢驗檢測院，云南大理白族自治州 672600)

以小米菜為材料，以吸光度為指標，在單因素試驗的基礎上采用二次通用旋轉試驗設計，對小米菜色素的提取工藝進行了優(yōu)化，建立了色素提取效果與提取溫度、液料比、提取時間的二次回歸數(shù)學模型，并利用該模型探討了各因素對色素提取效果的影響。結果表明：小米菜色素初步定性為復合色素，可能包含黃酮醇和葉綠素。

小米菜色素；初步定性；二次通用旋轉試驗；提取工藝優(yōu)化

從生物體中提取的天然色素，相比于合成色素，具有更高的安全性及保健功效，且著色時色調更接近天然物質顏色[1-8]。小米菜是一種高溫短日照作物[9，10]，因富含多種微量元素及維生素，同時，小米菜莖、葉內色素含量較高，產量高且容易種植，故適于作為天然色素提取原料[9-11]。本研究以小米菜為試驗材料，根據最大吸收波長和最佳提取溶劑對小米菜色素進行初步定性，利用提取溫度、液料比和提取時間進行單因素試驗，在此基礎上采用二次通用旋轉試驗設計，優(yōu)化小米菜色素的提取工藝，為小米菜色素的開發(fā)提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米菜，于2015年1月采自墨江，采集后置于4℃?zhèn)溆?。乙醇、石油醚等溶劑均為分析純?/p>

1.2 儀器與設備

UV—1800PC型紫外分光光度計，上海美普達儀器有限公司；XMTD—4000型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA1004A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米菜色素的制備 將小米菜清洗后，稱取一定量的小米菜，研磨，在一定條件下提取3次，過濾，合并濾液，得到小米菜色素溶液。

1.3.2 最大吸收波長和最佳提取溶劑的確定 通過預試驗，該色素微溶于石油醚、乙醚等有機溶劑，易溶于醇類溶劑，參考相關文獻推測該色素可能為黃酮醇化合物[12-14]，故在試驗中選擇80%乙醇溶液作為一種提取溶劑。準確稱取3份2 g樣品置于研缽中，分別加入30 mL蒸餾水、石油醚、80%乙醇溶液，研磨、過濾，分別用不同的提取溶劑定容于50 mL容量瓶中，測定吸光度，確定該色素的最大吸收波長和最佳提取溶劑。

1.3.3 單因素試驗 固定反應條件為液料比20∶1 (mL/g)、提取溫度40℃，考察不同提取時間(10、20、30、40、50 min)對色素提取效果的影響；固定反應條件為提取時間30 min、提取溫度40℃，考察不同液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)]對色素提取效果的影響；固定反應條件為提取時間30 min、液料比20∶1mL/g，考察不同提取溫度(20、30、40、50、60℃)對色素提取效果的影響。以吸光度為指標進行單因素試驗，考察各因素對色素提取效果的影響。所有試驗均重復3次。

1.3.4 二次通用旋轉試驗設計 選取提取溫度、液料比和提取時間3個因素，利用DPS數(shù)據處理軟件進行二次通用旋轉試驗設計，并進行統(tǒng)計分析，確定該色素的最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 最佳提取溶劑和最大吸收波長的確定

對以80%乙醇、蒸餾水和石油醚提取的色素溶液在200～800 nm范圍內進行全波長掃描。因為石油醚提取的色素溶液溶解性很低，故僅將80%乙醇和蒸餾水提取色素溶液進行分析。由圖1可以看出，用80%乙醇和水提取的小米菜色素在325、436、669 nm處均有明顯吸收峰，說明該色素易溶于80%的乙醇和蒸餾水，為水溶性色素，且80%乙醇提取液吸收峰高于水提取液，故選取80%乙醇作為提取溶劑。小米菜色素在波長為325、436、669 nm有3個吸收峰，根據文獻[12-15]可知，325 nm處為黃酮醇類色素特征吸收峰、669 nm處為葉綠素特征吸收峰，故初步定性小米菜色素為復合色素，可能包含黃酮醇色素和葉綠素。查閱文獻不能根據最大吸收峰對436 nm色素進行定性，需要利用質譜和核磁共振等技術進行進一步結構鑒定。本試驗對669 nm波長的色素不進行討論，僅對325 nm和436 nm波長下的色素進行研究。

