崔煥煥，李耀銀，高 巖

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TGF-β、FGF-2和Ezrin在金黃地鼠口腔癌模型中的表達

崔煥煥，李耀銀，高 巖

目的 研究TGF-β、FGF-2和Ezrin在7,12-二甲基苯并[A]蒽(7,12 -dimethyl-benzo[A]anthracene,DMBA)誘導(dǎo)的金黃地鼠頰黏膜癌模型中的表達，探討其在口腔癌癌變中的作用。方法 在金黃地鼠的單側(cè)頰囊黏膜涂抹0.5%的DMBA，獲得不同病變組黏膜標(biāo)本，進行免疫組織化學(xué)檢測和相關(guān)性分析。結(jié)果 在上皮中至重度異常增生和早期癌變組中，TGF-β的高表達率分別為75%和100%，F(xiàn)GF-2的高表達率為83%和72%，而Ezrin高表達率分別為79%和77%，明顯高于正常黏膜組和單純及輕度異常增生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。相關(guān)性分析顯示，三者表達呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論TGF-β、Ezrin、FGF-2可能共同在口腔癌癌變過程中起重要作用。

金黃地鼠口腔癌模型；口腔鱗癌；轉(zhuǎn)化生長因子；堿性成纖維細胞生長因子；埃茲蛋白

7,12-二甲基苯并[A]蒽(7,12 - dimethyl-benzo [A] anthracene, DMBA)誘發(fā)金黃地鼠頰囊癌是較常用口腔癌模型[1]。但誘癌機制研究較少，其中TGF-β、Ezrin 和FGF-2表達的研究未見報道。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)作為一種上皮細胞生長的負性生長因子，在鱗狀細胞癌(OSCC) 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。研究表明，TGF-β/Smads 信號通路在抑制惡性腫瘤發(fā)生及促進惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮一定作用[2]。FGF-2 作為一種細胞有絲分裂原和促血管生成因子，可直接作用于腫瘤細胞分泌各種蛋白分解酶和膠原酶，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤。 埃茲蛋白(Ezrin)屬連接于細胞膜和細胞骨架之間的ERM家族成員之一，能連接CD44等黏附分子和胞質(zhì)肌動蛋白，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有調(diào)控細胞的形態(tài)、黏附、運動、物質(zhì)轉(zhuǎn)運，以及為細胞的增殖和生存轉(zhuǎn)換生長信號等功能，而Ezrin的異常表達和活化與腫瘤的侵襲力、轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后有密切關(guān)系。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對DMBA誘發(fā)金黃地鼠頰囊癌過程中 TGF-β、Ezrin 和FGF-2 的表達進行檢測，探討其在口腔黏膜癌前病變癌變過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 化學(xué)致癌劑0.5%二甲基苯并[A]蒽(DMBA)丙酮溶液，麻醉藥品1.5%戊巴比妥鈉，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。兔多克隆抗體anti-FGF-2(sc-79，SANTA CRUZ BIOCHENOLOGY)，兔多克隆抗體anti-TGF-β(ab66043，ABCAM)鼠單克隆抗體anti-Ezrin(ab4069，ABCAM)。兔/鼠二步法免疫組化試劑盒(PV-6001/6002，中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動物模型的建立 90只成年SPF級敘利亞金黃地鼠由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。雌、雄各半，體重60～80 g，分為5組，每組18只。第一組正常組，不做處理。將其余4組金黃地鼠的單側(cè)頰囊黏膜涂抹0.5%的DMBA，每周3次，在分別持續(xù)涂抹第8、10、12、14周后取材，用1.5%戊巴比妥類麻醉藥腹腔內(nèi)注射麻醉下，以斷頭方式處死，組織鉗鈍性分離頰囊黏膜，切取病變組織，大小約1 cm×1.5 cm，用10%甲醛固定48 h，石蠟包埋切片。造模過程中意外死亡6只，剩下的根據(jù)病理重新分組：單純增生及輕度異常增生(27只)、中重度異常增生(24只)、早期浸潤癌(18只)、正常頰囊黏膜(15只)。

1.3 免疫組化學(xué)

1.3.1 實驗步驟 4 μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，用 3%H2O2溶液20 min后，置于檸檬酸緩沖液(PH6.0)或EDTA修復(fù)液(PH 8.0)中微波修復(fù)抗原15 min，冷卻至室溫。10%羊血清封閉 30 min后加一抗4 ℃孵育過夜(TGF-β抗體1∶300 稀釋。FGF-2抗體1∶500稀釋，Ezrin抗體1∶200稀釋)。次日采用二步法染色，顯色底物為DAB。蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、封片后置于顯微鏡下觀察。每次實驗均以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性片作為陽性對照。

