管振祺，何鳳屏△，邱世潔，張相國，馬占忠，劉玉蘭，郭艷樂，張河林，張 思

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東汕頭 512026；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東汕頭 523770)

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·論 著·

EB病毒DNA定量檢測在鼻咽癌臨床分期中的診斷價值*

管振祺1，何鳳屏1△，邱世潔2#，張相國1，馬占忠1，劉玉蘭1，郭艷樂1，張河林1，張 思1

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東汕頭 512026；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東汕頭 523770)

目的 探討EB病毒(EBV)DNA定量檢測在鼻咽癌患者不同臨床分期中的診斷價值。方法 選取廣東省汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院2013年3月至2015年12月500例病理診斷為鼻咽癌的患者作為研究組，同時選取200例健康體檢人群作為對照組。2組同時采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測血漿EBV-DNA的表達(dá)量，并對2組之間及臨床TNM分期I、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ的結(jié)果進(jìn)行比較；再將其分別與酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法檢測的血清EBV病毒殼抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 熒光定量PCR方法檢測EBV-DNA表達(dá)量中，研究組陽性率75.00%，對照組陽性率9.00%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。鼻咽癌患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與臨床TNM分期呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；鼻咽癌分期越晚，血漿EBV-DNA拷貝數(shù)越高。結(jié)論 血漿EBV-DNA水平與鼻咽癌患者臨床TNM分期有顯著相關(guān)性，可作為評估鼻咽癌患者臨床分期的1種輔助性分子生物指標(biāo)，具有較高應(yīng)用價值。

鼻咽癌； EB病毒； 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

大量研究證實，EB病毒(EBV)與鼻咽癌關(guān)系密切[1]。目前，EBV采用于臨床的檢驗指標(biāo)包括病毒殼抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)、早期抗原免疫球蛋白A(EA-IgA)、EBV特異性DNA酶(EBV-DNase)抗體水平及血漿EBV-DNA定量測定[2-3]。其中血漿EBV-DNA定量測定是近年發(fā)展起來的EBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測技術(shù)[3]，但EBV-DNA與鼻咽癌分期尚不清楚。本研究對廣東省汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院(后簡稱粵北人民醫(yī)院)200例初治、300例復(fù)診的鼻咽癌患者血漿EBV-DNA定量測定結(jié)果進(jìn)行分析，并探討其在鼻咽癌臨床分期的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年3月至2015年12月在粵北人民醫(yī)院病理確診為鼻咽癌患者500例作為研究組(初治200例、復(fù)診300例)，年齡23～75歲；男307例，女193例。所有的患者按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)和世界衛(wèi)生組織2002標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型[4]，其中Ⅰ型8例(占總數(shù)1.6%)，Ⅱ型39例(占總數(shù)7.8%)，Ⅲ 型453例(占總數(shù)90.6%)。500例患者中T1期52例，T2期93例，T3期218例，T4期137例；N0期104例，N1期160例，N2期197例，N3期39例；M0期471例，M1期29例。同期選取本院健康體檢人群200例作為對照組，年齡25～65歲。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和受檢者的知情同意。

1.2 儀器與試劑 EBV-DNA檢測試劑盒購自達(dá)安基因股份有限公司，采用TapMan熒光探針基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增法，檢測方法參考試劑說明書。VCA-IgA檢測試劑盒購自北京貝爾生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 分別用促凝管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管抽取患者靜脈血2 mL，全血經(jīng)3 000 r/min離心，分離獲得血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書操作進(jìn)行DNA提取。EBV-DNA定量測定均采用熒光定量PCR法[3]。DNA水平大于1×103copy/mL判斷為陽性[4]，DNA水平小于或等于1×103copy/mL判斷為陰性。

