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        丹參酚酸B通過(guò)Sirt-1對(duì)大鼠肝纖維化模型的影響

        2016-12-07 02:49:10
        關(guān)鍵詞:抗肝乙酰化酚酸

        吳 航

        菏澤醫(yī)學(xué)??茖W(xué)校藥理學(xué)教研室 山東菏澤 274000

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        丹參酚酸B通過(guò)Sirt-1對(duì)大鼠肝纖維化模型的影響

        吳 航

        菏澤醫(yī)學(xué)??茖W(xué)校藥理學(xué)教研室 山東菏澤 274000

        ①目的 研究丹參酚酸B(SalB)抗大鼠肝纖維化分子的作用機(jī)制。②方法 48只大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(A組),DMN損傷組(B組),SalB空白給藥組(C組),DMN損傷+SalB預(yù)處理組(D組)。B、D組大鼠腹腔注射DMN,每周3次,給藥4周;D組大鼠在第一次注射DMN同時(shí)灌胃給予SalB溶液;C組也同時(shí)給該藥,每天1次,連續(xù)給藥6周。最后一次灌胃結(jié)束后禁食24小時(shí),取肝臟標(biāo)本,測(cè)定肝勻漿羥脯氨酸(HYP)水平。明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2、MMP-9活性,Western Blot檢測(cè)AP-1和Sirt-1表達(dá)水平。③結(jié)果 B組大鼠肝臟HYP水平、MMP-2、MMP-9活性以及AP-1蛋白表達(dá)水平明顯上升;與B組相比,D組大鼠肝臟HYP水平、MMP-2、MMP-9活性以及AP-1蛋白表達(dá)水平明顯下降。另外,B組大鼠Sirt-1蛋白表達(dá)水平明顯下降,而D組Sirt-1蛋白表達(dá)水平水平明顯上升。④結(jié)論 SalB具有明顯的抗肝纖維化作用,其機(jī)制與SalB激活Sirt-1表達(dá)從而抑制MMP-2、MMP-9的活性密切相關(guān)。

        丹參酚酸B 肝纖維化 Sirt-1 MMP-2 MMP-9

        肝纖維化是一種以肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成與降解失衡為主要病因的疾病[1]。由于肝纖維化會(huì)進(jìn)展成肝硬化,并且目前在臨床治療尚無(wú)特效藥,因此研發(fā)具有抗肝纖維化作用的藥物意義重大。丹參酚酸B(SalB)作為丹參中一種水溶性活性成分,具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎、抗腫瘤等多方面的藥理作用[2]。雖然也有報(bào)道指出,SalB具有抗肝纖維化的藥理作用,但是其抗肝纖維化的作用機(jī)制尚未闡明。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶Ⅰ(Sirt-1)是一種存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中依賴NAD+的去乙?;?,目前已經(jīng)證實(shí)Sirt-1可以通過(guò)對(duì)特定轉(zhuǎn)錄因子(比如P53、Ku70、myoD等)的去乙?;{(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子的活性[3],但是在肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中,Sirt-1的作用尚未明確。因此,本文通過(guò)研究二甲基亞硝胺(DMN)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,旨在探討SalB通過(guò)Sirt-1抗肝纖維化的分子作用機(jī)制,為中藥治療肝纖維化提供重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動(dòng)物分組及造模方法。雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分為4組:每組各12只。對(duì)照組(A組),DMN損傷組(B組),SalB空白給藥組(C組),DMN損傷+SalB預(yù)處理組(D組)。B、D組大鼠腹腔注射DMN 8μg/kg,A、C組大鼠腹腔注射同容量生理鹽水,每周一、三、五各給藥1次,連續(xù)給藥4周。從第一次注射DMN開(kāi)始時(shí),C、D組大鼠灌胃SalB水溶液15mg/kg、0.1mL/10g,A、B組大鼠同時(shí)灌胃同容量生理鹽水,每天1次,給藥6周。最后一次灌胃結(jié)束后,禁食24小時(shí),處死動(dòng)物,在肝臟相同位置留取標(biāo)本用于生化指標(biāo)以及分子生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定。

        1.1.2 動(dòng)物與試劑。丹參酚酸B(純度95%)購(gòu)自Sigma公司,羥脯氨酸(HYP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所,兔抗鼠Sirt-1抗體、兔抗鼠AP-1抗體均購(gòu)自Abcam公司,山羊抗兔二抗購(gòu)自北京碧云天公司。

