陳 辰，郭聞一，余 佳，趙凱亮，王衛(wèi)星

?

羅格列酮對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺氧化應(yīng)激的影響

陳 辰，郭聞一，余 佳，趙凱亮，王衛(wèi)星

目的 探討羅格列酮(rosiglitazone，ROSI)對重癥急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激的影響。方法 雄性SPF級SD大鼠60只，按隨機數(shù)字表法隨機分為3組：假手術(shù)組(shamoperationgroup，SO組)、SAP組、ROSI組,每組20只。膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c制備SAP模型。ROSI組在造模后5min經(jīng)股靜脈注射ROSI(6mg/kg)，SO組和SAP組則注射等量生理鹽水。術(shù)后12h剖殺大鼠，統(tǒng)計各組大鼠死亡率。檢測血清淀粉酶(amylase，AMY)；檢測胰腺組織一氧化氮(nitricoxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)水平；胰腺組織行病理學(xué)檢查；酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測血清白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukine-6，IL-6)水平。免疫印跡法(westernblotting)檢測胰腺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)蛋白水平。結(jié)果SAP組死亡2只大鼠；SO組和ROSI組無大鼠死亡。SAP組大鼠AMY、IL-1β、IL-6、NO、MDA、胰腺病理評分均較SO組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ROSI組干預(yù)后上述指標(biāo)較SAP組明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SAP組GSH-Px水平較SO組明顯下降，給予ROSI干預(yù)后GSH-Px水平有所上升，但仍低于SO組[(49.01±9.42)U/mgvs (59.81±22.43 )U/mg]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SO組胰腺組織iNOS和eNOS蛋白呈低表達，SAP組iNOS和eNOS蛋白表達水平較SO組明顯升高[(1.90±0.16 )vs(0.75±0.09)、(0.37±0.09)vs(0.09±0.01)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，ROSI干預(yù)后其表達水平均下降[(1.31±0.18)vs(1.90±0.16)、(0.23±0.08)vs(0.37±0.09)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 羅格列酮對SAP大鼠胰腺損傷具有保護作用，其機制與抑制氧化應(yīng)激、減少炎性反應(yīng)因子產(chǎn)生有關(guān)。

羅格列酮；胰腺炎；氧化應(yīng)激；炎性反應(yīng)因子

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是外科常見的急腹癥，若發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)可導(dǎo)致嚴(yán)重的臟器功能障礙及全身炎性反應(yīng)綜合征，病死率極高[1]。目前研究認(rèn)為，胰酶消化、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)因子，以及局部缺血缺氧等是造成急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展的因素[2]，其中氧化應(yīng)激發(fā)揮較為重要的作用[3]。羅格列酮(rosiglitazone，ROSI)是噻唑烷二酮類藥物，有研究顯示其在多種疾病中發(fā)揮抗氧化、抗炎作用[4]。本研究建立大鼠SAP動物模型，通過羅格列酮在SAP過程中的作用，旨在證明羅格列酮對SAP大鼠胰腺損傷具有保護作用，其機制與抑制氧化應(yīng)激、減少炎性反應(yīng)因子產(chǎn)生有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 羅格列酮(ROSI)購自Cayman公司。?；悄懰徕c(sodium taurocholate，STC)購于Sigma公司。一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。白介素-1β(interleukine-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukine-6，IL-6)ELISA檢測試劑盒均購自Abcam公司。β-肌動蛋白(β-actin)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體均購自Abcam公司。

