時(shí)景仁，郭向華，王珊珊，劉 凱，喬錄新，張玉林，陳德喜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院/北京市肝病研究所，北京 100069)

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·論 著·

成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬水平研究*

時(shí)景仁，郭向華，王珊珊，劉 凱，喬錄新，張玉林，陳德喜△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院/北京市肝病研究所，北京 100069)

目的 采用新型成像流式細(xì)胞儀量化檢測(cè)細(xì)胞自噬水平，完善自噬檢測(cè)手段。方法 用綠色熒光蛋白(GFP)-微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞和H1299細(xì)胞，并進(jìn)行24 h饑餓處理，誘導(dǎo)自噬發(fā)生，分別用熒光顯微鏡拍照、蛋白免疫印跡法和成像流式細(xì)胞術(shù)3種方法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平。用IDEAS軟件對(duì)成像流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞自噬結(jié)果進(jìn)行量化分析。結(jié)果 熒光顯微鏡顯示，Huh7細(xì)胞比H1299細(xì)胞中的自噬斑點(diǎn)少；蛋白免疫印跡法顯示，與H1299細(xì)胞比較，Huh7細(xì)胞LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比例較低，但2種方法均不能獲得通量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。成像流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示細(xì)胞自噬圖像，2種細(xì)胞的GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率基本一致(25.2%和27.6%)；比較兩者發(fā)生高水平自噬(LC3斑點(diǎn)數(shù)目為6個(gè)以上)的細(xì)胞比例，Huh7細(xì)胞僅為9.0%，顯著少于H1299細(xì)胞(26.2%)。結(jié)論 采用新型成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬，兼具量化分析和成像的優(yōu)點(diǎn)，能彌補(bǔ)熒光顯微鏡和蛋白免疫印跡法的不足，是一種更優(yōu)秀的自噬檢測(cè)方法。

自噬； 成像流式細(xì)胞儀； 微管相關(guān)蛋白輕鏈3

自噬是指細(xì)胞為維持自身穩(wěn)態(tài)，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)，進(jìn)行分解代謝的一種重要保守過(guò)程[1]。自噬參與了機(jī)體眾多的生理和病理過(guò)程，如炎性反應(yīng)、衰老、腫瘤、神經(jīng)變性、心血管疾病及感染等[2]。檢測(cè)細(xì)胞自噬水平是科研工作中的重要部分。目前傳統(tǒng)的自噬檢測(cè)技術(shù)并不完美：在電子顯微鏡下能夠直接觀察到細(xì)胞的自噬狀態(tài)，但需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作；微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)是自噬體的標(biāo)志物[3]，用熒光顯微鏡檢測(cè)和計(jì)算LC3斑點(diǎn)數(shù)目存在主觀性強(qiáng)、統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法待規(guī)范等問(wèn)題；蛋白免疫印跡法需要與熒光顯微鏡成像相結(jié)合才能準(zhǔn)確判定細(xì)胞自噬活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)自噬雖然具有高通量的特點(diǎn)，但缺乏圖像數(shù)據(jù)佐證[4]。筆者采用新型成像流式細(xì)胞儀，對(duì)Huh7細(xì)胞和H1299細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行檢測(cè)，將流式細(xì)胞術(shù)的高通量數(shù)據(jù)處理能力與細(xì)胞成像相結(jié)合，對(duì)自噬檢測(cè)手段進(jìn)行完善?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人肝癌細(xì)胞系Huh7和人肺癌細(xì)胞系H1299由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；綠色熒光蛋白(GFP)-LC3質(zhì)粒由美國(guó)南加州大學(xué)歐競(jìng)雄教授惠贈(zèng)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法蛋白水平測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)基因有限公司；所用儀器為德國(guó)Merck公司的ImageStreamX MarkⅡ成像流式細(xì)胞儀和日本Nikon公司80i熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 將Huh7細(xì)胞和H1299細(xì)胞按照5×104/mL分別接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以5%CO2、37 ℃的條件進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，24 h后換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行饑餓處理24 h；同時(shí)設(shè)立正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對(duì)照。

1.3.2 熒光顯微鏡和蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬 細(xì)胞經(jīng)過(guò)饑餓處理24 h后，采用熒光顯微鏡觀察GFP-LC3 熒光斑點(diǎn)并拍照。同時(shí)，收集細(xì)胞于高鹽蛋白裂解液中，4 ℃裂解20 min后，全速離心收集上清液，即為所提細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白水平測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集的細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)蛋白的表達(dá)，X 線膠片曝光。

