宋志釗，文志云，張穎，劉元

(1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥所，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022)

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瑤藥“產(chǎn)后三泡”的質(zhì)量控制研究

宋志釗1,2，文志云1,2，張穎1,2，劉元1,2

(1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥所，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022)

目的 建立瑤藥產(chǎn)后三泡的質(zhì)量控制方法。方法 采用薄層鑒別法(TLC)對(duì)制劑中四方藤藥材進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測定處方中四方藤的巖白菜素含量。結(jié)果 在四方藤薄層色譜圖中斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，無干擾。采用HPLC法測出在9.72～155.6 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，巖白菜素對(duì)照品濃度與其色譜峰峰面積呈正比關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率96.4%，RSD為1.11%(n=6)。結(jié)論 建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控制瑤藥產(chǎn)后三泡浴劑的質(zhì)量。

瑤藥；產(chǎn)后三泡；四方藤；巖白菜素

瑤族民間流行著生產(chǎn)后3 d坐泡，7 d就可下地干活，藥浴坐泡是瑤族人民在生產(chǎn)、生活中形成的特色醫(yī)藥文化代表之一?！爱a(chǎn)后三泡”就是其中一種具有代表性的組方，由于瑤族沒有文字記載，沒有專門的典籍，僅依靠世代口口相傳、口傳心授，沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。金秀瑤族自治縣瑤醫(yī)醫(yī)院與廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院聯(lián)合開發(fā)“產(chǎn)后三泡”醫(yī)院制劑，是廣西第一個(gè)民族藥瑤藥醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑[1]，由走馬胎、四方藤、腫節(jié)風(fēng)、飛龍掌血莖等11味民族藥材組成，具有祛風(fēng)活血，行氣止痛之功效，瑤醫(yī)用于防治瑩拉崩(產(chǎn)后風(fēng))。為了有效控制產(chǎn)后三泡浴劑的質(zhì)量，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

紫外分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司YOKO-ZS型)；高效液相色譜儀(日本島津LC-20ATVP/SPD-20AVP)，廣西威瑪龍工作站及軟件5.23版；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司KQ-100VDB型)；萬分之一電子天平(梅特勒-托利多AL-104型)；薄層層析硅膠G板，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品。

四方藤對(duì)照藥材(批號(hào)：20100321，產(chǎn)地：廣西防城，由廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰同志采集，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢定所鑒定)；巖白菜素對(duì)照品(批號(hào)：111532-201203，每支30 mg，含量按94.4%計(jì))，購自中國藥品生物制品檢定院；產(chǎn)后三泡浴劑(批號(hào)：131008，131009，131010，貴港市冠峰制藥有限公司，每袋490 g生藥)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 四方藤薄層鑒別[2]

2.1.1 對(duì)照藥材溶液的制備 取四方藤對(duì)照藥材粉末0.5 g(過60目篩)，精密加入20 mL甲醇，超聲波提取30 min，放冷，提取液濾過，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取巖白菜素對(duì)照品適量，制成每1 mL含0.5 mg的巖白菜素甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物2.0 g，精密加入20 mL甲醇，超聲波提取30 min，放冷，提取液濾過，水浴蒸干，用甲醇1 mL溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液?/p>

2.1.4 缺四方藤陰性樣品溶液制備 按產(chǎn)后三泡浴劑處方取缺四方藤的各味藥材，按工藝制法制備缺四方藤的陰性樣品，取2.0 g，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得缺四方藤的陰性樣品溶液。

2.1.5 薄層色譜條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國藥典》 2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取“2.1.1～2.1.4”項(xiàng)下溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(2.5∶2∶1)，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀(1∶1)溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與四方藤對(duì)照藥材色譜和巖白菜素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，缺四方藤陰性樣品溶液在相應(yīng)的位置無此斑點(diǎn),見圖1。

注：1～3：供試品(批號(hào)131008、131009、131010)；4.對(duì)照藥材；5.陰性樣品；6.對(duì)照品。

圖1 四方藤的薄層鑒別圖

2.1.6 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 展開溫度為10、25、35 ℃時(shí)，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)；展開濕度為30%、70%、90%時(shí)展開結(jié)果亦同。表明不同溫度、濕度展開條件對(duì)本實(shí)驗(yàn)建立的方法無明顯影響。

