田明新，張道杰，崔小昭，常海濤，孫佳惠，計娓娓，盧東裕

(北京圣元惠仁醫(yī)學檢驗所生化遺傳室 101101)

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·論 著·

氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測系統(tǒng)的性能驗證

田明新，張道杰，崔小昭，常海濤，孫佳惠，計娓娓，盧東裕

(北京圣元惠仁醫(yī)學檢驗所生化遺傳室 101101)

目的 按照ISO15189-2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的要求》對Waters公司ACQUITY TQD 串聯(lián)質(zhì)譜儀及其配套試劑、PerkinElmer公司NeoBaseTMNon-derivatized MSMS kit在測定氨基酸和肉堿方面進行性能驗證。方法 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會指南文件EP15-A2《用戶對精密度和準確度性能的核實實驗——批準指南》提供的方法，對檢測系統(tǒng)進行正確度和精密度驗證；按照衛(wèi)生部行業(yè)標準WS/T408-2012《臨床化學設備線性評價指南》提供的方法，對其進行線性范圍驗證。結(jié)果 6種氨基酸和7種肉堿的相對偏倚為0.13%～11.34%，均小于1/2允許總誤差；批內(nèi)精密度為0.55%～4.78%，均小于1/4允許總誤差；期間精密度除纈氨酸低水平外，為2.52%～7.95%，小于1/3允許總誤差；瓜氨酸、苯丙氨酸、游離肉堿在廠家給出的線性范圍內(nèi)呈一階線性，纈氨酸呈二階線性，其余呈三階線性。結(jié)論 氨基酸及肉堿非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測系統(tǒng)的性能特征驗證通過，可按照常規(guī)臨床化學檢測系統(tǒng)進行管理和要求。

串聯(lián)質(zhì)譜儀； 性能驗證； 正確度； 精密度； 線性范圍

根據(jù)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心數(shù)據(jù)，2013年參加其組織的室間質(zhì)評實驗室中采用非衍生串聯(lián)質(zhì)譜PerkinElmer NeoBase 試劑盒與衍生非配套試劑盒進行氨基酸和肉堿檢測的實驗室比例為8∶16，2014年為20∶21，2015年為34∶17。非衍生串聯(lián)質(zhì)譜法因其前處理時間短，試劑對環(huán)境污染小等優(yōu)點逐漸取代衍生化方法[1-2]，而試劑盒產(chǎn)品因其在研發(fā)階段由廠家負責優(yōu)化和驗證[3]，且可溯源至參考物質(zhì)或參考方法[4]，也正逐步取代自配試劑。然而，對于串聯(lián)質(zhì)譜儀與其配套試劑所組成的檢測系統(tǒng)能否能滿足實驗室預期用途[5]，按照國際標準化組織(ISO)提供的醫(yī)學實驗室專用指南ISO15189-2012《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的要求》，需用戶進行獨立驗證[6]。但實際上，卻少有實驗室進行驗證，個別進行驗證的實驗室，所采用的方法也過于簡單或陳舊，沒有依據(jù)最新國際相關標準、國家標準及行業(yè)標準執(zhí)行，造成其在串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病篩查、診斷領域存在不少問題?；谝陨犀F(xiàn)狀，本實驗室特對Waters公司ACQUITY TQD 串聯(lián)質(zhì)譜儀及其配套試劑、PerkinElmer公司NeoBaseTMNon-derivatized MSMS kit所組成的氨基酸和肉堿配套檢測系統(tǒng)，按照最新標準進行性能驗證[7-8]。驗證內(nèi)容包括正確度、精密度和線性范圍，驗證對象包括瓜氨酸(CIT)、亮氨酸(LEU)、蛋氨酸(MET)、苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、纈氨酸(VAL)和游離肉堿(C0)、丙酰肉堿(C3)、異戊酰肉堿(C5)、辛酰肉堿(C8)、十二碳酰肉堿(C12)、十六碳酰肉堿(C16)和十八碳酰肉堿(C18)共13種。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本均為濾紙干血斑標本。正確度驗證樣本來源于國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的氨基酸和?；鈮A室間質(zhì)評樣本。精密度驗證樣本來源于美國疾病預防控制中心室間質(zhì)評樣本。線性范圍驗證樣品來源于本實驗室既往檢測過的患者標本。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 檢測系統(tǒng) 儀器為美國Waters公司的串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(包括串聯(lián)質(zhì)譜儀ACQUITY TQD、高效液相色譜儀1525μ、自動進樣器2777C)；試劑為美國PerkinElmer公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒(包括氨基酸內(nèi)標準品、酰基肉堿內(nèi)標準品、干血斑質(zhì)控品、V型底耐熱微孔板、V型截底潔凈微孔板、鋁箔制微孔板封套、黏性微孔板封套)和溶劑包(包括萃取液和流動相)。

