鮑方名,薛滿

(蘇州市食品藥品檢驗所,江蘇 蘇州 215104)

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川貝母分子鑒別方法的應(yīng)用及改進

鮑方名,薛滿

(蘇州市食品藥品檢驗所,江蘇 蘇州 215104)

目的 改進《中國藥典》2015版中川貝母分子鑒別方法，為《中國藥典》的應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)修訂提高提供參考。方法 優(yōu)化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)模板與引物的比率，提高退火溫度至61 ℃；采用乙醇沉淀法純化PCR反應(yīng)液。結(jié)果 原方法PCR出現(xiàn)明顯非特異性條帶，酶切結(jié)果模糊。方法改進后，非特異性條帶得到明顯抑制，同時目的條帶量沒有明顯影響，酶切結(jié)果清晰，效果良好。結(jié)論 該方法專屬性強、重現(xiàn)性好，可以滿足川貝母的鑒別。

川貝母；分子鑒別；中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中藥川貝母為百合科植物川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母或瓦布貝母的干燥鱗莖[1]。川貝母具有苦寒之性，有清熱化痰之功。用治肺熱咳嗽之證，常與知母相須為用，可以清氣滋陰；兼有甘味微寒，尚能清潤肺燥，長于潤肺化痰止咳，多用于治陰虛燥咳，常與杏仁、麥門冬、紫苑等藥同用；還可用治老嗽咳血，常與百部、天冬、沙參等藥同用[2]。隨著人們對川貝母的應(yīng)用，在許多治療急性氣管炎、支氣管炎、肺結(jié)核等的中成藥制劑中都加入了川貝母：二母寧嗽丸、川貝雪梨膏、止嗽化痰丸、貝羚膠囊、牛黃蛇膽川貝液、甘露消毒丸、百合固金口服液、妙靈丸、金嗓清音丸、治咳川貝枇杷露、參茸保胎丸、復(fù)方川貝精片、川貝止咳露、養(yǎng)陰清肺丸、小兒止咳糖漿、小兒化毒散、小兒至寶丸、小兒金丹片、小兒咳喘顆粒、小兒清肺止咳片、蛇膽川貝膠囊、貝母瓜蔞散等[1,3]。

川貝母按照藥材性狀的不同常分為松貝、青貝、爐貝及栽培品[1]。川貝母的傳統(tǒng)鑒別方法就是根據(jù)各種川貝母的性狀的細(xì)微差別來鑒別混淆品與偽品[4]。隨著自然科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在中藥鑒定中開始了大規(guī)模的研究，使中藥鑒定的手段從傳統(tǒng)的形態(tài)表征擴展到了遺傳物質(zhì)DNA：核糖體上的ITS保守區(qū)序列、葉綠體上的psbA-tmH序列、18S rRNA及tmK基因等[5-6]。川貝母的分子鑒別方法也得到了突飛猛進的發(fā)展,《中國藥典》2015版已經(jīng)收錄了川貝母的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法[1,7-9]。

本實驗按照《中國藥典》2015版川貝母項下聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法，進行川貝母鑒別研究，發(fā)現(xiàn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)果出現(xiàn)干擾后續(xù)判斷的非特異性條帶，酶切結(jié)果模糊。因此，對川貝母的分子鑒別方法進行了再研究，并通過一些經(jīng)濟實用的實驗對現(xiàn)有方法進行了補充。改進后非特異性條帶得到明顯抑制，酶切結(jié)果清楚容易判斷。

1 材料

1.1 試驗藥材 川貝母對照品(粉末)來源于中國食品藥品檢定研究院(批號：121000-201108) ，川貝母樣品1(藥品委托檢驗：江陰市天江藥業(yè)有限公司，委托編號SZ2016QS0106，產(chǎn)地：四川阿壩)；川貝母樣品2(藥品委托檢驗：江陰市天江藥業(yè)有限公司，委托編號SZ2016QS0107，產(chǎn)地：拉薩)；川貝母樣品3(藥品委托檢驗：蘇州九珍堂健康藥業(yè)有限公司，委托編號SZ2016QS0229，產(chǎn)地：四川)；川貝母樣品4(藥品委托檢驗：吳江上海蔡同德堂中藥飲片有限公司，委托編號SZ2015QS0607)，以上川貝母樣品均為飲片。

