楊　光，陳　松，周　揚，丁會敏

（黑龍省能源環(huán)境研究院，黑龍江哈爾濱150027）

高效液相色譜技術(shù)在四環(huán)素類抗生素分析中的應用

楊光，陳松，周揚，丁會敏

（黑龍省能源環(huán)境研究院，黑龍江哈爾濱150027）

四環(huán)素類抗生素的大量生產(chǎn)及過量使用引起了食品安全、環(huán)境污染等問題，環(huán)境樣品中四環(huán)素類抗生素的分析檢測在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等領(lǐng)域中的研究十分重要。高效液相色譜法以其靈敏度高、選擇性強、應用范圍廣等特點成為了檢驗痕量抗生素的主要方法。本文綜述了含有殘留四環(huán)素類抗生素的食品、土壤、水等中環(huán)境樣品前處理方法及其采用高效液相色譜法檢測方法的研究進展,并對這一領(lǐng)域可能的發(fā)展方向進行了展望。

高效液相色譜法；四環(huán)素類抗生素；環(huán)境樣品；前處理技術(shù)

隨著畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，我國抗生素的種類和用量也在日益增加?？股氐拇罅可a(chǎn)及使用不僅引起了食品安全問題，而且所造成的環(huán)境污染問題也更加突出。其中四環(huán)素類抗生素（tetracycline antibiotics，TCs）由于具有水溶性好、化學性質(zhì)穩(wěn)定、治療效果好等優(yōu)點成為了人類、動物臨床上被廣泛使用的抗生素，包括土霉素（oxytetracycline，OTC）、四環(huán)素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）及強力霉素（doxycycline，DC）等，其結(jié)構(gòu)都含有并四苯基苯骨架（如圖1所示）。四環(huán)素類抗生素進入機體后，少部分經(jīng)過代謝反應生成無活性的產(chǎn)物，大部分則以原形及活性代謝物殘留在機體內(nèi)或排到體外進入環(huán)境中，由此引發(fā)的一系列生態(tài)系統(tǒng)和人類健康的問題引起了人們的重視[1]。而這些問題的研究迫切需要可靠、準確的檢測技術(shù)來監(jiān)測食品、藥品、生態(tài)環(huán)境、水產(chǎn)品等樣品中四環(huán)素類抗生素的實際含量，這使得樣品中殘留四環(huán)素類抗生素的分析成為全球環(huán)境科學領(lǐng)域一大研究熱點。

目前，四環(huán)素類抗生素的主要檢測方法有高效液相色譜法、微生物法和分光光度法[4]，其中高效液相色譜法應用最為廣泛。高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是上世紀中期發(fā)展起來的一種新型理化檢測方法，該方法引入了氣相色譜理論并采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具有分析速度快、分離效率高、靈敏度高和操作自動化等特點[5]。最常用的檢測器有紫外檢測器（UVD）、熒光檢測器（FLD）和電化學檢測器（ED）等。由于環(huán)境中四環(huán)素類抗生素的濃度相對較低且樣品成分復雜，各國紛紛致力于高效液相色譜檢測技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展。隨著技術(shù)的不斷改進，光二極管陣列檢測器（DAD）及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）等技術(shù)不斷涌現(xiàn)。目前，高效液相色譜法已成為食品分析和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域重要的化學分離分析手段，本文就國內(nèi)外高效液相色譜法對四環(huán)素類抗生素的分析應用現(xiàn)狀作一綜述。

圖1　四環(huán)素類抗生素結(jié)構(gòu)式Fig.1Molecular structure of TCs

1　樣品前處理技術(shù)

由于四環(huán)素類抗生素在動物組織、糞便、土壤等環(huán)境樣品成分復雜、雜質(zhì)多、待測物濃度低，樣品基質(zhì)分離純化是準確檢測抗生素殘留量的前提。通常樣品前處理步驟包括過濾、提取、提取液的凈化等步驟，常用的凈化方法為固相萃取法。四環(huán)素類抗生素都具有共同的基本母核氫化并四苯環(huán)結(jié)構(gòu)（如圖1），易與金屬離子螯合且在弱酸性溶液中易發(fā)生差向異構(gòu)化、易降解且在生物樣品中易與蛋白質(zhì)形成共軛物[6]。因此，在固相萃取法中，對于不同的環(huán)境樣品通常采用適當?shù)奶崛∫骸⑾疵撘簩⒖股剌腿〕鰜怼?/p>

圖2　TCs測定的樣品前處理步驟Fig.2Scheme of the sample pretreatment procedures applied to the determination of TCs

