周雪梅 石麗莉 李鈺慧 李繼安 田春雨 張碧溦 王晨斌 代春燕 焦如春 王 成 喇孝瑾

華北理工大學中醫(yī)學院 河北唐山 063000;①唐山市婦幼保健院;②天津中醫(yī)藥大學

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五子降糖方對原代骨骼肌細胞胰島素抵抗模型的影響

周雪梅 石麗莉①李鈺慧②李繼安 田春雨 張碧溦 王晨斌 代春燕 焦如春 王 成 喇孝瑾

華北理工大學中醫(yī)學院 河北唐山 063000;①唐山市婦幼保健院;②天津中醫(yī)藥大學

①目的 觀察五子降糖方對骨骼肌細胞胰島素抵抗的影響，探討其改善胰島素抵抗作用的可能機制。②方法 對骨骼肌細胞應(yīng)用5×10-7mol/L胰島素干預12小時建立胰島素抵抗模型，應(yīng)用低、中、高劑量(25μg/mL，100μg/mL，400μg/mL)五子降糖方對造模成功的骨骼肌細胞進行干預，同時設(shè)正常組、模型組，藥物干預24小時后用葡萄糖氧化酶法測定骨骼肌細胞葡萄糖消耗量；③結(jié)果 五子降糖方各組與模型組比較葡萄糖消耗量高于模型組(P<0.01)，高劑量組與正常組比較，葡萄糖消耗量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，中劑量組與正常組比較，葡萄糖消耗量低于正常組(P<0.05)，低劑量組葡萄糖消耗量顯著低于正常組(P<0.01)；④結(jié)論 五子降糖方可以改善骨骼肌細胞胰島素抵抗模型的葡萄糖代謝。

五子降糖方 骨骼肌細胞 胰島素抵抗 葡萄糖代謝

糖尿病是一種由遺傳、環(huán)境等多種因素引發(fā)的慢性綜合性疾病，該病主要表現(xiàn)為胰島素相對缺乏或者絕對缺乏，也可能是周圍靶組織對胰島素敏感性降低，進而引發(fā)的以糖代謝紊亂為主，繼發(fā)脂肪、蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、水代謝紊亂綜合征。近年來，隨著生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率在世界范圍呈上升趨勢，尤其是在發(fā)展中國家，其增長速度更快，其中2型糖尿病患病率占患病總?cè)藬?shù)的90%以上。糖尿病嚴重危害人類健康，同時給社會醫(yī)療保障體系帶來沉重的負擔。前期實驗研究表明，五子降糖方可以降低2型糖尿病大鼠空腹血糖和餐后2小時血糖，增加肝臟糖原含量，其機制可能與提高骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT4)表達水平、抗氧化、抗炎及改善胰島β細胞功能，提高肝臟蛋白激酶B(AKT)及糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、絲氨酸位點磷酸化水平有關(guān)[1～3]。本實驗通過取原代骨骼肌細胞，高胰島素干預建立骨骼肌細胞胰島素抵抗模型，體外實驗觀察了五子降糖方對出現(xiàn)胰島素抵抗的骨骼肌細胞葡萄糖代謝影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選取3～5天SD新生乳鼠，授贈于華北理工大學醫(yī)學實驗動物中心。

1.1.2 藥物與試劑 五子降糖方由菟絲子、女貞子、紫蘇子、萊菔子、車前子組成，購于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco公司，批號：8115031)；無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco公司，批號：1042204)；胎牛血清(GEMINI公司，批號：A97D00E)；青/鏈霉素(HyClone公司，批號：J130054)；MTT試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號：C0009)；葡萄糖測定試劑盒，(中生北控生物科技股份有限公司，批號：143331)；胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：1406219)。

1.1.3 主要儀器 BS224S精密電子天平(德國SARTORIUS公司)；GZX-9240數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；M200PRO酶標儀(瑞士TECAN公司)；生物安全柜(美國Thermo Scientific公司 )；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取方法。五子降糖方按其組成藥物菟絲子：女貞子：紫蘇子：萊菔子：車前子(3:3:2:2:2)比例混合并粉碎成粗末，加8倍量水煎煮8小時，靜置12小時后12000r/min離心取上清。

