呂立君 王光華 李文兵 盧露露 劉念汝 陳彪 劉貝

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院 武漢 430081)

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C3降解長(zhǎng)鏈烷烴的條件優(yōu)化及其機(jī)理研究

呂立君 王光華 李文兵 盧露露 劉念汝 陳彪 劉貝

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院 武漢 430081)

以正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，從武漢石化輸油管附近土壤中篩選出了1株高效降解長(zhǎng)鏈烷烴的菌株C3。采用搖瓶實(shí)驗(yàn)，研究了菌株C3降解正十六烷的降解條件、降解動(dòng)力學(xué)及降解機(jī)理。菌株C3降解正十六烷的最適宜條件為溫度35 ℃、初始pH=7、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。動(dòng)力學(xué)研究顯示，在底物質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時(shí)，其降解動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果符合Monod方程，半飽和常數(shù)Ks=609.8 mg/L，最大降解速率vmax=62.1mg/(L·h)。對(duì)C3降解正十六烷產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜及GC/MS分析，推測(cè)該降解方式為末端氧化。

長(zhǎng)鏈烷烴 降解條件 Monod方程 末端氧化

0 引言

長(zhǎng)鏈烷烴化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、疏水性強(qiáng)、常溫常壓下為固體，很難自然降解，對(duì)環(huán)境造成長(zhǎng)期危害[1]。由于長(zhǎng)鏈烷烴在水體中的長(zhǎng)期積累，一些殘余部分也可通過食物進(jìn)入人體，引起中毒。近幾年來，烴類污染的微生物修復(fù)技術(shù)在國內(nèi)外得到了較快的發(fā)展，但由于大多數(shù)微生物對(duì)長(zhǎng)鏈烴類降解速度較慢，治理過程所需時(shí)間較長(zhǎng)，因此對(duì)長(zhǎng)鏈烷烴高效降解菌的研究是目前微生物修復(fù)技術(shù)的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

微生物降解的外界環(huán)境也會(huì)對(duì)降解產(chǎn)生影響。研究表明，外界環(huán)境(溫度、pH值、溶氧、外加表面活性劑等)與微生物的降解效率高低密切相關(guān)[2]。溫度可以決定烴類化合物的物理狀態(tài)，而物理狀態(tài)最終影響到微生物與烴類化合物分子之間的相互作用關(guān)系，從而改變生物降解的過程和速率[3-4]。pH值與石油的降解密切相關(guān)，它可直接影響微生物的生長(zhǎng)和活性[5]。微生物降解烴類污染物主要是基質(zhì)被氧化酶氧化過程，由于烴類物質(zhì)在水表面形成油膜，氧傳遞緩慢，因此供氧不足成為石油降解的制約因素[6]。烴類的降解一般有3種方式：?jiǎn)文┒搜趸?、雙末端氧化和亞末端氧化[7]。

本文將對(duì)篩選出的長(zhǎng)鏈烷烴高效降解菌C3最佳降解條件以及降解機(jī)理進(jìn)行研究，為C3更好地降解長(zhǎng)鏈烷烴提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

正十六烷(色譜純)；二氯甲烷(色譜純)；正己烷(分析純)；菌株C3：中國石化武漢石油(集團(tuán))股份有限公司輸油管附近土壤；LB培養(yǎng)基：酵母浸提物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，pH為6.8～7.2，于121.3 ℃濕熱滅菌20 min后備用；無機(jī)鹽培養(yǎng)基：硝酸銨1 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀1.36 g，七水硫酸鎂0.432 g，氯化鈣0.006 g，微量元素1 mL，蒸餾水1 L，pH為6.8～7.2，于121.3 ℃濕熱滅菌20 min后備用；其中微量元素為一水硫酸錳1.69 g/L，六水氯化鈷0.24 g/L，硼酸1.16 g/L，二水鉬酸鈉0.024 g/L，七水硫酸亞鐵2.78 g/L，七水硫酸鋅1.15 g/L，五水硫酸銅0.38 g/L。在上述培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂，得到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