1.2 儀器和試劑 PCR儀(AB Applied Biosystems)，核酸電泳儀(Bio-Rad Power Pac TM Basic)，凝膠成像系統(tǒng)(GEL DocTM XR+ Bio RAD)，高速低溫離心機(Thermo scientific Biofuge primo R)。DNA提取試劑為TIANGEN Plant Genomic DNA Kit DP305-02(批號：N226，吸附柱批號：N2106)，DREAM Taq Green PCRMaster Mix(2×)為Thermo Scientific公司產(chǎn)品(批號:00108596),限制性內(nèi)切酶SmaⅠ(批號：K6001BA)購自TaKaRa，引物ITS1：5’CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3’和ITS2：5’GCTACGTTCTTCATCGAT3’合成于上海生工(批號:9304435540和9304435541)， GelRed購自BIOTIUM公司，批號11G0127)，TIANGEN 100 bp DNA Ladder(所有條帶：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 bp)和50 bp DNA Ladder(所有條帶：50、100、150、200、250、300、350、400、500 bp)。其他試劑藥品皆為國產(chǎn)或進口的分析純試劑。

2 川貝母鑒別方法研究

2.1 藥典方法

2.1.1 基因組DNA提取 從供試品隨機抽取少許，置乳缽中，加適量液氮，充分研磨。取30 mg左右粉末置1.5 mL離心管中，按植物基因組DNA提取試劑盒使用說明書步驟提取基因組DNA,提取得到的供試品DNA置零下20 ℃保存?zhèn)溆?。對照品DNA制備：取川貝母對照品30 mg左右置1.5 mL離心管中，按前述方法提取川貝母對照品基因組DNA。

2.1.2 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系：在200 μL PCR管中進行，反應(yīng)總體積為25 μL,DREAM Taq Green Pcr Master Mix(2×)12.5 μL，20 μmol·L-1的引物各0.5 μL ,DNA模板1 μL ，去離子水10.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)反應(yīng)30次(95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。

2.1.3 酶切反應(yīng) 酶切反應(yīng)體系：在1.5 mL離心管中進行，反應(yīng)總體積為20 μL,10X酶切緩沖液2 μL，0.1%BSA 2 μL，供試組PCR反應(yīng)液6 μL，SmaⅠ 2 μL，去離子水8 μL。酶切反應(yīng)在30 ℃水浴反應(yīng)2 h，結(jié)束時加入2 μL 10×Loading buffer終止酶切反應(yīng)。

2.1.4 電泳檢測 按瓊脂糖凝膠電泳法(三部附錄Ⅳ B)。電泳條件：電泳緩沖液為TAE,膠濃度為2%，在融化的瓊脂糖中加入核酸膠染色劑GelRed； 5 V·cm-1恒壓電壓下，電泳時間約50 min。

供試品與對照藥材PCR反應(yīng)溶液、供試品與對照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量：6 mL;DNA分子量標(biāo)記(100 bpDNA Ladder和50 bpDNA Ladder)上樣量：3 μL；電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。按照藥典方法規(guī)定的PCR條件進行川貝母的鑒別時發(fā)現(xiàn)，川貝母對照品PCR結(jié)果有比較明顯的非特異性帶出現(xiàn)，大小在200～300 bp之間，如圖1所示。按照藥典方法對PCR產(chǎn)物直接酶切操作，結(jié)果出現(xiàn)條帶模糊，無法區(qū)分目的條帶是否存在的現(xiàn)象。

注：M：100 bp DNA Ladder； 泳道1：川貝母對照品。

圖1 川貝母對照藥材PCR結(jié)果電泳圖

2.2 改進后的方法

2.2.1 非特異性條帶的干擾 使用Primer5軟件對設(shè)計引物進行分析，結(jié)果如表1所示。從引物Tm計算結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，Tm在47.3～64 ℃之間，所以56 ℃只是在藥典標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布者的條件下(PCR儀和PCR試劑)的最佳溫度，在本次操作的PCR反應(yīng)體系中還有提高的空間。

表1 引物分析結(jié)果

2.2.2 PCR條件的優(yōu)化 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系：在200 μL離心管中進行，反應(yīng)總體積為25 μL ,DREAM Taq Green Pcr Master Mix(2×)12.5 μL (Thermo Scientific，批號:00134703)，20 μmol·L-1的引物(上海生工，引物1批號:9304435540和引物2批號:9304435541)各0.2 μL ,DNA模板2 μL，去離子水10.1 μL。陰性對照將模板替換為滅菌去離子水。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)反應(yīng)30次(95 ℃ 30 s，梯度58～63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。

為了減少非特異性條帶的出現(xiàn)，加大了DNA模板量，減少了引物量，并適當(dāng)提高了退火溫度。結(jié)果如圖2所示，退火溫度在61 ℃時，主帶亮度沒有明顯減少的同時，非特異性條帶得到了明顯抑制。