圖1 小米菜色素的吸收光譜

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對色素提取效果的影響 由圖2可見，在不同提取溫度下，436 nm處吸光度均大于325 nm吸光度，并且隨著提取溫度的上升，色素溶液在2個波長下的吸光度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在40℃時達到最高，吸光度值分別為0.79、0.19。隨著提取溫度的增加，色素分子吸熱后活動加快，色素溶出率增加，吸光度呈現(xiàn)上升趨勢，當溫度超過40℃后，色素可能在高溫條件下不穩(wěn)定，導致色素分解，吸光度下降，提取率降低，故選取40℃為提取溫度較適宜。

圖2 提取溫度對吸光度的影響

2.2.2 液料比對色素提取效果的影響 由圖3可見，在不同液料比下，436 nm處吸光度均大于325 nm吸光度，并且隨著液料比的上升，色素溶液在2個波長下的吸光度均呈逐漸增大趨勢，液料比大于20∶1 mL/g后，吸光度增大趨勢不明顯。隨液料比的增加，色素溶出率也增高，在較高的液料比下，色素基本溶出完全，故增加液料比后色素溶液的吸光度變化不再明顯。從減少耗能及提取溶劑用量等方面考慮，選擇20∶1 mL/g的液料比比較理想。

圖3 液料比值對吸光度的影響

2.2.3 提取時間對色素提取效果的影響 由圖4可見，在不同提取時間下，436 nm處吸光度均大于325 nm吸光度，并且隨著提取時間延長，色素溶液在2個波長下的吸光度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在20 min時達到最高，吸光度值分別為0.96、0.52。隨提取時間的增加，溶出的色素也會增加，吸光度逐漸變大，到達一定提取時間時，色素基本提取完全，但受光、氧氣等因素影響，色素可能會發(fā)生分解，導致吸光度下降。故選取提取時間為20 min較適宜。

圖4 提取時間對吸光度的影響

2.3 數(shù)學模型的建立與檢驗

利用DPS軟件對表1、表2試驗結果進行分析，得到二次回歸模型為：

在325 nm波長下：Y1=0.575 71+0.126 49X1+0.027 93X2+0.066 69X3-0.040 88X12-0.039 47X22-0.013 83X32-0.004 00X1X2-0.018 00X1X3-0.002 25X2X3

在436 nm波長下：Y2=1.485 01+0.265 83X1+0.049 06X2+0.155 74X3-0.199 05X12-0.149 37X22-0.141 24X32+0.060 12X1X2+0.060 37X1X3+0.004 12X2X3

根據表3可知，擬合檢驗F2=39.795>F0.01(9，10)=4.95，達到極顯著水平，失擬檢驗F1=4.451

根據試驗結果進行方差分析(表4)可知，在436 nm波長時，二次回歸模型方程能夠準確反映提取溫度、液料比和提取時間與色素吸光度的關系。

表1 因素水平編碼

表2 二次通用旋轉試驗方案及試驗結果

表3 方差分析(325 nm)

表4 方差分析表(436 nm)

2.4 二次通用旋轉試驗設計[16-22]

2.4.1 主因子效應分析 根據回歸方程的偏回歸系數(shù)絕對值大小斷定在325 nm和436 nm波長下，回歸方程在試驗取值范圍內3種因素對色素提取效果作用大小依次為：X1(提取溫度)>X3(提取時間) >X2(液料比)，且全為正效應。

2.4.2 單因子效應分析 在325 nm波長下的偏回歸模型中，將3個因素中的2個固定在零水平，對數(shù)學模型進行降維分析，得到以其中1個因素為決定變量的偏回歸模型：

Y1=0.575 71+0.126 49X1-0.040 88X12

(1)

Y2=0.575 71+0.027 93X2-0.039 47X22

(2)

Y3=0.575 71+0.066 69X3-0.013 83X32

(3)

(1)-(3)式，二次項系數(shù)都是負值，其曲線均是開口向下的拋物線，說明色素的提取率將隨著提取溫度、液料比和提取時間增加，表現(xiàn)出先增后減的趨勢，即這3個因素均存在最佳值。

在436 nm波長下的偏回歸模型中，其分析結果與325 nm波長下的吸光度的偏回歸模型一致((4)-(6)式)。

Y1=1.485 01+0.265 83X1-0.199 05X12

(4)