2.2 巖白菜素含量測定[3-4]

2.2.1 色譜條件 Intersil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。以甲醇-水(22∶78)為流動(dòng)相；檢測波長設(shè)為286 nm；進(jìn)樣量10 μL；理論板數(shù)按巖白菜素計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線考察 精密稱取巖白菜素對(duì)照品10.3 mg，置25 mL的棕色量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得388.9 mg·L-1對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、4.00 mL，各置于10 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以濃度C(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程和相關(guān)系數(shù)，分別為Y=12951C+14079，r=0.999 9。結(jié)果表明：在9.72～155.6 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，巖白菜素對(duì)照品的濃度與其峰面積呈正比關(guān)系。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密量取巖白菜素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，得每1 mL含38.9 μg的對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物研細(xì)并混勻，取0.2 g，精密稱定，置具塞錐形量瓶中，精密加入25 mL流動(dòng)相，塞緊，稱定重量，超聲波處理(功率100 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5 缺四方藤陰性樣品溶液制備 取“2.1.4”項(xiàng)下缺四方藤的陰性樣品，按照“2.2.4”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.6 精密度的考察 取“2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備的同一樣品溶液(批號(hào)131008)，照“2.2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測定峰面積值6次，對(duì)照品及供試品溶液中巖白菜素色譜峰峰面積RSD值分別為0.88%、0.86%。

2.2.7 穩(wěn)定性的考察 取同一樣品(批號(hào)131008)，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備，于制備后0、4、8、12、16 h，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法分別測定峰面積，計(jì)算峰面積RSD值為 0.86%。表明供試品溶液在16 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性的考察 取同一批樣品(批號(hào)131008)，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備6份樣品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下方法分別測定其峰面積，計(jì)算。結(jié)果測得巖白菜素含量為每袋272.1 mg，RSD值為1.10%，說明本方法重復(fù)性好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量(每袋272.1 mg)的樣品(批號(hào)131008)內(nèi)容物約0.1 g 6份，分別置6個(gè)具塞錐形瓶中，精密加入388.9 mg·L-1巖白菜素對(duì)照品儲(chǔ)備液溶液1.4 mL，精密加入流動(dòng)相24 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下的方法提取，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1，巖白菜素平均回收率為96.4%，RSD為1.11%。

表1 加樣回收試驗(yàn)(n=6)

2.2.10 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2.2～2.2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定。結(jié)果陰性樣品溶液在與對(duì)照色譜相同保留時(shí)間的位置上未顯色譜峰，表明對(duì)被測成分無干擾。結(jié)果見圖2。

A.對(duì)照品

B.供試品(批號(hào)131008)

C.陰性樣品

2.2.11 樣品含量測定 取批號(hào)分別為131008、131009、131010的樣品各2份，按照“2.2.4”項(xiàng)下的方法，分別制備樣品溶液，進(jìn)行測定，巖白菜素含量分別為每袋280.0、284.2、280.4 mg。

3 討論

“產(chǎn)后三泡”在瑤族民間廣泛使用，瑤語為隨拉不漂(Zhauh langx bul bnux)，具有“民崩燦醬，民氣止悶”功效，用于防治瑩拉崩(產(chǎn)后風(fēng))”。該方藥味眾多，使用和攜帶均存在不便，目前主要局限于瑤族民間使用。因此，有必要對(duì)此種醫(yī)藥遺產(chǎn)進(jìn)行開發(fā)研究，制成使用和攜帶方便、療效確切、安全且質(zhì)量可控的制劑,推廣應(yīng)用。在現(xiàn)代制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作中，慣選用方中主藥的薄層色譜及高效液相做為質(zhì)量控制手段，如連桂清心片[5]等。產(chǎn)后三泡醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑由走馬胎、四方藤、腫節(jié)風(fēng)、飛龍掌血莖等11味民族藥材組成，瑤族民間早就有諺語提到“產(chǎn)后氣力衰，不離走馬胎；盈虧要平衡，加用四方藤”。方中以走馬胎、四方藤為主藥，走馬胎為“風(fēng)”藥，四方藤為“打”藥，一“風(fēng)”一“打”，“風(fēng)”“打”相兼，充分突出了祛風(fēng)活絡(luò)、除濕消腫、散瘀止痛、去腐生新的功效。故在制劑開發(fā)中，先考慮用走馬胎和四方藤作為質(zhì)量控制手段，但走馬胎的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6]無薄層鑒別和含量測定項(xiàng)目，四方藤其主要化學(xué)成分巖白菜素[7]，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗氧化等多種藥理活性[8-9]，與制劑的主要藥效學(xué)相關(guān)，故選用四方藤及其所含巖白菜素作為質(zhì)量控制手段是可行的。