注：M：100 bp DNA Ladder； 泳道1：58 ℃；泳道2：59 ℃；泳道3：60 ℃；泳道4：61 ℃；泳道5：62 ℃；泳道6：63 ℃。

圖2 川貝母對照藥材梯度PCR結(jié)果電泳圖

2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化 嘗試使用乙醇沉淀法對PCR反應(yīng)液進行緩沖液置換后再進行酶切。乙醇沉淀法：(1)加入1/10體積的醋酸鈉(3 mol·L-1，pH 5.2)于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 mol·L-1； (2)加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇混合后再次充分混勻置于-20 ℃中15～30 min；(3)14 000 r·min-1離心15 min 4 ℃，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；(4) 加入1/2離心管容量的70%乙醇，14 000 r·min-1離心5 min 4 ℃，小心移出上清液； (5)于室溫下將開蓋的EP管置于實驗桌上以使殘留的液體揮發(fā)至干；(6) 加適量的去離子水溶解DNA沉淀。

2.3 改進后方法的應(yīng)用 基因組提取、PCR產(chǎn)物酶切及電泳檢測方法同藥典方法，PCR反應(yīng)體系及條件進行了優(yōu)化，具體參數(shù)見“2.2.2”項，并在PCR之后酶切之前增加了純化步驟。按照優(yōu)化后的方法對川貝母樣品1～4進行分子鑒別，PCR結(jié)果和酶切結(jié)果如圖3和圖4所示，在300 bp左右有目的條帶的出現(xiàn)，200～300 bp出現(xiàn)的非特異性條帶得到明顯抑制，酶切之后，在100～200 bp之間有明顯酶切片段。結(jié)果該方法能夠適用于日常川貝母檢品的鑒別。

注：M：100 bp DNA Ladder； 泳道1：川貝母對照品；泳道2：SZ2016QS0106供試品；泳道3：SZ2016QS0107供試品；泳道4：SZ2016QS0229供試品；泳道5：SZ2015QS0607供試品。

圖3 供試品和川貝母對照藥材PCR結(jié)果電泳圖

注：M：50 bp DNA Ladder； 泳道1：川貝母對照品；泳道2：SZ2016QS0106供試品；泳道3：SZ2016QS0107供試品；泳道4：SZ2016QS0229供試品；泳道5：SZ2015QS0607供試品。

圖4 酶切結(jié)果電泳圖

3 討論

按照《中國藥典》2015版川貝母項下聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法，進行川貝母鑒別研究發(fā)現(xiàn)，PCR結(jié)果在200～300 bp出現(xiàn)一條明顯的非特異性條帶，直接干擾后續(xù)酶切結(jié)果的判斷；PCR產(chǎn)物直接酶切后發(fā)現(xiàn)條帶模糊，無法區(qū)分目的條帶是否存在。因此，對PCR反應(yīng)條件進行了再研究，通過減小引物與模板的比率和提高退火溫度，減少了PCR反應(yīng)中錯配的發(fā)生；使用簡單實用的乙醇沉淀法對PCR產(chǎn)物進行了純化，杜絕了PCR產(chǎn)物中的PCR緩沖體系對酶切體系的干擾。改進的方法應(yīng)用于多批川貝母的鑒別，結(jié)果均良好。

隨著中藥材的分子鑒別法不斷被藥典收錄，分子鑒別法的特殊性也逐漸顯示出來。和其他藥典方法相比，分子鑒別法由于靈敏度高，細(xì)微試劑儀器的不同就有可能造成很大的結(jié)果差別。正因為這種現(xiàn)象的存在，中國藥典2015版四部才收錄了通則9 107種中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則。同時，由于分子鑒別法靈敏度高，不同的中藥飲片形式(完整個體，部分個體，粉末)給如何取樣進行基因組提取帶來了不小的困難[10]。而且在酶切完成后，有時會出現(xiàn)沒有酶切完全的現(xiàn)象，也可能是由于樣品混有偽品引起的。

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Implementation and improvement for molecular identification of Fritillariae cirrhosae bulbus

BAO Fangming,XUE Man

(SuzhouInstituteforFoodandDrugControl,Suzhou,Jiangsu215104,China)

Objective To improve the molecular identification method of Fritillariae cirrhosae bulbus in Chinese Pharmacopoeia (2015 version)，and to provide reference for implementation of the standards of Chinese Pharmacopoeia.Methods Primer quantity was reduced while template quantity was improved.And the annealing temperature was changed from 56 ℃ to 61 ℃.Ethanol precipitation was used for PCR purification.Results Using original method,one nonspecific band (200 bp to 300 bp) was found in PCR result and the result of restriction endonucleases digestion was too fuzzy to identify.After the method was improved,the nonspecific band was obviously inhibited,while the purpose band was not significantly affected.The result of restriction endonucleases digestion was clear for identification.Good results were achieved with the improved method.Conclusion This method has good repeatability and can be used for molecular identification of Fritillariae cirrhosae bulbus.

Fritillariae cirrhosae bulbus;Molecular identification;Quality standard of traditional Chinese medicine

薛滿，男，副主任醫(yī)師，研究方向：生藥學(xué)，E-mail：xueman_szyjs@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.015

2016-05-26，

2016-07-22)