        1.2 方法

        1.2.1 生化指標(biāo)測(cè)定。肝組織勻漿后,按照羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織中羥脯氨酸的水平。

        1.2.2 明膠酶譜法測(cè)定MMP-2、MMP-9活性。動(dòng)物處死后在冰浴下立即提取新鮮肝臟蛋白,蛋白定量后在含有1%明膠的分離膠中電泳,洗脫、漂洗結(jié)束后,將凝膠置于孵育液中,37℃恒溫孵育48小時(shí),孵育結(jié)束后,經(jīng)過(guò)染色、漂洗,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照,進(jìn)行灰度分析。

        1.2.3 Western-Blot測(cè)定Sirt-1、AP-1的蛋白表達(dá)水平。從留取的肝臟標(biāo)本中提取蛋白,經(jīng)過(guò)定性、定量分析后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后使用脫脂奶粉封閉,一抗孵育過(guò)夜,二抗孵育2小時(shí),顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)所有計(jì)量資料采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 SalB對(duì)各組大鼠肝組織羥脯氨酸(HYP)含量的影響 HYP是衡量肝組織纖維化程度的一個(gè)重要指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與A組相比,B組大鼠肝臟HYP含量明顯上升(P<0.01),與B組相比,D組大鼠肝臟HYP含量明顯下降(P<0.05),與A組相比,C組大鼠肝臟HYP含量未發(fā)生明顯變化,見(jiàn)表1。

        表1 SalB對(duì)各組大鼠肝臟HYP含量的影響

        2.2 明膠酶譜法測(cè)定大鼠肝臟MMP-2、MMP-9的活性 A組大鼠肝臟中MMP-2、MMP-9活性較低,經(jīng)過(guò)DMN誘導(dǎo)后,肝臟中MMP-2、MMP-9活性明顯上升。而與B組相比,D組大鼠肝臟中MMP-2、MMP-9的活性明顯下降。與A組相比,C組大鼠肝臟MMP-2、MMP-9的活性無(wú)明顯變化,見(jiàn)圖1。

        2.3 Western Blot測(cè)定大鼠肝臟AP-1、Sirt-1蛋白表達(dá)水平 A組大鼠AP-1表達(dá)水平較低,經(jīng)過(guò)DMN的誘導(dǎo),B組大鼠AP-1表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),與B組相比,D組大鼠AP-1表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),見(jiàn)圖2。Sirt-1的表達(dá)則呈現(xiàn)出與AP-1相反的趨勢(shì),A組大鼠肝臟就有一定量的Sirt-1的表達(dá),而經(jīng)過(guò)DMN誘導(dǎo)后,與A組相比,B組大鼠肝臟Sirt-1的表達(dá)受到明顯抑制(P<0.01),與B組相比,D組大鼠肝臟Sirt-1水平明顯上升(P<0.05)。此外,與A組相比,C組大鼠Sirt-1水平明顯上升(P<0.05),見(jiàn)圖3。

        圖1 丹參酚酸B對(duì)MMP-2、MMP-9活性的影響

        圖2 丹參酚酸B對(duì)AP-1蛋白表達(dá)的影響

        圖3 丹參酚酸B對(duì)Sirt-1蛋白表達(dá)的影響

        3 討論

        肝纖維化是一種以ECM沉積和重構(gòu)為主要特征的進(jìn)行性疾病。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為肝纖維化是一種可逆的病變[4],但由于肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未明確,所以臨床上缺乏相應(yīng)的治療手段,因此在本研究中我們使用DMN誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肝纖維化,探討SalB抗肝纖維化的作用機(jī)制。

        HYP是一種在結(jié)締組織中特異性表達(dá)的氨基酸,在肝纖維化發(fā)生的過(guò)程中,由于ECM大量增生,HYP的水平也會(huì)隨之上升。因此,肝勻漿中的HYP水平可以反應(yīng)大鼠肝纖維化的程度[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)DMN誘導(dǎo)后,大鼠肝勻漿中HYP水平明顯上升,而在D組,大鼠肝勻漿中的HYP水平明顯下降,這證明DMN誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生了明顯的肝纖維化,而SalB則具有明顯的抑制肝纖維化的藥理作用。