1.2.2 原代細胞取材與培養(yǎng)、誘導分化[4]。取3～5天SD乳鼠骨骼肌于培養(yǎng)皿，剪其肌肉為0.13cm小塊，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗，剔除脂肪、結(jié)締組織、骨骼，撕碎肌肉。將碎肌肉移至新的培養(yǎng)皿，PBS洗3次，靜置后棄去上層液及漂浮組織。 向該培養(yǎng)皿中加入0.25%胰酶1mL、0.1%膠原酶IV 1mL，撕碎組織并反復吹打，顯微鏡下觀察有肌肉細胞脫離組織后加入生長培養(yǎng)液終止消化。200目過篩，800r/min離心5分鐘，棄上清夜，加入含10%胎牛血清(FBS)、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液6～8mL，移入培養(yǎng)瓶，在含5%CO2，37℃ 的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 原代骨骼肌細胞造模及藥物干預[5,6]。用差速貼壁法對原代骨骼肌細胞進行純化，將第3代骨骼肌細胞按照2×104接種到96孔板中進行培養(yǎng)，待細胞長至70%時改用2%FBS、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液誘導分化，分化出肌管后將96孔板中的培養(yǎng)液倒掉。用PBS清洗3次，每孔加入含2%FBS、1%青/鏈霉素的無酚紅DMEM的培養(yǎng)液180μL，加入胰島素20μL。設(shè)不同胰島素濃度組(5×10-5、5×10-6、5×10-7、5×10-8、5×10-9)mol/L，并設(shè)正?？?不加胰島素)。在干預12小時后測定骨骼肌細胞上清液的葡萄糖含量(按照試劑盒說明使用)，并采用MTT方法檢測細胞活力，確定胰島素造模濃度。骨骼肌細胞造模成功后用PBS清洗3次，加入含2%FBS、1%青/鏈霉素的無酚紅DMEM培養(yǎng)液180μL，五子降糖方加20μL。五子降糖方分為低、中、高劑量組(25、100、400μg/mL)，同時設(shè)正常組，模型組，干預24小時后測定葡萄糖消耗量。

2 結(jié)果

2.1 原代骨骼肌細胞照片 采用酶消化法提取細胞，24小時換液后見圖1，細胞已經(jīng)貼壁，形狀不規(guī)則，數(shù)量少。第三天細胞換液后見圖2，細胞數(shù)量有所增長，生長走形及形狀不規(guī)則。

圖1 培養(yǎng)骨骼肌細胞24小時圖片(×40)

圖2 培養(yǎng)骨骼肌細胞72小時圖片(×200)

表1 各組干預12小時后細胞上清葡萄糖含量及細胞活力比較

2.2 高胰島素誘導骨骼肌細胞胰島素抵抗模型 不同濃度胰島素作用于骨骼肌細胞12小時后測定細胞上清液葡萄糖含量。5×10-7mol/L、5×10-6mol/L、5×10-5mol/L濃度胰島素組與正常組比較存在顯著性差異(P<0.05)，其他組與正常組比較沒有差異。不同濃度胰島素作用于骨骼肌細胞12小時后檢測細胞活力，5×10-7mol/L胰島素組與正常組比較沒有差異，對細胞活力沒有影響，5×10-6mol/L，5×10-5mol/L濃度胰島素干預后骨骼肌細胞活力有所下降，最終確定骨骼肌細胞胰島素抵抗模型造模濃度為5×10-7mol/L，見表1。

2.3 五子降糖方對骨骼肌細胞胰島素抵抗模型葡萄糖代謝的影響 五子降糖方對造模成功的骨骼肌細胞進行干預后測定葡萄糖消耗量，五子降糖方各組與模型組比較，葡萄糖消耗量均高于模型組且存在顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；與正常組比較五子降糖方高劑量組葡萄糖消耗量無統(tǒng)計學差異，中劑量組葡萄糖消耗量低于正常組(P<0.05)，低劑量組葡萄糖消耗量顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 五子降糖方各組對骨骼肌細胞葡萄糖消耗量的影響

3 討論

2型糖尿病屬中醫(yī)消渴范疇，中醫(yī)學認為本病是一種虛實夾雜的復雜癥候，《靈樞五臟》云：“腎脆則善病消癉，易傷”。《外臺秘要·消渴消中門》強調(diào)：“消渴者，原其發(fā)動，此則腎虛所致，每發(fā)即小便至甜”，進一步說明腎虧是其患病的關(guān)鍵?！端貑枴ねㄔu虛實論》“消癉……肥貴人，則膏梁之疾也”?！端貑柶娌≌撈吩疲骸捌D，此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也……”則強調(diào)了過食肥甘厚味可致消癉；由此可見，先天不足，氣化不及與后天飲食肥甘太過是消渴病發(fā)病的主要因素。氣化功能下降為發(fā)病之根，脂濁痰濕堆積為病之因，五子降糖方中菟絲子溫補腎陽的同時平補腎陰，女貞子性涼，歸肝腎經(jīng)，具有滋補肝腎之陰的功效，二者合用，使腎之陰陽得補，腎氣得充，進而蒸騰、氣化推動和調(diào)節(jié)胃之“游溢精氣”、脾之“散精”、肺之“通調(diào)水道”，使津液輸布代謝正常，則痰濁無以內(nèi)生。紫蘇子降氣消痰，萊菔子消食導滯、下氣除痰，車前子瀉而通之，瀉有形之邪濁，澀中兼通，補而不滯。五藥配伍使腎虛得補、氣機得暢、痰濁得化。