林玲等人研究了HClO4、甲醇及McllVaine-EDTA溶液對豬肝中四環(huán)素類抗生素的提取效果的影響。用HClO4作提取液時，雖然可以沉淀樣品中的蛋白，減少基質(zhì)干擾，但它可將抗生素氧化，且對測試設備有腐蝕性。雖然四環(huán)素族抗生素在甲醇中的溶解度比較大，但甲醇的提取效率較低。McIlVaine-EDTA溶液綜合了上述兩種提取液的優(yōu)勢，不但提取效果良好而且回收率高。陸龍也采取甲醇-磷酸二氫鈉緩沖液作為提取液來提取豬肉重的土霉素及四環(huán)素。而辛丹敏采用乙酸乙酷、草酸及乙腈對動物組織中四環(huán)素類抗生素提取時發(fā)現(xiàn)，乙腈沸點高，提取液濃縮耗時長，不利于抗生素藥物的提取。先用乙酸乙醋提取，再用經(jīng)典的高氯酸-正己烷來凈化樣品時，提取效果最好，還可以將氯霉素抗生素提取出來。由于四環(huán)素類抗生素在肉樣品中易于蛋白質(zhì)結(jié)合，因此，需用強酸或強堿性脫蛋白劑從生物樣品中提取，而在pH值小于2.0的酸性條件下四環(huán)素類抗生素降解為脫水產(chǎn)物，加熱時又可轉(zhuǎn)變?yōu)椴钕虍悩?gòu)體，葛云芝等人采用超聲波法利用20%的三氯乙酸來沉淀蛋白質(zhì)，提取效果更為理想。

對于牛奶樣品來說，其中含有的鈣鎂離子易與四環(huán)素類藥物分子中的酚羥基和烯醇基結(jié)合形成難溶的鹽類。為解決這一問題，韓寶武等[7]采用酸性的Na2EDTA-McIlvaine溶液作為提取液，不但抵抗了四環(huán)素類抗生素與金屬離子的結(jié)合，同時保證其穩(wěn)定性并使回收率提高。楊玉霞也采用Na2EDTA-McIlvaine溶液提取食品中4種抗生素。

在糞便或土壤樣品中通常含有一定的金屬離子，易與四環(huán)素類抗生素形成螯合物，增加了目標化合物的提取難度。鐘冬蓮[6]比較了不同提取液對豬糞和雞糞中殘留抗生素提取效果的影響。發(fā)現(xiàn)提取豬糞中四環(huán)素類抗生素時，EDTA-McIlvaine緩沖溶液和甲醇-乙酸-水提取效果相當，但提取雞糞中四環(huán)素的抗生素時，由于Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液可以將同金屬離子螯合的抗生素提取出來，所以該緩沖溶液提取效果更好。由于丙酮的揮發(fā)性明顯強于甲醇，且極性比甲醇弱，對腐植酸的溶解性也較小，向Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液中加入甲醇或者丙酮都可以顯著提高土壤中OTC、TC和CTC的回收率[8]。故在提取液中加入等體積丙酮（含20%的0.01mol·L-1草酸甲醇）的緩沖溶液提取豬糞和雞糞中的TCs且效果良好。

要對水樣中目標分析物進行樣品前處理，要先過濾除去懸浮物，水樣品類似于糞便或土壤樣品，要采用Na2EDTA溶液進行抗生素的提取。如圖2所示，固相萃取法進行樣品前處理過程中，洗脫這一過程至關(guān)重要。對水樣中四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素進行洗脫時采用甲醇為洗脫溶劑且洗脫劑用量大于50mL時，目標抗生素即可被完全洗脫[9]。陳猛等采用固相萃取法對河水與海水中的農(nóng)藥進行萃取，比較了乙腈、乙酸乙酯和正己烷-丙酮的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)乙腈洗脫液的基底干擾較大，10mL丙酮-正己烷與10mL乙酸乙酯的組合洗脫較為理想，回收率高且干擾小。

綜上所述，在固相萃取法中，針對不同的環(huán)境樣品，選擇適合的提取液、洗脫液有利于四環(huán)素類抗生素的萃取，常用的提取液如McIlvaine緩沖液等[3]。對于多數(shù)樣品而言，四環(huán)素類抗生素通常以痕量存在，而樣品本身又很復雜，有時要根據(jù)具體的樣品基質(zhì)選擇適合的提取方法或結(jié)合多種方法達到凈化目的[10]。這一步驟正是液相色譜法準確分析環(huán)境樣品中四環(huán)素類抗生素的前提。

2　環(huán)境樣品分析

2.1食物樣品分析

采用液相色譜法對環(huán)境樣品分析時可根據(jù)樣品的實際情況采用合適的檢測器（如紫外可見檢測器、熒光檢測器等）及設置最佳流動相流速、柱溫、進樣量等參數(shù)。增加流動相流速使分析時間減少，但流速過高會影響分離效果且降低譜柱的使用壽命。因此，流速選擇不宜過高。一般情況下，提高色譜柱溫度可使柱效增加，但溫度過高時，容易產(chǎn)生氣泡導致峰形變差，降低信噪比，并且會導致方法重復性差。而進樣量的多少主要取決于色譜柱的樣品容量，進樣量的設定一般不能超過色譜柱的線性容量且高濃度的進樣會導致色譜和質(zhì)譜峰形變差[5]。