Agilent 6890型氣相色譜儀，德國安捷倫有限公司；Agilent 5973C色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent有限公司； Mastercycler gradientVERTEX70型傅立葉變換紅外光譜儀，德國Bruker有限公司。

1.2 正十六烷含量測(cè)定

采用氣相色譜儀Agilent 6890，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱；FID檢測(cè)器；載氣為高純氮?dú)狻?/p>

檢測(cè)程序：檢測(cè)器溫度300 ℃；進(jìn)樣口溫度300 ℃；分流比20∶1；載氣流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。程序升溫為150 ℃保持1 min，以10 ℃/min 的升溫速率上升至 280 ℃并保持1 min。

1.3 降解產(chǎn)物的官能團(tuán)分析

采用紅外光譜分析。

1.4 降解中間產(chǎn)物GC/MS分析

采用Agilent 5973C色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，儀器條件為：VF-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；檢測(cè)器溫度300 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；10∶1的分流比；進(jìn)樣量為1 μL；2.2 mL/min的流量；程序升溫為40℃保持10 min，以8 ℃/min 的升溫速率上升至 200 ℃并保持2 min，再以5 ℃/min 的升溫速率上升至 300 ℃并保持10 min；質(zhì)譜檢驗(yàn)器為EI電離源、電子轟擊能量為1.12×10-17J；連接口溫度250 ℃；質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫：NIST。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)C3降解正十六烷的影響

選用正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，按4%的接種量接種OD600≈1的優(yōu)勢(shì)菌C3菌懸液，溫度分別為25，30，35，40，45 ℃，于150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間分別取樣，氣相檢測(cè)正十六烷的殘留量，結(jié)果如圖1所示。

由圖可知，培養(yǎng)溫度在30～40 ℃時(shí)，正十六烷降解情況良好；當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，降解率最大達(dá)到了95%；培養(yǎng)溫度為45 ℃和25 ℃時(shí)，降解率明顯下降，說明高溫和低溫對(duì)模擬廢水的降解具有明顯的抑制作用。溫度主要通過改變酶反應(yīng)速率來影響菌體的生長(zhǎng)，低溫狀況下，酶活性無法充分激活，代謝活動(dòng)遲緩，導(dǎo)致降解率較低，溫度升高，酶反應(yīng)速率增大，生長(zhǎng)代謝加快。因此，在30～40 ℃時(shí)，高效復(fù)合菌的生化反應(yīng)加快，對(duì)正十六烷的降解率增加。但酶本身易因溫度過高而失去活性，因而在45 ℃時(shí)，降解率大幅度下降。

圖1 溫度對(duì)C3降解正十六烷的影響

目前研究報(bào)道中正十六烷降解菌的最適溫度一般在30～37 ℃之間，當(dāng)溫度高達(dá)40 ℃時(shí)，菌株幾乎不見生長(zhǎng)。菌株C3在溫度為40 ℃條件下表現(xiàn)出較好的降解能力，說明菌株C3體內(nèi)的生物酶具有一定的耐受力，這為較高溫度環(huán)境下的烷烴類降解提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)C3降解正十六烷的影響

選用正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，按4%接種量接種OD600≈1的優(yōu)勢(shì)菌C3菌懸液，搖床轉(zhuǎn)速分別為75，100，125，150，175，200 r/min，于35 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間分別取樣，氣相檢測(cè)正十六烷的殘留量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)C3降解正十六烷的影響

由圖可知，在0～12 h，降解速率基本不受搖床轉(zhuǎn)速影響；12 h后，搖床轉(zhuǎn)速由75 r/min加速到150 r/min時(shí)，降解速率明顯增大，由150 r/min加速到175 r/min時(shí)，降解速率有所增加，但是不夠明顯。12 h之后正十六烷的降解可能屬于氧化反應(yīng)。綜合考慮，選擇150 r/min為最佳搖床轉(zhuǎn)速。