骨骼肌是機體消耗葡萄糖的主要器官之一，胰島素主要作用于肌肉、脂肪、肝臟，三者協(xié)調(diào)作用，維持動態(tài)平衡，一旦一方遭到破壞就會引起臨床癥狀。胰島素抵抗是指生理狀態(tài)的胰島素無法維持血糖正常水平，即靶組織對胰島素敏感性降低，本實驗以骨骼肌細胞為研究對象，建立高胰島素誘導成胰島素抵抗模型，應(yīng)用五子降糖方對其干預，結(jié)果證明五子降糖方可以改善骨骼肌細胞胰島素抵抗模型葡萄糖代謝，實驗具有科學性及合理性。

本實驗選擇出生3～5天SD乳鼠作為實驗對象，實驗過程中發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞傳代次數(shù)有限，一般第6代之后活性開始減弱，之后逐漸失活。為保證本實驗的合理性應(yīng)用第2～3代原代細胞進行實驗研究，可順利進行實驗。對生長出肌管的骨骼肌細胞應(yīng)用不同濃度胰島素干預12小時，5×10-7mol/L，5×10-6mol/L，5×10-5mol/L濃度胰島素組與正常組比較存在顯著性差異(P<0.05)，其他組與正常組比較沒有差異。通過表1,最終確定了骨骼肌細胞胰島素抵抗模型胰島素濃度為5×10-7mol/L。確定胰島素造模濃度后可以對造模成功的骨骼肌細胞應(yīng)用五子降糖方進行干預，五子降糖方組葡萄糖消耗量較模型組顯著性高，五子降糖方高劑量組與正常組之間沒有差異(P>0.05)，實驗結(jié)果表明五子降糖方可以有效改善胰島素抵抗的骨骼肌細胞的葡萄糖代謝，且改善作用具有劑量依賴性。該方發(fā)揮改善葡萄糖代謝作用的機制需在今后的實驗中進一步研究。

[1] 王 亞,董玉山,喇孝瑾,等.五子降糖方對T2DM模型大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(16):193-196

[2] 王 亞,喇孝瑾,邱昌龍,等.五子降糖方對2型糖尿病模型大鼠肝組織糖原及AKT/GSK-3β信號通路的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2014,37(02):107-111

[3] 王 亞,高秀娟,賀寶玲,等.五子降糖方對T2DM大鼠血糖及血清SOD、MDA、hsCRP、C-P的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(7):2367-2369

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[6] 馬潔桃,張 嶺,來偉旗,等.芒果苷對L6細胞葡萄糖消耗的影響及其作用機制研究[J].中國預防醫(yī)學雜志,2012,13(09):662-666

(2016-02-20 收稿)(庫雪飛 編輯)

Influence of insulin resistance of skeletal muscle cells with Wuzijiangtang formula

ZHOUXuemei,SHILili,LIYuhui,etal

(CollegeofTraditionalChineseMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the influence of insulin resistance skeletal muscle cells with Wuzijiangtang formula,to explore its mechanism in improving insulin resistance.Method With 5×10-7mol/L insulin intervention for 12h to built insulin resistant model.Application of Wuzijiangtang formula of high,middle and low concentrations(400μg/mL,100μg/mL,25μg/mL)on skeletal muscle cells that to set up skeletal muscle normal group and model group.Detected glucose content of cell supernatant with glucose oxidase method.Results Compared with model group,the glucose metabolism levels of Wuzijiangtang groups were higher(P<0.01).Wuzijiangtang formula high dose group compared with normal group had no significant difference(P>0.05).Wuzijiangtang formula middle dose group compared with normal group,the glucose metabolism levels were lower than normal group(P<0.05).Wuzijiangtang formula low dose group compared with normal group,the glucose metabolism levels were lower than normal group(P<0.01).Conclusion Wuzijiangtang formula can improve glucose metabolism.

Wuzijiangtang formula.Skeletal muscle cell.Insulin resistance.Glucose metabolism

河北省國際合作項目(編號：14397705D)；華北理工大學大學生創(chuàng)新計劃。

周雪梅(1988-)，女，碩士研究生。研究方向：中醫(yī)糖脂代謝疾病。

喇孝瑾。

R 581.3

A

2095-2694(2016)05-389-04