1.3.2 EBV-VCA-IgA檢測(ELISA法) 采用ELISA方法檢測血清中VCA-IgA，Cut-off值小于0.08為陰性，大于或等于0.08且小于或等于0.80為弱陽性(可疑)，大于0.80為陽性。具體步驟：取出試劑盒置室溫平衡30 min，將20×洗滌液用蒸餾水做20倍稀釋。取出包被板，做好標(biāo)記，留1個孔作空白對照，將板條固定于板架上，剩余板條用不干膠密封并放入密封袋中保存。陰性對照孔3個，陽性對照孔1個，各加入100 μL對照血清?？瞻讓φ湛?個空置，其余每個孔加入100 μL樣品稀釋液，每個孔加入待測樣品10 μL，將反應(yīng)板輕輕震蕩使樣品混勻。用封板膜封板后，置37 ℃溫箱中反應(yīng)30 min。溫育后，吸干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板5次，每次浸泡30～60 s。每孔加入100 μL酶標(biāo)工作液，空白孔除外。用封板膜封板后，置37 ℃溫箱中反應(yīng)30 min。用洗滌液洗板5次，每次浸泡30～60 min。每孔加入終止液50 μL，輕輕震蕩混勻。酶標(biāo)儀450 nm比色測量Cut-off值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理。血漿EBV-DNA拷貝數(shù)及陽性率采用非參數(shù)檢驗方法(Kruskal-Wallis)和χ2檢驗。比較不同T分期、N分期、M分期的EBV-DNA拷貝數(shù)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組檢測結(jié)果 研究組熒光定量PCR方法的陽性率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究組ELISA方法的陽性率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究組熒光定量PCR方法的陽性率高于ELISA方法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 IgA抗體和EBV-DNA在研究組和對照組陽性率比較(%)

2.2 EBV陽性率與鼻咽癌患者臨床分期的關(guān)系 500例鼻咽癌患者血漿EBV-DNA定量測定EBV陽性率為78.5%(392/500)，其中強(qiáng)陽性72例(14.4%)，陽性230例(46.0%)，弱陽性90例(18.0%)。比較不同T分期的EBV-DNA拷貝數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=37.31，P=0.000)，見表2。比較不同N分期的EBV-DNA拷貝數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=61.77，P=0.000)，見表3。比較不同M分期的EBV-DNA拷貝數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=71.82，P=0.000)，見表4。

表2 T分期與EBV-DNA定量測定關(guān)系(copy/mL)

表3 N分期與EBV-DNA定量測定關(guān)系(copy/mL)

表4 M分期與EBV-DNA定量測定關(guān)系(copy/mL)

2.3 2種方法在不同臨床分期檢測結(jié)果的比較 在TNM分期中，EBV-DNA陽性率(92.80%)高于VCA-IgA(69.40%)，ELSIA方法檢測Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者VCA-IgA陽性率分別為64.00%和82.60%，而PCR方法檢測Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者EBV-DNA陽性率分別為93.10%和94.00%，2種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，2種方法Ⅲ期、Ⅳ期結(jié)果分別與Ⅰ期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2種方法Ⅲ期、Ⅳ期結(jié)果分別與Ⅱ期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EBV-DNA陽性率隨著臨床分期增高而增高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VCA-IgA陽性率在各臨床分期間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 2種方法在不同臨床分期檢測結(jié)果的比較[n(%)]

3 討 論

鼻咽癌是1種與EBV密切相關(guān)的惡性腫瘤。目前臨床應(yīng)用廣泛的EBV的血清標(biāo)志物檢測指標(biāo)有VCA-IgA、EA-IgA、EBV-DNase和血漿EBV-DNA定量測定。前3種方法較早用于臨床，但單項檢測均存在一定的局限性，聯(lián)合檢測有較高敏感性和特異性，對鼻咽癌普查、早期診斷有臨床意義[5-6]。血漿EBV-DNA定量測定較晚用于臨床，但對鼻咽癌的診斷及預(yù)后預(yù)測有更大優(yōu)勢[7-9]。

TNM分期指導(dǎo)下的個體化綜合治療已成為腫瘤治療的規(guī)范。由于核磁共振成像(MRI)廣泛用于臨床及對鼻咽癌生物學(xué)行為的不斷了解，國內(nèi)確立了基于MRI的鼻咽癌“中國2008TNM分期”，不過目前關(guān)于鼻咽癌臨床分期均缺乏分子生物學(xué)指標(biāo)。本研究500例患者資料中，鼻咽癌患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與T分期顯著相關(guān)(χ2=37.31，P=0.000)。隨著T分期的進(jìn)展，血漿EBV-DNA拷貝數(shù)越高，T3期、T4期患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)顯著高于T1期、T2期，其機(jī)制可能是受EBV感染機(jī)體內(nèi)，血漿EBV-DNA拷貝數(shù)高低直接反映了EBV復(fù)制的活躍程度，隨著原發(fā)灶的增大，血漿EBV-DNA拷貝數(shù)隨之增大[10]。筆者結(jié)果提示T2與T3期，T3與T4期組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Zhang等[11]也證實EBV-DNA拷貝數(shù)與T分期有顯著正相關(guān)關(guān)系。