        進(jìn)一步研究SalB抗肝纖維化的作用機(jī)制,我們將研究重點(diǎn)集中到了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)上。在肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程中,MMP起到了決定性的作用。不同類型的MMP在肝纖維化發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程中的作用并不完全相同[6]。目前的研究普遍認(rèn)為MMP-2和MMP-9可以降解正常的ECM,加速肝纖維化的進(jìn)展[7]。在本研究中,明膠酶譜法的結(jié)果顯示,B組大鼠肝臟中MMP-2、MMP-9的活性明顯上升,而經(jīng)過(guò)SalB治療后,與A組相比,D組大鼠肝臟MMP-2、MMP-9的水平明顯下降。以上結(jié)果證實(shí)了SalB抗肝纖維化的機(jī)制之一是抑制了MMP-2和MMP-9的表達(dá)。通過(guò)后續(xù)的研究,我們認(rèn)為SalB抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)與其上游的轉(zhuǎn)錄因子Sirt-1、AP-1密切相關(guān)。

        Sirt-1是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)依賴NAD+的去乙?;?,通過(guò)對(duì)多種轉(zhuǎn)錄因子的去乙酰化作用調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[8]。AP-1是MMP-2和MMP-9上游的轉(zhuǎn)錄因子,目前的研究認(rèn)為AP-1可以激活MMP-2和MMP-9的轉(zhuǎn)錄[9,10]。AP-1是由c-fos和c-jun相互結(jié)合而形成的異源二聚體,一旦c-jun與c-fos結(jié)合形成AP-1就會(huì)激活其下游基因的轉(zhuǎn)錄[11]。Sirt-1可以與c-jun結(jié)合,從而對(duì)c-jun去乙?;?,而去乙酰化的c-jun不能與c-fos結(jié)合形成AP-1[12,13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)DMN誘導(dǎo),大鼠AP-1的表達(dá)明顯升高,經(jīng)過(guò)SalB治療后,大鼠AP-1的水平明顯下降,這證明肝纖維化大鼠肝臟中MMP-2和MMP-9活性升高的一個(gè)重要原因是AP-1的高表達(dá)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,B組大鼠Sirt-1表達(dá)水平明顯降低,而在D組中,大鼠Sirt-1表達(dá)水平明顯提高,以上結(jié)果顯示Sirt-1的表達(dá)與AP-1的表達(dá)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān),從而證實(shí)了Sirt-1的高表達(dá)對(duì)AP-1具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。同時(shí),與A組相比,C組大鼠Sirt-1表達(dá)也有一定程度的提高,這證實(shí)了SalB具有激活Sirt-1表達(dá)的作用。

        綜上所述,我們認(rèn)為SalB具有明顯的抗肝纖維化的作用,這種作用的機(jī)制之一是由于SalB激活了Sirt-1的表達(dá),負(fù)性調(diào)節(jié)AP-1,從而抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)而產(chǎn)生的。

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        (庫(kù)雪飛 編輯)

        Effect of liver fibrosis model in rats by salvianolic acid B resistant sirt-1

        WUHang

        (HezeMedicalCollege,Heze274000,China)

        Objective To explore the molecule mechanism of anti-hepatic fibrosis by Salvianolic acid B(SalB).Methods A total of 48 SD rats were randomly divided into four groups:(A) control group,(B) DMN group,(C) SalB group,(D) DMN+SalB group.Rats in B and D group were intraperitoneally injected with dimethylnitrosamine(DMN) three times a week,for four weeks. Rats in C and D group were lavaged by SalB once daily,for six weeks.The last time to fill the stomach after fasting for 24 hours,take the liver specimens.Then detected the level of HYP,MMP-2,MMP-9,AP-1 and Sirt-1.Results The levels of HYP,MMP-2,MMP-9 and AP-1 were significantly higher in the B group.However compared with B group,the level of HYP,MMP-2,MMP-9,and AP-1 were significantly lower in D group.The level of Sirt-1 in D group was higher than B group.Conclusion SalB has obvious effect on anti liver fibrosis, the molecule mechanism is related to inhibit MMP-2 and MMP-9 by Sirt-1 activation.

        Salvianolic acid B.Hepatic fibrosis.Sirt-1.MMP-2.MMP-9

        吳 航(1987- ),男,碩士,助教。研究方向:分子藥理學(xué)。

        R 657.3

        A

        2095-2694(2016)05-349-04

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