Y2=1.485 01+0.049 06X2-0.149 37X22

(5)

Y3=1.485 01+0.155 74X3-0.141 24X32

(6)

2.5 數(shù)學模型尋優(yōu)[23-27]

2.5.1 變量輪換直接尋優(yōu) 根據已建立的數(shù)學模型，在-1.682≤Xi≤1.682 ( i =1，2，3)范圍內，對125個方案進行統(tǒng)計尋優(yōu)。在325 nm波長下，吸光度最高值0.78，對應各因素取值提取溫度74℃、液料比20∶1 (mL/g)、提取時間36.8 min。在436 nm波長下，吸光度最高值1.57，對應各因素取值為提取溫度60℃、液料比20∶1mL/g、提取時間30 min。

2.5.2 頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu) 變量輪換直接尋優(yōu)法沒有考慮到實際生產中的隨機因素，因此，需要用計算機對不同組合進行模擬試驗。在325 nm波長下，獲得大于臨界值0.51的方案53個，由表5可以看出，在95%的置信區(qū)間內，吸光度大于0.51的優(yōu)化方案為提取溫度為56.82～64.18℃、液料比為19.41∶1～22.425∶1、提取時間為21.94～27.94 min。將優(yōu)化方案結合實際生產情況定為提取溫度為60℃、液料比為20∶1 (mL/g)、提取時間為25 min。對此優(yōu)化方案進行試驗驗證，色素溶液的吸光度為0.50，與優(yōu)化理論值0.51較接近，進一步證實了方案的可靠性。在436 nm波長下，獲得大于臨界值1.15的方案27個，由表6可以看出，在95%的置信區(qū)間吸光度大于1.15的優(yōu)化方案為：提取溫度為51.04～61.2℃、液料比為18.55∶1～21.45∶1 mL/g、提取時間為23.89～30.01 min。將優(yōu)化方案結合實際生產情況定為：提取溫度為55℃、液料比為20∶1 (mL/g)、提取時間為27 min。對此優(yōu)化方案進行試驗驗證，色素溶液的吸光度為1.14，與優(yōu)化理論值1.15較接近，進一步證實了方案的可靠性。

表5 方案優(yōu)化Xi取值頻率分布(325 nm)

3 結論

小米菜色素是一種水溶性色素，最佳提取溶劑為80%乙醇溶液，在325、436、669 nm處均有最大吸收峰，初步定性為可能包含黃酮醇色素和葉綠素的復合色素。最佳提取工藝為：在325 nm波長下，提取溫度為60℃、液料比為20∶1 mL/g、提取時間為25 min；在436 nm波長下，提取溫度為55℃，液料比為20∶1 mL/g、提取時間為27 min?！?/p>

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(責任編輯 李燕妮)

Extraction Technology Optimization of Amaranthus paniculatus Pigments by Quadratic General Rotary Design

ZHANG Yi-ming1，YANG Shi-hua2，HUANG Jia-qi1，HUANG Yong-hua1，LI Hai-ping3，LI Chun4，LI Yong-qiang1

(1College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2College of Foreign Languages，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；3WudingCounty’s Food and Drug Administration，Wuding 651600，China;4YongpingCounty’s Food and Drug Testing，Yongping 672600，China)

The preliminary qualitative ofAmaranthusPaniculatusL.pigments using organic solvent method were studied by the comparison of the pigment solubility in different solvents and the maximum absorptions. According to single factor experiment about extraction time，raito of liquid to material and extraction temperature，the extraction technology ofAmaranthusPaniculatusL.pigment was optimized by quadratic general rotary design and a quadratic regression equation was established. Also，effects of the factors were investigated by the equation.Results showed the pigment was one of the complex pigment，may contain flavonoids and chlorophyll.

Amaranthuspaniculatuspigments；preliminary qualitative；Quadratic General Rotary Design； extraction process optimization

國家自然科學基金項目(項目編號：31360378、31560428)；云南省自然科學基金項目(項目編號：2013FB042)；云南農業(yè)大學“國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃”項目(項目編號：201410676001、201510676001、201510676007)；云南省教育廳項目：云南省高校食品加工與安全控制重點試驗室(項目編號：201401)。

張一鳴(1993— )，男，碩士，研究方向：功能性食品。

李永強(1975— )，男，博士，副教授，研究方向：食品科學。