1.3.3 成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬 細(xì)胞經(jīng)過(guò)饑餓處理24 h后，用胰酶進(jìn)行消化并離心收集，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)清洗細(xì)胞2次后，重懸在含1%胎牛血清、0.1%疊氮鈉的PBS溶液中，上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)本收集5 000個(gè)事件。儀器設(shè)置如下：488 nm激光功率為10 mW；758 nm激光功率為0.55 mW；成像放大40倍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用儀器配置的IDEAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬 與正常培養(yǎng)的細(xì)胞比較，經(jīng)過(guò)饑餓處理后，細(xì)胞出現(xiàn)顯著的自噬斑點(diǎn)。Huh7細(xì)胞與H1299細(xì)胞比較，其饑餓產(chǎn)生的自噬斑點(diǎn)相對(duì)較少，見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬

2.2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬 與正常培養(yǎng)的細(xì)胞比較，經(jīng)過(guò)饑餓處理后，細(xì)胞LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例顯著增高。Huh7細(xì)胞與H1299細(xì)胞比較，LC3-Ⅱ的產(chǎn)生較少，細(xì)胞LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比例較低，見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬

2.3 成像流式細(xì)胞儀圈門(mén)策略 成像流式細(xì)胞儀所記錄的每一事件均可從IDEAS軟件中獲得相應(yīng)的圖像，每一事件用圖像左上角的標(biāo)號(hào)進(jìn)行區(qū)別標(biāo)注，圖像左側(cè)展示21個(gè)H1299細(xì)胞在明場(chǎng)和488 nm激光通道的圖像。為了方便對(duì)自噬水平和發(fā)生自噬的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圈門(mén)時(shí)，首先選定聚焦清晰的細(xì)胞，接著在聚焦清晰群中再圈定單個(gè)細(xì)胞，然后從單個(gè)細(xì)胞群中選取轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒成功的GFP陽(yáng)性細(xì)胞，最后對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞中存在不同自噬斑點(diǎn)個(gè)數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)處理，見(jiàn)圖3。筆者在本試驗(yàn)中設(shè)定了3種細(xì)胞群，其自噬斑點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為：0個(gè)(無(wú)自噬)；1～5個(gè)(低水平自噬)；6個(gè)及以上(高水平自噬)。每個(gè)標(biāo)本記錄5 000個(gè)細(xì)胞，有效細(xì)胞數(shù)目約為1 000個(gè)。

2.4 計(jì)數(shù)LC3斑點(diǎn) 為了定量某個(gè)細(xì)胞中LC3斑點(diǎn)的數(shù)目，軟件中采用斑點(diǎn)計(jì)數(shù)性能。斑點(diǎn)計(jì)數(shù)性能通過(guò)發(fā)現(xiàn)圖像中顯著高于區(qū)域背景的熒光信號(hào)來(lái)鑒別斑點(diǎn)，再采用點(diǎn)的適當(dāng)大小和縱橫比確定斑點(diǎn)，以克服高背景熒光和非特異染色干擾。一旦判定方式確定，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)性能就能自動(dòng)對(duì)圖像中的斑點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。斑點(diǎn)計(jì)數(shù)范圍，橫坐標(biāo)表示細(xì)胞中自噬斑點(diǎn)的數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞頻次，即含有某個(gè)自噬斑點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量，見(jiàn)圖4A；每種數(shù)目范圍的斑點(diǎn)圖像，每個(gè)斑點(diǎn)數(shù)目選取5個(gè)細(xì)胞圖像作為代表，見(jiàn)圖4B。

圖3 成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬的圈門(mén)策略

圖4 含有不同斑點(diǎn)數(shù)目的細(xì)胞圖像

2.5 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率及具有不同LC3斑點(diǎn)數(shù)目的細(xì)胞比例 經(jīng)過(guò)饑餓處理后，Huh7和H1299細(xì)胞均有不同程度的自噬產(chǎn)生。Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒成功的細(xì)胞有27.6%，具有LC3斑點(diǎn)數(shù)目為0個(gè)、1～5個(gè)和6個(gè)及以上的細(xì)胞比例分別為：25.1%、65.9%和9.0%，見(jiàn)圖5A；H1299細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒成功的細(xì)胞有25.2%，具有LC3斑點(diǎn)數(shù)目為0個(gè)、1～5個(gè)和6個(gè)及以上的細(xì)胞比例分別為31.6%、42.0%、26.2%，見(jiàn)圖5B。