2.3 pH值對(duì)C3降解正十六烷的影響

選用正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基，質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，按4%的接種量接種OD600≈1的優(yōu)勢(shì)菌C3菌懸液，pH值分別為5,6,7,8,9，于35 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間分別取樣，將樣品在常溫下，10 000 r/min條件下高速離心5 min后取上清液，整瓶取樣萃取后采用氣相色譜儀檢測(cè)正十六烷的殘留量。

在pH為2～8范圍內(nèi)，微生物均可生長(zhǎng)，有少數(shù)可以超過這一范圍。雖然微生物生長(zhǎng)的外環(huán)境的pH變化較大，但內(nèi)環(huán)境的pH卻是相當(dāng)穩(wěn)定，大多接近中性[8]。pH值對(duì)C3菌株降解正十六烷的影響如圖3，可以看出有很大的影響。培養(yǎng)48 h后，C3菌株在pH值為6～8范圍內(nèi)都可以較好的生長(zhǎng)，對(duì)正十六烷有較強(qiáng)的降解能力，降解率都可達(dá)到80%以上。當(dāng)pH=5和pH=9時(shí)，降解率急速降低。

圖3 pH對(duì)C3降解正十六烷的影響

菌株C3生長(zhǎng)過程中pH的變化如圖4所示。由圖可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH值越來越低，說明在菌株C3的代謝過程中可能產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，而且是酸性物質(zhì)逐漸增多，不斷累積，在反應(yīng)36 h后，pH達(dá)到最低值。

圖4 菌株C3生長(zhǎng)降解過程中pH的變化

2.4 初始質(zhì)量濃度對(duì)C3降解正十六烷的影響

選用正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基，初始質(zhì)量濃度分別為500，1 000，1 500，2 000，3 000 mg/L，按4%的接種量接種OD600≈1的優(yōu)勢(shì)菌C3菌懸液，于35 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間分別取樣，氣相檢測(cè)正十六烷的殘留量，結(jié)果如圖5所示，可以看出C3菌株對(duì)正十六烷降解能力極強(qiáng)。當(dāng)正十六烷初始質(zhì)量濃度小于1 000 mg/L時(shí)，正十六烷在60 h內(nèi)可以被完全降解。當(dāng)初始質(zhì)量濃度大于1 000 mg/L時(shí)，C3菌株對(duì)正十六烷仍有很強(qiáng)的降解能力，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，60 h內(nèi)，正十六烷的降解率逐漸降低，但是，從每條降解曲線的斜率可知，降解速率卻在增加。C3對(duì)高質(zhì)量濃度的長(zhǎng)鏈烷烴去除，具有重要的意義。

圖5 初始質(zhì)量濃度對(duì)C3降解正十六烷的影響

2.5 正十六烷降解菌的生長(zhǎng)與降解曲線

在正十六烷質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接入4%的種子液，放入35 ℃、150 r/min搖床中震蕩60 h，C3降解正十六烷的生長(zhǎng)曲線和降解曲線如圖6所示。菌株C3的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)正十六烷的降解過程基本同步，表明該菌能利用正十六烷作為唯一碳源促進(jìn)自身生長(zhǎng)，并對(duì)正十六烷有良好的降解效果，培養(yǎng)60 h能將其降解完全。0～9 h，培養(yǎng)液中OD600較低，主要是因?yàn)檎榫哂休^強(qiáng)的疏水性，C3與正十六烷接觸面小，因缺少碳源而生長(zhǎng)較慢；9～42 h后，菌體光密度逐步增長(zhǎng)，此階段C3分泌了一種生物表面活性劑，降低了發(fā)酵液的表面張力，加大了C3與正十六烷的接觸面；培養(yǎng)42 h后，菌株C3進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)速度與衰亡速度基本保持同步；培養(yǎng)51 h后，隨著正十六烷的基本降解完全，C3因缺少碳源而進(jìn)入衰亡期。