隨著液相色譜技術(shù)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可準確定性、定量測定復雜混合物的組分。該方法結(jié)合了液相色譜對復雜基體化合物的高分離能力和質(zhì)譜獨特的選擇性、靈敏度、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息于一體，因此，廣泛應用于食品、生物、醫(yī)藥等行業(yè)。王覃[11]通過對海產(chǎn)品、畜禽肌肉和內(nèi)臟組織中的3種四環(huán)素類抗生素的殘留量的分析，對比了HPLC-MS/MS和HPLC-UVD兩種分析技術(shù)。HPLC-MS/MS方法的檢測限（3倍信噪比）為0.05～0.16ng·g-1，而HPLC-UVD方法的檢測限（3倍信噪比）卻為11～32ng·g-1，HPLC-ESI/MS/MS方法更適用于復雜動物組織基體樣品中四環(huán)素類抗生素的殘留分析，具有較高可靠性。

ádám T?lgyesi等人[12]在檢測豬肉中5種四環(huán)素類抗生素的含量并將HPLC-DAD（二極管列陣檢測器）和HPLC-MS兩種技術(shù)進行對比，發(fā)現(xiàn)這兩種技術(shù)都顯示良好的敏感性及選擇性。對于加料試樣來說，LC-MS/MS技術(shù)具有更高的準確度。而對于生物樣品來說，HPLC-DAD技術(shù)則有更高的準確度，盡管LC-UV技術(shù)不能滿足所有的測試要求，但由于該方法對于生產(chǎn)樣品具有高準確度，因此，可適用于檢測該類產(chǎn)品。與HPLC-MS/MS相比，采用同位素稀釋法的HPLC-DAD在未來的分析測試中將更有優(yōu)勢。

雖然高效液相色譜法具有靈敏度高、檢出率高等優(yōu)點，但該方法不但對對樣品前處理要求較高，而流動相的選擇也直接影響峰形及出峰時間。在動物組織中，由于四環(huán)素容易與金屬離子形成螯合物并吸附在反相色譜柱的硅醇基上。為了避免上述問題，林玲[7]等人改進了龐國芳等人[13]的測試方法，采用二極管陣列檢測器并將磷酸、草酸、EDTA等酸性物質(zhì)加入到流動相中，用乙腈-NaH2PO4溶液作為流動相取代了原有流動相乙腈-甲醇-草酸溶液。在pH值為2.5時，色譜峰的分離效果最好，適于畜禽組織中四環(huán)素族類抗生素的檢測。韓寶武等人[7]對牛奶樣品中四環(huán)素類抗生素進行檢測時發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類化合物主要以陽離子形式存在，草酸根可與其形成離子對，避免拖尾現(xiàn)象。草酸的濃度在0.01～0.08mol·L-1范圍內(nèi)峰形和分離效果基本相似，濃度為0.01mol·L-1時，保留時間最短。因此，選擇甲醇-乙腈-草酸的混合溶液作為流動相并且該方法在十分鐘內(nèi)分離檢測3種四環(huán)素類抗生素。表1總結(jié)了食物樣品中TCs的測定方法、目標化合物、樣品類型及主要實驗條件。

2.2土壤及糞便樣品

近年來，隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的畜禽糞便，四環(huán)素類抗生素作為飼料添加劑廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，但其超量使用導致畜禽糞便及土壤中含高濃度抗生素，給環(huán)境帶來了巨大的潛在危害[24]。因此，國內(nèi)開展了對糞便及土壤中四環(huán)素類抗生素的分析研究（表2）。

張志強[8]采用高效液相色譜法對土壤及畜禽糞肥中OTC、TC、CTC 3種四環(huán)素類抗生素進行檢測。若流動相中不含甲醇，OTC和TC不能基線分離；乙腈和甲醇同時做有機相且比例相同時，3種抗生素分離效果較好，但響應值較低。最終選用0.01mol· L-1草酸溶液-乙腈-甲醇（體積比為76∶16∶8）等度洗脫，土壤樣品中的所有成分可在12min內(nèi)能夠全部洗出。而畜禽糞便樣品由于成分更加復雜，采用同樣方式洗脫，目標組分雖然在12min內(nèi)全部出現(xiàn)，但在進樣30min后仍有雜質(zhì)峰不斷出現(xiàn)。因此，需要梯度洗脫來提高流動相對非極性成分的洗脫能力并加快色譜柱的清洗。