1.3.2 結(jié)果判定 以細胞質(zhì)和(或)細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細顆粒為陽性，根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞百分數(shù)分四個等級：未見陽性細胞著色為陰性(-)，陽性細胞數(shù) <10%為弱陽性(+)，陽性細胞數(shù)11%～25%為中度陽性(++)，陽性細胞數(shù)>50%強陽性(+++)。將(++)和(+++)者視為高表達。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件，對計數(shù)資料進行χ2檢驗和Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化表達 (1)TGF-β。陽性顆粒彌散分布于胞質(zhì)內(nèi)。在正?？谇火つず蛦渭冊錾∽冎校酁槿蹶栃员磉_，位于基底層。在中重度異常增生病變中,陽性表達主要見于基底層或基底上層，呈帶狀分布。在癌變組織中,陽性表達彌散分布，癌巢中心細胞為強陽性表達，表達范圍可擴展到棘細胞淺層甚至上皮全層(圖1A～D)。(2) FGF-2。陽性染色位于胞質(zhì)和胞核。正?？谇火つそM織中可見基底層散在的細胞著色，染色較淺。單純增生組中多數(shù)病例的FGF-2弱陽性著色。在中重度異常增生病變中，細胞著色加深，表達范圍向上皮淺層擴展至棘層，呈深褐色帶狀。在早期癌變的組織中，陽性表達彌散分布于胞質(zhì)和胞核，棘細胞淺層甚至上皮全層可見陽性染色，早期癌或在腫瘤中分化較高的區(qū)域著色較深，癌組織染色強度明顯高于周圍形態(tài)學(xué)上正常的黏膜上皮(圖2A～D)。(3)Ezrin。 陽性染色位于胞質(zhì)和胞膜。正?？谇火つぶ挥?例在基底層有散在細胞為弱陽性表達，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不清晰。單純增生組可見基底層及附近棘層細胞弱陽性著色。中重度異常增生病變中，陽性表達加強，胞膜染色深，呈明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。早期浸潤癌癌巢的中心細胞為強陽性表達，表達范圍可擴展到棘細胞淺層甚至上皮全層(圖3A～D)。

圖1 TGF-β在7,12-二甲基苯并[A]蒽誘導(dǎo)金黃地鼠癌變過程中的表達(免疫組化染色，×100)

圖2 FGF-2在7,12-二甲基苯并[A]蒽誘導(dǎo)金黃地鼠癌變過程中的表達(免疫組化染色，×100)

圖3 Ezrin在7,12-二甲基苯并[A]蒽誘導(dǎo)金黃地鼠癌變過程中的表達(免疫組化染色，×100)

2.2 陽性表達率 中重度異常增生組和早期癌變組中的TGF-β、FGF-2和Ezrin陽性高表達率均明顯高于正常頰囊黏膜組和單純及輕度異常增生組的陽性率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。在正常黏膜和不同增生程度的病變中，Ezrin與 FGF-2的表達(r=0.537，P<0.01)，Ezrin與TGF-β的表達(r=0.695，P<0.01),以及FGF-2與TGF-β的表達(r=0.617，P<0.01)間均呈正相關(guān)關(guān)系。

表1 TGF-β、FGF-2和Ezrin在7,12-二甲基苯并[A]蒽誘導(dǎo)金黃地鼠癌變過程中的表達

注：與正常頰囊黏膜比較，①P<0.01；與單純及輕度異常增生比較，②P<0.01；與中重度異常增生比較，③P<0.01

3 討 論

有研究表明，正常生理條件下，TGF-β通過調(diào)控細胞周期，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡等抑制腫瘤的發(fā)生[2-4]。在腫瘤進展期，腫瘤細胞趨向于失去對 TGF-β腫瘤抑制作用的反應(yīng)能力。而本實驗免疫組化結(jié)果表明，隨著口腔白斑上皮增生程度的加重，病變上皮中TGF-β表達逐漸增強，提示TGF-β與癌前病變的進展密切相關(guān)，促進了癌變的發(fā)生、發(fā)展。