1.2.2 輔助儀器試劑 孵育振蕩器(Thermo IEMS Incubator/Shaker HT)、甲醇，均為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 正確度驗證方法 選取國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心2015年第2次室間質(zhì)評標本AA201522、AA201525和AC201522、AC201525，其中AA201522和AA201525為6項氨基酸低水平和高水平正確度驗證標本，AC201522和AC201525為7項肉堿低水平和高水平正確度驗證標本。用直徑3.2 mm打孔器在濾紙干血斑上各打1孔取樣，至于V型截底潔凈微孔板，每孔加入內(nèi)標工作液100 μL，45 ℃密封振蕩45 min，提取75 μL萃取液轉(zhuǎn)移至V型底耐熱微孔板，鋁箔覆蓋，上機檢測，每標本每天重復測定2次，共5 d。

1.3.2 精密度驗證方法 選取美國疾病預防控制中心2015年第2次室間質(zhì)評標本AA1522、AA1524和AC1562、AC1564，其中AA1522和AA1524為6項氨基酸精密度驗證的低水平和高水平標本，AC1562和AC1564為7項肉堿精密度驗證的低水平和高水平標本。前處理與正確度驗證試驗相同，上機后每標本每天重復測定3次，共5 d。

1.3.3 線性范圍驗證方法 選取本實驗室既往檢測過的高值和低值可覆蓋廠家線性范圍的氨基酸、肉堿濾紙干血斑標本，部分項目不能覆蓋廠家線性范圍時，只驗證本實驗室檢測到的最高或最低水平范圍。用直徑3.2 mm打孔器在高值和低值濾紙干血斑上各打4孔取樣，置于V型截底潔凈微孔板，每孔加入內(nèi)標工作液100 μL，45 ℃密封振蕩45 min，每孔吸取75 μL，將4孔高值標本萃取液H和4孔低值標本萃取液L分別混合，按4L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、4H配制成5個水平的萃取液，各轉(zhuǎn)移100 μL至V型底耐熱微孔板，鋁箔覆蓋，上機檢測，每個水平重復測定4次，1 d內(nèi)完成。

1.4 統(tǒng)計學處理

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

1.4.2 精密度驗證 采用MicrosoftExcel2007軟件按照CLSIEP15-A2《用戶對精密度和準確度性能的核實實驗——批準指南》提供的方法計算批內(nèi)精密度(CVR)和期間精密度(CVL)，將CVR和CVL分別與廠家聲明值(CVR1/4 TEA，CVL為1/3 TEA)比較。小于廠家聲明值，驗證通過；否則計算CVR和CVL驗證值，并與之進行比較，小于驗證值則判定通過，否則判定未通過。

CVR、批內(nèi)標準差(SR)、CVL、期間標準差(SL)、批間標準差(SB)、批內(nèi)精密度驗證值(CVR-驗)、期間精密度驗證值(CVL-驗)、期間精密度有效自由度T計算如式(6)至式(13)。

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

df=L×R-Rdf

(18)

(19)

2 結(jié) 果

2.1 正確度驗證 CIT、TYR、C5、C12、C18水平及MET、VAL、C8低水平和LEU、C0、C16高水平驗證區(qū)間均涵蓋靶值，即用驗證區(qū)間驗證法通過正確度驗證；其余項目進一步計算Bias，通過比較均小于標準相對偏倚，即用TEA驗證法通過正確度驗證。全部13個項目正確度驗證均通過。

2.2 精密度驗證 除VAL低水平CVL外均小于廠家聲明值，即用廠家聲明值驗證法通過精密度驗證；VAL低水平CVL大于廠家聲明值，需計算其驗證值并進行比較。通過比較，VAL低水平CVL小于驗證值，故用驗證值再驗證法通過精密度驗證。全部13個項目精密度驗證均通過。

2.3 線性范圍驗證 CIT、LEU、PHE、VAL線性范圍上、下限驗證均通過；MET、TYR、C0、C3、C5、C8、C12、C16、C18線性范圍下限驗證通過，上限由于PerkinElmer公司給出線性范圍超出本實驗室檢測標本水平范圍，暫未進行驗證，目前僅驗證至本實驗室可檢測的最高水平范圍，且驗證通過。見表1、表2。