乙酸和甲酸作為流動相時，分析物的峰形較好，但是梯度洗脫時，乙酸作為流動相時色譜圖的基線隨流動相比例的變化出現(xiàn)較大的波動，因此選擇甲酸作為流動相。當流動相pH值大于3時，3種四環(huán)素類抗生素峰形變寬，峰高變小，保留時間延長，同時過低的pH值會降低色譜柱的壽命，因而流動相的pH值控制在2～3之間。鐘冬蓮等人[6]以0.3%甲酸水溶液（pH=2.6）作為流動相時，3種四環(huán)素類抗生素分離度最大，峰形對稱且尖銳。因此選用0.3%甲酸水溶液作為流動相。其他糞便樣品分析見表2。

2.3水樣品

近幾年來，國內(nèi)外水環(huán)境中也有相繼出現(xiàn)關(guān)于四環(huán)素類抗生素藥物殘留的報道[29]。HuanYu等人[14]采用超高效液相色譜法對地表水中6種四環(huán)素類抗生素（OTC、TC、DC、DMCTC、CTC、MINO）及差向四環(huán)素進行了分析。首先采用Oasis HLB萃取柱對地表水中抗生素進行固相萃取，其次采用超高液相色譜儀分別串聯(lián)FLD（熒光檢測器）及MS/MS（二級質(zhì)譜）兩種檢測分別對TCs進行分析。由于超高效液相色譜法使用的有機溶劑更少[37]，因此，與液相色譜法相比，該方法更環(huán)保。兩種檢測器在以Waters ACQUITY UPLC BEH C8及ACQUITY CSH C18為色譜柱的條件下對待測物進行分離，運行時間分別為8.5及6.0min，與DekunHou及AiJia等人[30,31]報道的相比，極大地縮短了測試過程的運行時間。UHPLC-FLD的檢測限低至0.2ng·mL-1而MS檢測器的靈敏度是FLD的70倍且檢測限低達0.003ng· mL-1。對于四環(huán)素類抗生素的分析來說，這是目前所報道的最低檢測限。表3給出了部分水樣品檢測方法，其中UHPLC-MS/MS是目前公認的測量環(huán)境水樣中四環(huán)素類抗生素的最佳方法。

3　結(jié)論及展望

高效液相色譜法被廣泛地應用于食品、藥品、土壤等環(huán)境中四環(huán)素類抗生素的檢驗。HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)更是抗生素的分析具有高靈敏度及高選擇性，形成了較準確、精準的現(xiàn)代分析技術(shù)，但鑒定未知物的能力還有待于提高。由于環(huán)境樣品復雜，在采用高效液相色譜法前需對樣品進行萃取，常用的萃取技術(shù)步驟復雜，因此，科學工作者會更加重視步驟單一、操作簡單的萃取技術(shù)的研究。目前國內(nèi)液相色譜法主要用于測定已知的目標化合物，缺少對于代謝物及轉(zhuǎn)運產(chǎn)物的基礎(chǔ)分析研究。在實際的生產(chǎn)生活中，在線監(jiān)測技術(shù)更適用于對環(huán)境樣品中殘留抗生素的分析，我們還需進一步研究在線技術(shù)，如在線萃取及在線檢測等技術(shù)[35]。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，高效液相色譜法及與其他儀器聯(lián)用技術(shù)必將在生命科學、食品科學和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域展現(xiàn)更好的應用前景。

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（后附表1～3）

Determination of persistent tetracycline residues by high performance liquid chromatography

YANG Guang，CHEN Song，ZHOU Yang，DING Hui-min
（Energy and Environmental Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150027，China）

The problems of food safety and environmental pollution were caused by the large production and extensively application of tetracyclines（TCs）antibiotics.Hence,the determination of tetracycline residues in environmental samples were significant in the field of pharmaceutical analysis,food analysis and environmental analysis.High Performance Liquid Chromatography（HPLC）showed good sensitivity,high selectivity and wide application,which has become the main method to detect the trace TCs.In this paper,we provided an overview of the sample（such as soils,food and water samples）preparation and determination of TCs by HPLC.In addition,further developing trends were also discussed.

high performance liquid chromatography；tetracycline antibiotics；environmental samples；sample preparation

表1　食品、動物組織中殘留四環(huán)素類抗生素的檢測方法Tab.1 Determination methods of TCs in the food or animal tissue samples

表2　糞便、土壤中殘留四環(huán)素類抗生素的檢測方法Tab.2 Determination methods of TCs in the manture or soil samples

表3　水中殘留四環(huán)素類抗生素的檢測方法Tab.3 Determination methods of TCs in the water samples

X132

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20161161

2016-06-20

楊光（1988-），女，研究實習員，畢業(yè)于東北石油大學應用化學專業(yè)，碩士，從事能源化學方面的研究。