鼻咽癌患者在初診時有65.00%～80.00%患者發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究中鼻咽癌患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與N分期有顯著相關(guān)性(χ2=61.77，P=0.000)，筆者認(rèn)為隨N分期的遞增，患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)增高，N0分期EBV-DNA拷貝數(shù)最低，N3分期EBV-DNA拷貝數(shù)最高。有學(xué)者報道血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與N分期呈正相關(guān)關(guān)系，從另一個角度說明血漿EBV-DNA拷貝數(shù)越高，淋巴轉(zhuǎn)移越廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與M分期有顯著相關(guān)性(χ2=71.82，P=0.000)，研究結(jié)果顯示M1分期EBV-DNA拷貝數(shù)高于M0分期(P<0.05)，其機(jī)制可能與血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)移的腫瘤負(fù)荷有關(guān)， EBV-DNA可能由腫瘤細(xì)胞釋放進(jìn)入外周血，隨著病情的進(jìn)展，血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)會相應(yīng)增加，Zhang等[11]報道鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。

本研究評價熒光定量PCR和ELISA 2種方法對鼻咽癌的診斷價值。熒光定量PCR具有常規(guī)PCR的高敏感性，能克服常規(guī)PCR技術(shù)不能定量及易污染問題；此外，采用熒光探針，可直接探測到PCR擴(kuò)增中熒光信號變化，實現(xiàn)實時熒光定量檢測。研究中發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR方法測定EBV感染陽性率顯著高于ELISA血清學(xué)方法，且陽性率隨著鼻咽癌進(jìn)展而增加。近年來，有學(xué)者認(rèn)為熒光定量PCR法對鼻咽癌分期診斷有較高的敏感性[12]，可作為鼻咽癌預(yù)后評價指標(biāo)之一，而ELISA方法對鼻咽癌分期診斷敏感性較低。筆者研究顯示，ELISA方法檢測EBV感染陽性率顯著低于熒光定量PCR方法且對分期并不敏感。ELISA方法作為醫(yī)院免疫室常規(guī)檢測方法，與熒光定量PCR方法比較價格相對低廉、無需特殊設(shè)備，但操作較繁瑣、主觀性強(qiáng)，只適用于大規(guī)模人群篩查。

綜上所述，血漿EBV-DNA拷貝數(shù)與鼻咽癌TNM的臨床分期呈正相關(guān)，鼻咽癌TNM分期越高，患者血漿EBV-DNA拷貝數(shù)越高。因此，血漿中EBV-DNA拷貝數(shù)可在分子水平上反映鼻咽癌患者的病情程度，對鼻咽癌的預(yù)后評價具有較大的臨床意義[13]。

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Diagnostic value of Epstein-Barr virus DNA detection in the clinical staging of patients with nasopharyngeal carcinoma*

GUANZhenqi1,HEFengping1△,QIUShijie2#,ZHANGXiangguo1,MAZhanzhong1,LIUYulan1,GUOYanle1,ZHANGHelin1,ZHANGSi1

(1.YuebeiPeople′sHospitalAffiliatedtoShantouUniversityMedicalCollege,Shantou,Guangdong512026,China;2.GuangdongMedicalUniversity,Shantou,Guangdong523770,China)

Objective To discuss the diagnostic value of Epstein-Barr virus DNA(EBV-DNA) detection in the clinical TNM staging of patients with nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods A total of 500 patients with NPC were selected as research group from March 2013 to December 2015 analyzed.At the same time,200 healthy people were chosen as control group.By real time quantitative PCR,the level of EBV-DNA in plasma was detected in all the subjects and compared between the two groups as well as between Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ staging.In addition,using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),serum EBV coat antigens-IgA(VCA-IgA) were detected.Results The positive rate of plasma EBV-DNA in research group(75.00%) was significantly higher than that of control group(9.00%,P<0.05).The copy numbers of plasma EBV-DNA in patients with NPC was positively correlated with TMN staging(P<0.05),the later the TNM staging,the more the copy numbers of plasma EBV-DNA.Conclusion The plasma level of EBV-DNA is correlated with TNM staging of patients with NPC.Detection of plasma EBV-DNA is valuable for the diagnosis of NPC which can be used as an auxiliary molecular biological index for TNM staging.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus; TNM staging; real time quantitative PCR

華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實驗室開放基金(HN2014-07)；廣東省韶關(guān)市衛(wèi)生和計劃生育局立項項目(Y15070)。

管振祺，男，主管技師，主要從事分子腫瘤學(xué)方面的研究。

△通訊作者，E-mail:fengphe@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.005

A

1673-4130(2016)21-2961-03

2016-02-01

2016-04-21)

#共同第一作者。何鳳屏，女，主任技師，主要從事分子腫瘤學(xué)方面的研究。