1.2 動物模型和分組 雄性SPF級SD大鼠60只(購自武漢大學(xué)動物實驗中心)，體重200～220 g，使用隨機數(shù)字表法分為3組：假手術(shù)組(SO組)，重癥急性胰腺炎組(SAP組)，羅格列酮干預(yù)組(ROSI組)，每組20只。參照文獻[5]的方法，采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g)制備SAP模型。SO組操作同SAP組，但膽胰管注入等量生理鹽水。ROSI組造模后5 min經(jīng)股靜脈注射羅格列酮(6 mg/kg)，SO組和SAP組則注射等量生理鹽水。術(shù)后12 h剖殺大鼠。下腔靜脈采血，4000 r/min離心，留取血清標(biāo)本-20 ℃保存?zhèn)溆?。取胰頭部胰腺組織10%甲醛固定。其余胰腺組織經(jīng)液氮凍存后，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)檢測 (1)統(tǒng)計各組大鼠病死率；(2)血清淀粉酶(AMY)使用武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科全自動生化儀檢測；(3)胰腺組織經(jīng)10%甲醛固定24 h，石蠟包埋制片，HE染色后光鏡觀察，由2名病理醫(yī)師，根據(jù)Schmidt 等[6]的方法，盲法分別對胰腺組織行病理學(xué)評分；(4)按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6水平；(5)取新鮮胰腺組織，采用高速組織勻漿機(T10型，上海越磁電子科技有限公司)制備勻漿，以3000 r/min離心5 min后，取上清組織勻漿液，按照試劑盒說明書分別檢測各組大鼠胰腺組織NO、MDA、GSH-Px活性與水平；(6)免疫印跡法(western blotting)檢測各組大鼠胰腺組織iNOS、eNOS蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況和死亡情況SO組大鼠精神狀況正常；SAP組大鼠基本處于嗜睡狀態(tài)，ROSI組大鼠精神狀況相比SAP組大鼠稍好。SO組與ROSI組大鼠無死亡情況，SAP組大鼠死亡2只。

2.2 血清AMY的變化 與SO組比較，SAP組大鼠血清AMY水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ROSI組上述指標(biāo)較SAP組有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍高于SO組(P<0.05，表1)。

2.3 胰腺組織病理評分改變SO組大鼠胰腺組織腺泡結(jié)構(gòu)正常，未見水腫、壞死、出血，以及炎性浸潤等改變；SAP組大鼠胰腺組織可見大片狀的腺泡壞死，殘存胰腺組織明顯水腫，腺泡間血管充血，在壞死區(qū)域可見片狀出血，炎性細胞浸潤明顯；ROSI組腺泡壞死范圍縮小、水腫與炎性細胞浸潤情況較SAP組減輕(圖1)。對比各組大鼠胰腺組織病理評分，SAP組與SO組比較評分明顯升高，ROSI組胰腺病理評分較SAP組有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.4 胰腺組織NO、MDA、GSH-Px的變化 與SO組比較，SAP組大鼠胰腺組織NO、MDA水平明顯升高；ROSI組上述指標(biāo)較SAP組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAP組大鼠胰腺組織GSH-Px水平較SO組明顯下降，給予ROSI干預(yù)后GSH-Px水平有所上升，但仍低于SO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

組別nAMY(U/L)病理評分SO組201343.9±333.10.50±0.13SAP組187198.8±779.8①10.50±1.32①ROSI組203687.9±561.2①②6.85±1.04①②

注：SO為假手術(shù)組，SAP為重癥急性胰腺炎組，ROSI為羅格列酮干預(yù)組。與SO組比較，①P<0.05；與SAP組比較，②P<0.05

圖1 3組大鼠胰腺組織病理改變(HE，×200)

組別nNO(nmol/L)MDA(nmol/mg)GSH-Px(U/mg)SO組204.77±0.910.40±0.0959.81±22.43SAP組1811.02±2.01①1.17±0.31①39.93±15.18①ROSI組208.03±0.78①②0.82±0.14①②49.01±9.42①②

注：SO為假手術(shù)組，SAP為重癥急性胰腺炎組，ROSI為羅格列酮干預(yù)組；與SO組比較，①P<0.05；與SAP組比較，②P<0.05

2.5 血清IL-1β、IL-6的變化SAP組大鼠血清IL-1β、IL-6水平相比于SO組明顯升高，在給予ROSI干預(yù)后上述指標(biāo)均有明顯下降，但仍高于SO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.6 胰腺組織iNOS、eNOS蛋白表達SO組胰腺組織iNOS和eNOS蛋白呈低表達，SAP組iNOS和eNOS蛋白表達水平較SO組明顯升高(P<0.05，表3)；ROSI干預(yù)后上述指標(biāo)的蛋白表達水平均下降(P<0.05，圖2)。

組別nIL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)iNOSeNOSSO組20140.08±34.1980.92±25.070.75±0.090.09±0.01SAP組18336.90±88.32①392.36±86.95①1.90±0.16①0.37±0.09①ROSI組20187.12±24.21①②276.44±46.18①②1.31±0.18①②0.23±0.08①②