在薄層研究中，同時(shí)篩選了其他藥材，由于產(chǎn)后三泡醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑采取的工藝是水提，在成品鑒別中有些藥材無法作為質(zhì)量控制手段，也由于多是民族藥材，在所引用的地方標(biāo)準(zhǔn)中沒有薄層鑒別，綜合考慮還是僅選擇了四方藤作為薄層鑒別手段。在四方藤的薄層鑒別研究中，考察了硅膠G薄層板和聚酰胺薄膜，結(jié)果兩者均可以將四方藤藥材中的巖白菜素進(jìn)行分離，但是硅膠G薄層板還可以把四方藤藥材中的其他斑點(diǎn)進(jìn)行分離，從而可提高四方藤藥材定性鑒別的專屬性和可控性；也摸索了不同的展開劑：結(jié)果采用三氯甲烷-甲醇(8∶2)Rf值太高，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(2∶2∶1)Rf值太低，最終采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(2.5∶2∶1)展開系統(tǒng)。

在HPLC研究中，分別考察了50%甲醇、流動(dòng)相、水作為提取溶劑，考察了不同提取方法，超聲、加熱回流和索氏提取中巖白菜素的含量。結(jié)果表明流動(dòng)相25 mL作為提取劑，超聲處理30 min，效果最好，故選之。也對(duì)系統(tǒng)適應(yīng)性進(jìn)行了考察，根據(jù)“2.2.1”條件，選用了Intersil C18、Xbrige C18、AQ C183根不同品牌填料的色譜柱對(duì)樣品中巖白菜素與其他雜質(zhì)峰的分離的影響，結(jié)果三根不同品牌填料的色譜柱分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均在3 000以上，表明該測定該方法測定巖白菜素，對(duì)色譜柱選擇性不強(qiáng)，適用范圍廣。

本研究建立了產(chǎn)后三泡的四方藤薄層色譜法和HPLC測定本品中巖白菜素的含量，建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控制瑤藥產(chǎn)后三泡的質(zhì)量。

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Quality control standards of Yao Medicine Chanhou Sanpao

SONG Zhizhao1,2,WEN Zhiyun1,2,ZHANG Ying1,2,et al

(1.GuangxiInstituteforChineseMedicine&PharmaceuticalScience,Nanning,Guangxi530022,China;2.GuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineQualityStandards,Nanning,Guangxi530022，China)

Objective To set up quality control standards for Yao Medicine Chanhou Sanpao.Methods Cissus pteroclada Hayata was identified qualitatively by TLC methods while bergeninum content was determined by HPLC method.Results The TLC figures were distinct and reproducible with noninterference，and the calibration curves were linear in the range of 9.72～155.6 mg·L-1for Bergeninum(r=0.999 9).The average recovery of bergeninum was 96.4% and RSD was 1.11%(n=6).Conclusions The quality of Yao Medicine Chanhou Sanpao was effectively controlled by these quality standards.

Yao Medicine；Chanhou Sanpao；Cissus pteroclada Hayata；Bergenin

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科重12118005-1-4)

宋志釗，男，副研究員，研究方向：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與新產(chǎn)品的開發(fā)研究，E-mail:Songzhizhao1978@aliyun.com

劉元，女，主任藥師，研究方向：中藥藥理及新藥研制開發(fā)，E-mail:liuyuan0821@vip.163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.008

2016-05-24，

2016-07-26)