表1 氨基酸性能驗證結(jié)果

表2 肉堿性能驗證結(jié)果

3 討 論

本研究通過對正確度和精密度的驗證發(fā)現(xiàn)，Waters公司ACQUITY TQD 串聯(lián)質(zhì)譜儀及其配套試劑PerkinElmer公司NeoBaseTMNon-derivatized MSMS kit所組成的氨基酸和肉堿檢測系統(tǒng)，其Bias為0.13%～11.34%，均小于1/2TEA，但不同檢測項目的偏倚范圍相差較大，即使同一檢測項目其高值和低值偏倚程度也無規(guī)律可循，可能與各檢測項目的內(nèi)標準品穩(wěn)定性不同有關；CVR為0.55%～4.78%，除VAL低水平外批間精密度為2.44%～7.87%，CVL為2.52%～7.95%，符合臨床化學檢測系統(tǒng)期間精密度大于批間精密度大于批內(nèi)精密度的一般規(guī)律。VAL低水平CVL雖然大于廠家聲明值，但是小于其驗證值，故通過精密度驗證。

線性范圍驗證試驗方案的設計重點在于如何獲取系列水平樣本。有學者采用打孔后取1、1/2、1/4、1/8血斑獲取系列水平樣本[9]，但該法由于打卡后血斑太小(3.2 mm)而不易于獲取理想水平標本。本研究通過摸索，找到獲取系列水平標本方法：將高、低水平濾紙干血斑標本分別打4孔，正常孵育振蕩，提取萃取液后再將高、低水平萃取液按不同比例混合制成所需水平梯度水平樣本。此外，通過對線性范圍驗證發(fā)現(xiàn)，廠家提供某些產(chǎn)品項目的線性范圍較窄，不能覆蓋日常檢測標本的水平范圍。如廠家的CIT線性范圍為28～1 716 μmol/L，功能敏感性為4.7 μmol/L，而本實驗室標本中CIT最低水平值為1.77 μmol/L，不僅低于廠家線性范圍下限，也低于功能敏感性，且其他檢測項目也有類似現(xiàn)象。故廠家的線性范圍或可報告范圍還需進一步擴展[10]，實驗室也應根據(jù)實際情況各自建立線性范圍。

綜上所述，本研究對氨基酸及肉堿串聯(lián)質(zhì)譜法配套檢測系統(tǒng)的性能特征進行驗證，認為雖在標本類型[11]、前處理、檢測原理等方面與常規(guī)臨床化學設備顯著不同，但該檢測系統(tǒng)仍可按照常規(guī)臨床化學檢測系統(tǒng)的相關標準進行管理和要求[12]。

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[7]CLSI.EP 15-A2-2005 User verification of performance for precision and trueness,approved guideline-second edition[S].Wayne,PA,USA:CLSI,2005.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T 408-2012.臨床化學設備線性評價指南[S].北京:中華人民共和國衛(wèi)生部,2012.

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Verification of the performance of non-derivatized tandem mass spectrometry method in detecting the amino acids and carnitines

TIANMingxin,ZHANGDaojie,CUIXiaozhao,CHANGHaitao,SUNJiahui,JIWeiwei,LUDongyu

(DepartmentofBiochemicalGeneticsofBeijingShengyuanHuirenClinicalLaboratoryLtd.,Beijing101101,China)

Objective To verify the performance of Waters ACQUITY TQD tandem mass spectrometry and PerkinElmer NeoBaseTMNon-derivatized MSMS kit in detecting the amino acids and carnitines.And ISO15189-2012 Medical laboratories-Requirements for quality and competence were the reference.Methods The accuracy and precision were verified according to Clinical and Laboratory Standards Institute documents,EP15-A2 User Verification of Performance for Precision and Trueness:Approved Guideline.The linear ranges were verified according to industry regulations of Ministry of Health,WS/T 408-2012 Linear Evaluation Guideline of Clinical Chemistry Equipment.Results The relative bias of 6 kinds of amino acids and 7 kinds of carnitines were from 0.13% to 11.34%,which were all lower than 1/2 total error.The within precisions were from 0.55% to 4.78%,which were all lower than 1/4 total error.And the intermediate precisions were from 2.52% to 7.95%,which were all lower than 1/3 total error except valine low level.The linear ranges of citrulline,phenylalanine and free carnitine were into first order linear within the linear range provided by the company.Valine was into second order linear and the rest amino acids were into third order linear.Conclusion The verification of performance of non-derivatized tandem mass spectrometry method in detecting the amino acids and carnitines are passed,and it can be managed and requested in accordance with the routine clinical chemical detection system.

tandem mass spectrometer; performance verification; accuracy; precision; linear range

田明新，女，主管技師，主要從事遺傳代謝病檢驗方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.027

A

1673-4130(2016)21-3021-04

2016-02-07

2016-04-27)