注：SO為假手術(shù)組，SAP為重癥急性胰腺炎組，ROSI為羅格列酮干預(yù)組；與SO組比較，①P<0.05；與SAP組比較，②P<0.05

圖2 3組大鼠胰腺組織iNOS和eNOS的表達

3 討 論

急性胰腺炎主要是由胰酶異常激活引起胰腺自身消化的疾病，受胰酶消化的胰腺腺泡細胞可以釋放更多的激酶，同時提升組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致炎應(yīng)反應(yīng)向全身擴展，引起全身炎性反應(yīng)綜合征[7]，但其具體的細胞應(yīng)激及信號傳導(dǎo)通路尚不十分清楚[8, 9]。氧化應(yīng)激是細胞應(yīng)激過程中常見的改變，供氧和供能不足均可以導(dǎo)致細胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)[10]。細胞氧化應(yīng)激存在多種啟動機制，其中作為能量轉(zhuǎn)化器的線粒體發(fā)揮重要作用。在應(yīng)激狀態(tài)下，參與線粒體氧化磷酸化過程的還原性物質(zhì)被大量消耗，產(chǎn)生的活性氧自由基及氮氧自由基可引起線粒體DNA及蛋白質(zhì)損傷[11-14]。因此氧化應(yīng)激在細胞的應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用。

MDA含量反應(yīng)機體氧化應(yīng)激程度；GSH-Px是體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶，可反映機體抗氧化能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SO組比較，SAP組AMY水平明顯上升，胰腺組織病理評分顯著增加，證實重癥急性胰腺炎造模成功；同時NO和MDA含量明顯增加，而GSH-Px下降，說明SAP大鼠病程中存在明顯的氧化應(yīng)激改變，且相應(yīng)的炎性反應(yīng)因子如IL-1β、IL-6水平也隨之上升。因此，我們認(rèn)為在SAP過程中胰腺組織氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致組織損傷，刺激各種炎性介質(zhì)釋放，引起全身炎性反應(yīng)。

羅格列酮(ROSI)是噻唑烷二酮類藥物，主要用于2型糖尿病的治療。新近的研究顯示，它具有抗氧化作用及抗炎作用，ROSI可以通過激活PPAR-γ下調(diào)氧化酶的產(chǎn)生來發(fā)揮抗氧化作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠在使用ROSI干預(yù)后，胰腺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶(eNOS)的表達下降，NO產(chǎn)生減少，氧化應(yīng)激程度降低，表現(xiàn)為MDA水平下降、GSH-Px含量上升；同時與胰腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)指標(biāo)如AMY、胰腺病理評分等均有明顯改善，血清中炎性反應(yīng)因子含量隨之降低。

綜上所述，本研究結(jié)果初步證實ROSI對SAP胰腺損傷具有保護作用，其機制與抑制氧化應(yīng)激、減少炎性反應(yīng)因子產(chǎn)生有關(guān)。本研究是采用動物實驗，而在細胞實驗中，針對胰腺腺泡細胞，ROSI是否仍具有前述的作用機制，并且ROSI激活PPAR-γ后，具體通過何種分子途徑來減少一氧化氮合成酶的產(chǎn)生等問題，均有待進一步研究證實。

[1]BanksPA,BollenTL,DervenisC, et al.Classificationofacutepancreatitis--2012:revisionoftheAtlantaclassificationanddefinitionsbyinternationalconsensus[J].Gut, 2013,62(1):102-111.

[2]WangG,QuFZ,LiL, et al.Necroptosis:apotential,promisingtargetandswitchinacutepancreatitis[J].Apoptosis, 2016, 21(2):121-129.

[3]PérezS,PeredaJ,SabaterL, et al.Redoxsignalinginacutepancreatitis[J].RedoxBiol, 2015, 5:1-14.

[4]ChenC,XuS,WangWX, et al.Rosiglitazoneattenuatestheseverityofsodiumtaurocholate-inducedacutepancreatitisandpancreatitis-associatedlunginjury[J].ArchMedRes,2009,40(2):79-88.

[5] 騫秀芳,郭 喆,胡常菊,等.白藜蘆醇對重癥急性胰腺炎大鼠炎性細胞因子的影響[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2013, 24(11):948-950.

[6]SchmidtJ,RattnerDW,LewandrowskiK, et al.Abettermodelofacutepancreatitisforevaluatingtherapy[J].AnnSurg, 1992, 215(1):44-56.