FGF-2與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。在腫瘤生長過程中，具備絲裂原活性的FGF-2不僅能夠直接促進細胞的增殖，還可能參與腫瘤新生血管的形成[5]。有研究顯示，F(xiàn)GF-2在口腔鱗癌中的表達比正?？谇簧掀っ黠@增強[6]。本實驗結(jié)果顯示，隨著口腔白斑上皮增生程度的加重，病變上皮中FGF-2表達逐漸增強，且FGF-2的表達強度與口腔黏膜上皮病變程度呈正相關(guān)關(guān)系，提示FGF-2與口腔癌前病變的進展密切相關(guān)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤組織中可見膜細胞骨架蛋白-Ezrin的高表達，如骨肉瘤[7]、乳腺癌[8]、食管癌[9]等，Ezrin蛋白異常高表達者預(yù)后較差，提示其在腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移機制中發(fā)揮重要作用。Moilanen等[10]卻發(fā)現(xiàn)，在漿液性卵巢癌中Ezrin蛋白表達低者預(yù)后較差，說明ezrin蛋白表達具有組織和細胞特異性，其表達水平與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后并非完全平行。本實驗結(jié)果顯示，Ezrin的表達強度與口腔黏膜上皮病變程度密切相關(guān)，隨著上皮輕、中、重度異常增生的轉(zhuǎn)變，病變上皮中Ezrin的表達逐漸增強。這與其他研究類似，提示Ezrin蛋白對口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有促進作用。

有學(xué)者實驗證明，TGF-β能夠刺激成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)換，提示由癌細胞產(chǎn)生的TGF-β對有促癌作用的基質(zhì)環(huán)境的形成有關(guān)鍵的作用[11]。Takuya等[12]發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以促使上皮細胞FGFR進行同類轉(zhuǎn)換，增加對FGF-2的敏感性，活化MEK-ERK通路，引起EMT的發(fā)生，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨口腔黏膜上皮異常病變程度的增高，TGF-β和FGF-2的表達率均提高，且兩者為正相關(guān)關(guān)系，提示TGF-β和FGF-2之間的相互協(xié)同作用。本實驗過程中也觀察到各組病變的固有層結(jié)締組織有不同程度的纖維增生的表現(xiàn)，也提示誘癌過程中有上皮間充質(zhì)的相互作用。

還有研究表明，Ezrin促進食管癌生長和侵襲的機制可能與MAPK-ERK和TGF- β信號通路激活有關(guān)[9]，表明TGF-β、FGF-2和Ezrin在腫瘤中的表達具有協(xié)同關(guān)系。

綜上所述，隨著口腔黏膜上皮異常病變程度的增高，TGF-β、FGF-2和Ezrin的表達水平逐漸增強，且三者之間的高表達有顯著的正相關(guān)性，共同促進了口腔癌變的發(fā)展過程。對三者的深入研究將有助于我們進一步探究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的機制。

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(2015-10-20收稿 2016-03-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Expression of TGF-β, FGF-2 and Ezrin in golden hamster oral cancer model

CUI Huanhuan, LI Yaoyin, and GAO Yan.

Department of Oral Pathology and Central Laboratory, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China

Objective To investigate the expression of TGF-β, Ezrin and FGF-2 in 7, 12 - dimethyl-benzo [A] anthracene (DMBA) induced golden hamster oral cancer model and evaluate the role of TGF-β, Ezrin and FGF-2 in oral mucosal precancerosis process.Methods The unilateral cheek mucosa of the golden hamsters was treated with 0.5% DMBA and a series of samples were obtained. The expression of TGF-β, Ezrin and FGF-2 was examined by immunohistochemistry. Meanwhile, the correlation between the expressions of these three factors was analyzed.Results In moderate to severe epithelial dysplasia and early cancer groups the high TGF-β-positive rate was 75% and 100% respectively, while high FGF-2-posotive rates was 83% and 72% and high expression rate of Ezrin was 79% and 77%. Compared with mild epithelial dysplasia group and normal mucosa group, there was a significant difference (P<0.01). Furthermore, there was a significant correlation among the expressions of TGF-β, Ezrin and FGF-2.Conclusions TGF-β, Ezrin and FGF-2 may play an important role and have an interaction effect in the carcinogenesis of oral squamous cell carcinoma.

golden hamster oral cancer model; oral squamous cell carcinoma; transforming growth factor-beta(TGF-β); basic fibroblast growth factor (FGF-2) ; Ezrin

國家自然基金課題(30973338)

崔煥煥，碩士，醫(yī)師。

100081，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院口腔病理科與中央實驗室

高 巖，E-mail：gaoyan0988@163.com

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