2.6 量化分析比較Huh7和H1299細(xì)胞的自噬水平 GFP-LC3質(zhì)粒對(duì)于2種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率基本相同；與Huh7細(xì)胞比較，H1299細(xì)胞發(fā)生低水平自噬(LC3斑點(diǎn)數(shù)目為1～5個(gè))的細(xì)胞比例較少，而發(fā)生高水平自噬(LC3斑點(diǎn)數(shù)目為6個(gè)以上)的細(xì)胞比例顯著增多。見(jiàn)表1。

表1 量化分析比較Huh7和H1299細(xì)胞的自噬水平[n(%)]

圖5 GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率以及具有不同LC3斑點(diǎn)數(shù)目的細(xì)胞比例

3 討 論

自噬(本研究中指大自噬)可被營(yíng)養(yǎng)饑餓、應(yīng)激、缺氧、活性氧物質(zhì)及Toll樣受體激活劑等誘導(dǎo)發(fā)生[5]。自噬開(kāi)始后，細(xì)胞質(zhì)中形成1個(gè)新月形狀的雙層膜結(jié)構(gòu)(即吞噬泡或者分離膜)，其中包繞著錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器或者再循環(huán)的細(xì)胞質(zhì)成分等。吞噬泡的膜繼續(xù)延伸封閉部分細(xì)胞質(zhì)，形成完全閉合的雙層膜囊泡(即自噬體)。自噬體通過(guò)與溶酶體融合而形成自噬溶酶體，自噬體中的物質(zhì)在自噬溶酶體中被酸性水解酶降解。LC3是自噬體的1個(gè)標(biāo)志物。新合成的LC3蛋白經(jīng)加工后成為L(zhǎng)C3-Ⅰ，位于細(xì)胞質(zhì)中。隨后LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE) 連接，通過(guò)泛素化樣酶促反應(yīng)成為L(zhǎng)C3-Ⅱ，與自噬體的內(nèi)膜和外膜均結(jié)合，自噬體內(nèi)膜的LC3-Ⅱ在自噬溶酶體中被降解而進(jìn)入再循環(huán)[6]。

目前，LC3的合成率、LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化率和LC3通量是檢測(cè)細(xì)胞自噬的通用指標(biāo)[4]。檢測(cè)方法包括：(1)采用電子顯微鏡檢測(cè)LC3的亞細(xì)胞定位、計(jì)算LC3斑點(diǎn)。(2)采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染GFP-LC3細(xì)胞的內(nèi)源性LC3或者GFP-LC3定位。(3)通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變。但是，上述方法均不理想。用電子顯微鏡評(píng)估自噬體的數(shù)量需要相關(guān)專(zhuān)家，使得研究者們更廣泛地使用熒光顯微鏡評(píng)估自噬體，然而，其缺點(diǎn)在于：自噬體數(shù)目的判定存在一定主觀性，定量方法和對(duì)LC3斑點(diǎn)的定義標(biāo)準(zhǔn)均需要制訂統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；細(xì)胞內(nèi)源性LC3或GFP-LC3如果過(guò)度表達(dá)或與其他有聚集傾向的蛋白共表達(dá)，會(huì)產(chǎn)生非特異GFP-LC3聚集物，不能與真正的自噬體區(qū)分[7]。蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3-Ⅱ的量一般與自噬體數(shù)量相關(guān)，但有報(bào)道指出，即使自噬體和自噬通量受到抑制，仍可檢測(cè)到LC3-Ⅱ[8-9]。因此，蛋白免疫印跡法需要與熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP-LC3的方法或其他形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合，以評(píng)估細(xì)胞的自噬活性。此外，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、結(jié)果不穩(wěn)定和僅能半定量也是此傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)。

傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)能快速高通量分析大量細(xì)胞，并獲得細(xì)胞群體的各種統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，但細(xì)胞在散點(diǎn)圖上只表示為1個(gè)點(diǎn)，而不是真實(shí)的細(xì)胞圖像，因此無(wú)法進(jìn)行基于圖像信息的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用熒光顯微鏡能夠觀察基于圖像分析的試驗(yàn)，記錄圖像，然后采用圖像分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，但顯微鏡能夠觀察的細(xì)胞數(shù)量非常有限，很難提供細(xì)胞群體的量化與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；手動(dòng)分析數(shù)據(jù)耗費(fèi)大量人力和時(shí)間；受試驗(yàn)人員的主觀因素影響，試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性較差。量化成像分析流式細(xì)胞儀是近年來(lái)發(fā)展應(yīng)用的新型流式細(xì)胞儀[10]。它將流式細(xì)胞術(shù)的高通量分析與熒光顯微成像的形態(tài)學(xué)分析相結(jié)合，對(duì)通過(guò)流動(dòng)室的細(xì)胞逐個(gè)采集圖像，并采用圖像分析軟件對(duì)每個(gè)細(xì)胞圖像的形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行量化分析，不僅可提供基于流式分析的細(xì)胞群統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，還可獲得各種細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布的量化成像信息。

目前，國(guó)際上已有多個(gè)關(guān)于采用新型流式細(xì)胞儀對(duì)自噬進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道[11-13]，筆者在本研究中采用成像流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞自噬活性進(jìn)行檢測(cè)。GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7和H1299細(xì)胞效率基本一致，但2種細(xì)胞發(fā)生自噬的水平有較大差別。H1299細(xì)胞有更多自噬斑點(diǎn)產(chǎn)生，這與細(xì)胞系背景不同有關(guān)。成像流式細(xì)胞術(shù)獲得的結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果、蛋白免疫印跡結(jié)果基本一致，但前者檢測(cè)自噬的方法明顯優(yōu)于后兩者。高通量的數(shù)據(jù)處理能力優(yōu)于熒光顯微鏡；每個(gè)細(xì)胞能獲得相應(yīng)的熒光圖像，可直觀看到自噬斑點(diǎn)的存在，在此方面成像流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)于蛋白免疫印跡法。國(guó)內(nèi)目前對(duì)于成像流式細(xì)胞儀的使用還處于起步階段，筆者希望通過(guò)本試驗(yàn)建立細(xì)胞自噬檢測(cè)新方法，并加以推廣應(yīng)用，助力科研工作。

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Disscution of autophagy detection by imaging flow cytometer*

SHIJingren,GUOXianghua,WANGShanshan,LIUKai,QIAOLuxin,ZHANGYulin,CHENDexi△

(BeijingYouanHospitalAffiliatedofCapitalMedicalUniversity/BeijingInstituteofHepatology,Beijing100069,China)

Objective To detect autophagy levels in the cells by a novel imaging flow cytometer,and to improve the detection methods of autophagy.Methods GFP-LC3 plasmid was transfected into Huh7 or H1299 cells,respectively,followed by starvation for 24 hours in order to induce autophagy.Autophagy levels in the cells were detected by three ways:fluorescence microscopy,western blotting and imaging flow cytometry.Quantified analysis of cellular autophagy data from the imaging flow cytometer was performed by IDEAS software.Results Fluorescence microscopy showed that the numbers of autophagy spot in Huh7 cells were less than that in H1299 cells.The results of western blotting also indicated that compared with H1299 cells,the ratio of LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ in Huh7 cells were lower distinctly.Whereas both of two methods couldn′t obtain quantitative data.The imaging flow cytometer not only displayed the autophagic cellular images,but also demonstrated that only 9.0% of Huh7 cells exhibited over 6 LC3 spots(high autophagic levels),markedly less than the same population of H1299 cells(26.2%).While GFP-LC3 plasmid transfection rates of the two kind of cells were similar(25.2% and 27.6%).Conclusion The novel imaging flow cytometer has the advantages of combination of quantitative data analysis and fluorescent imaging as well as could compensate the shortcomings of fluorescence microscopy and western blotting.It is more excellent to detect autophagy by imaging flow cytometer.

autophagy; imaging flow cytometer; microtubule associated protein light chain 3

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81361120401,81371399，81272266)；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(首發(fā)2014-1-1151)；腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(2015ZLQX05)；北京市肝病研究所科研課題(BJIH-01602)。

時(shí)景仁，女，主治醫(yī)師，主要從事肝病與自噬相關(guān)性方面的研究。

△通訊作者，E-mail：dexichen@ccmu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.001

A

1673-4130(2016)21-2949-04

2016-02-28

2016-05-05)