[7]WangGJ,GaoCF,WeiD, et al.Acutepancreatitis:etiologyandcommonpathogenesis[J].WorldJGastroenterol, 2009, 15(12):1427-1430.

[8]QuinlanJD.Acutepancreatitis[J].AmFamPhysician, 2014, 90(9):632-639.

[9]YuJH,KimH.Oxidativestressandinflammatorysignalinginceruleinpancreatitis[J].WorldJGastroenterol, 2014, 20(46):17324-17329.

[10]ChaudhariN,TalwarP,ParimisettyA, et al.Amolecularweb:endoplasmicreticulumstress,inflammation,andoxidativestress[J].FrontCellNeurosci, 2014, 8:213.[11]SinhaK,DasJ,PalPB, et al.Oxidativestress:themitochondria-dependentandmitochondria-independentpathwaysofapoptosis[J].ArchToxicol,2013,87(7):1157-1180.

[12]DizdarogluM.OxidativelyinducedDNAdamage:mechanisms,repairanddisease[J].CancerLett, 2012, 327(1-2):26-47.

[13]ZhuL,YuanH,GuoC, et al.Zearalenoneinducesapoptosisandnecrosisinporcinegranulosacellsviaacaspase-3-andcaspase-9-dependentmitochondrialsignalingpathway[J].JCellPhysiol, 2012, 227(5):1814-1820.

[14]LeeH,JeonJ,RyuYS, et al.DisruptionofmicrotubulessensitizestheDNAdamage-inducedapoptosisthroughinhibitingnuclearfactorkappaB(NF-kappaB)DNA-bindingactivity[J].JKoreanMedSci,2010,25(11):1574-1581.

[15]WagnerMC,YeligarSM,BrownLA, et al.PPARγligandsregulateNADPHoxidase,eNOS,andbarrierfunctioninthelungfollowingchronicalcoholingestion[J].AlcoholClinExpRes, 2012, 36(2):197-206.

(2016-04-11收稿 2016-04-27修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Effect of rosiglitazone on oxidative stress in rats with severe acute pancreatitis

CHEN Chen, GUO Wenyi, YU Jia, ZHAO Kailiang, and WANG Weixing.

Department of Hepatobiliary and Laparoscopic Surgery, Renming Hospital, Wuhan University, Wuhan 430060, China

Objective To investigate the effect of rosiglitazone on oxidative stress in rats with severe acute pancreatitis.Methods Sixty male SD rats were randomly divided into 3 group(n=20): sham operation group (SO group), severe acute pancreatitis group(SAP group) and rosiglitazone treatment group (ROSI group). SAP model was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The rats in ROSI group were injected rosiglitazone(6 mg/kg) throngh femoral vein 5 minutes after the operation. In SO group and SAP group saline partes equales were injected. Rats were killed at 12 h after operation. Analysis of the mortality of rats in each group was conducted. Detecting amylase(AMY), nitric oxide(NO), malondialdehyde(MDA)、glutathione peroxidase(GSH-Px), pancreas pathologic score. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)and analysis of serum interleukine-1β (IL-1β), interleukine-6 (IL-6) levels were carried out. The expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)、endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in pancreas tissue were measured by Western blotting method.Results Two rats died in SAP group, no rat died in SO group and ROSI group. Compared with SO group, the levels of AMY, NO, MDA and pancreas pathologic score were significantly increased in SAP group.The level of GSH-Px activity decreased significantly in SAP group than in SO group[(39.93±15.18)vs(59.81±22.43) U/mg], which was higher in ROSI group than in SAP group[(49.01±9.42)vs(59.81±22.43) U/mg] (P<0.05). The expression of iNOS and eNOS in pancreas tissue increased significantly in SAP group than in SO group[(1.90±0.16)vs(0.75±0.09)，(0.37±0.09)vs(0.09±0.01)] (P<0.05); compared with SAP group, these indexes decreased significantly in ROSI group[(1.31±0.18)vs(1.90±0.16)、(0.23±0.08)vs(0.37±0.09)] (P<0.05).Conclusions Rosiglitazone exerts the protective effect on severe acute pancreatitis through inhibiting oxidative stress and downregulating the expression of inflammatory cytokine.

rosiglitazone；pancreatitis；oxidative stress；inflammatory cytokine

陳 辰，博士，主治醫(yī)師。

430060，武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科

王衛(wèi)星，E-mail:sate.llite@163.com

R657.5