圖6 C3對(duì)正十六烷的降解及生長(zhǎng)曲線

2.6 降解動(dòng)力學(xué)研究

采用Monod方程研究菌株C3對(duì)正十六烷的降解規(guī)律[9]。

(1)

式中，v,vmax分別為底物的生物降解速率和最大底物的生物降解速率，mg/(L·h)；Ks是底物半飽和系數(shù)，mg/L；S是底物質(zhì)量濃度，mg/L。

圖7 1/v～1/S關(guān)系圖

2.7 紅外分析

對(duì)1 000mg/L正十六烷降解0,24和48h后的產(chǎn)物進(jìn)行紅外分析，結(jié)果如圖8所示。3 445cm-1為-OH振動(dòng)吸收峰，培養(yǎng)24h后的產(chǎn)物-OH峰明顯增強(qiáng)，說明產(chǎn)生了含有-OH的物質(zhì)，在48h后，又被降解；2 951cm-1為-CH2,-CH3不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；1 642cm-1處為羧基中C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，該基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)紅外譜峰在1 750～1 770cm-1之間；1 537cm-1處為醛基中C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，該基團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)紅外譜峰在1 650～1 750cm-1之間，這主要是因?yàn)檎榈葮O性物質(zhì)的存在使其發(fā)生了紅移。在培養(yǎng)24h后該峰明顯加強(qiáng)，說明菌株C3降解正十六烷，生成了含有羧酸類物質(zhì)和酯類物質(zhì)。

圖8 培養(yǎng)0,24,48 h下樣品FT-IR掃描圖

2.8 氣質(zhì)聯(lián)用

對(duì)菌株C3降解正十六烷的培養(yǎng)液分別在pH=2和pH=9條件下，用二氯甲烷萃取后合并，旋轉(zhuǎn)濃縮后進(jìn)行GC/MS分析，反應(yīng)24h后，檢測(cè)物質(zhì)為：正十六烷、十六烷醇、十五烷醇、十四烷醇、十六烷酸、十五烷酸、十五烷醛、十四烷醛。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)C3對(duì)正十六烷的降解采用末端氧化法，降解機(jī)理有可能為圖9所示。

3 結(jié)論

(1)C3菌株降解正十六烷的最適宜條件為溫度30～40 ℃、pH=7、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。

(3)C3對(duì)正十六烷的降解采用末端氧化法。

圖9 C3降解正十六烷機(jī)理圖

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Conditions Optimization and Mechanism Study of Long-Chain Alkane Degradation by C3

LYU Lijun WANG Guanghua LI Wenbing LU Lulu LIU Nianru CHEN Biao LIU Bei

(CollegeofChemicalEngineeringandTechnology,WuhanUniversityofScienceandTechnologyWuhan430081)

Regarding the mineral salt medium with then-hexadecane as the selecting medium, strain C3 that can effectively degrade the long-chain alkane is screened out from the soil near the pipeline of Wuhan Petrochemical Company. The conditions of degradingn-hexadecane, growth kinetics and mechanism of degradation are studied by shaking flask tests. It is found that the optimum conditions for the growth of strain C3 are under 35℃, pH=7 and 150 r/min of table speed. The growth kinetics research shows that when the concentration ofn-hexadecane is 1 000 mg/L under optimum conditions，then-hexadecane degradation is in accordance with Monod equation, withKsbeing 609.8 mg/L andvmaxbeing 62.1 mg/(L·h). The products from the degradation are analyzed by infrared spectrometer and GC/MS and it is forecast that the degradation is terminal oxidation.

long-chain alkane degradation conditions Monod equation terminal oxidation

呂立君，女，1990年生，武漢市人,碩士研究生，研究方向?yàn)閺U水再生處理。

2015-08-04)