任淑月，郝慶紅，郭云霞，*，湯群，張英杰，劉月琴

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071001）

添加劑

微貯玉米秸稈對羊瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

任淑月1，郝慶紅1，郭云霞1，2*，湯群1，張英杰2，劉月琴2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071001）

本研究旨在檢測飼喂微貯玉米秸稈（0%、25%、50%、75%、100%）對羊瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響。通過對樣品進行離心過濾處理，選用2-乙基丁酸（2-EB）作為內(nèi)標(biāo)物，采用氣-質(zhì)聯(lián)用法（Agilent HP-INNOWA色譜柱和FID檢測器）測定樣品中揮發(fā)性脂肪酸含量。結(jié)果表明，飼喂微貯玉米秸稈組總揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量增加，其中25%、50%、75%、100%飼喂組VFA分別比對照組增加了1.02%（P＞0.05）、4.28%（P＞0.05）、5.29%（P＜0.05）、0.16%（P＞0.05）。乙酸含量下降，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別下降了10.56（P＜0.05）、2.81%（P＞0.05）、7.83%（P＜0.05）、15.03%（P＜0.01）。除100%飼喂組外，丙酸含量上升，其中25%、50%、75%飼喂組分別提高了0.59%（P＞0.05）、2.01%（P＞0.05）、4.73%（P＞0.05）。結(jié)果表明，微貯玉米秸稈可以調(diào)節(jié)瘤胃的發(fā)酵功能。

氣-質(zhì)聯(lián)用；揮發(fā)性脂肪酸；瘤胃液；微貯玉米秸稈

微貯玉米秸稈以微生物的增殖為基礎(chǔ)，以降低秸稈中纖維素、木質(zhì)素的含量為目的，可提高微貯后秸稈的適口性，促進消化吸收。反芻動物飼料中的碳水化合物在瘤胃中被降解為脂肪酸。脂肪酸是脂質(zhì)的重要組成元件，在組織器官中表現(xiàn)一定的生物功能（李春燕等，2015）。脂肪酸中的部分碳鏈為1—6的有機酸，包括乙酸、丙酸、戊酸等，具有較強的揮發(fā)性，故稱之為揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。VFA在瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生，是厭氧消化過程的重要中間產(chǎn)物，它可提供反芻動物瘤胃消化吸收所需能量的75%左右（Bannink，2008；Van Houter，1996；Bergman，1990）。同時，VFA能為瘤胃微生物的生長與繁殖提供一個較為理想的酸性環(huán)境，利于瘤胃纖維素降解菌的增殖（經(jīng)語佳等，2014）。另外，VFA可以提高血漿胃動素水平，從而促進胃排空，刺激胃蛋白酶、胰液分泌，刺激膽囊收縮等胃運動，影響瘤胃上皮吸收運轉(zhuǎn)，增加動物采食量，促進生產(chǎn)性能的提高（楊春濤等，2015；Penner等，2009）。

本試驗通過采用氣-質(zhì)聯(lián)用法測定羊瘤胃液中的VFA含量，研究微貯玉米秸稈對瘤胃發(fā)酵功能的影響。

1　材料和方法

1.1試驗處理以枯草芽孢桿菌（N-8和N-10）、解淀粉芽孢桿菌、酵母菌復(fù)合菌劑，按每噸秸稈加入3%的硫酸銨和100 g菌粉的添加量進行玉米秸稈發(fā)酵，發(fā)酵后微貯秸稈與青貯秸稈營養(yǎng)成分見表1。以不同比例的（0%、25%、50%、75%、100%）微貯玉米秸稈替代青貯玉米秸稈。

表1　微貯秸稈與青貯秸稈的營養(yǎng)成分比較%

1.2樣品預(yù)處理取飼喂4 h后的羊瘤胃液，經(jīng)四層紗布過濾，7500 r/min高速離心5 min，取上清。將上清液過0.22微孔濾膜，濾液備測。

1.3試驗儀器及藥品氣相色譜儀（Agilent MSD-5975C）-質(zhì)譜儀（Agilent GC-7890A型），自動進樣器（Agilent 7683B Series）；色譜柱（Agilent HP-INNOWA：30 m×0.250 mm×0.25 μm）；檢測器：FID檢測器；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和2-乙基丁酸（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4色譜條件載氣N2（144.58LPa，總流量24 mL/min）；進樣口溫度250℃；MS四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；采用程序升溫：初始溫度100℃，時間3 min，以5℃/min的速率升溫至150℃，運行13 min，再以30℃/min的速率升溫至210℃；進樣量為1 μL。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測定準(zhǔn)確移取70 μL乙酸、20 μL丙酸、2.5 μL異丁酸、20 μL丁酸、4 μL戊酸、7.5 μL 2-乙基丁酸、1 μL異戊酸、5 μL己酸，至于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得245 mmol/L（14.68 g/L）的乙酸，53.62 mmol/L（3.97 g/L）丙酸，43.52 mmol/L（3.83 g/L）正丁酸，5.40 mmol/L（0.475 g/）異丁酸，7.37 mmol/L（0.752 g/L）戊酸，2.08 mmol/L（0.183 g/L）異戊酸，11.79 mmol/L（1.38 g/L）2-乙基丁酸，7.5 mmol/L（0.93 g/L）己酸儲備液。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋2、4、8、16的比例，制備成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用內(nèi)標(biāo)法測定羊瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸等VFA的濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1微貯秸稈的營養(yǎng)成分分析由表1可以看出，微貯秸稈與青貯秸稈比較，干物質(zhì)、粗灰分、粗脂肪含量差異不顯著（P＞0.05），而粗蛋白質(zhì)含量因添加了無機氮差異顯著（P＜0.05）。秸稈經(jīng)微貯處理后，粗蛋白質(zhì)含量提高了106.5%。NDF、ADF、CF的含量分別降低了58.60%（P＜0.05）、37.45%（P＜0.05）、20.8%（P＜0.05）。無機氮的殘留為0.0025%，99.9%的無機氮通過菌體的生長而轉(zhuǎn)化為有機氮。提高了秸稈的營養(yǎng)價值，降低了纖維素的含量。

2.2色譜分析條件選擇

2.2.1色譜柱根據(jù)相似相容原理，試驗中分離VFA時，對非極性柱和極性柱進行了比較，結(jié)果表明，與非極性柱相比，極性柱中的各組分分離效果好，峰型好。這和乙酸、丙酸、丁酸等VFA的極性較強是相符合的，故本試驗中選擇極性較強的聚乙二烯為固定相（Agilent HP-INNOWA）的毛細管柱。

2.2.2柱溫的選擇10個碳原子以下的脂肪酸大部分具有揮發(fā)性，但是它們的沸點是不同的，乙酸沸點為117.5℃，而己酸的沸點是205℃，故試驗中對柱溫條件進行了對比。在色譜分析中柱溫的選擇分為恒溫和程序升溫兩種方式。本試驗對兩種方式的分離效果進行了對比，試驗證明，程序升溫分析的分離效果是明顯優(yōu)于恒溫分析的。所以試驗采用程序升溫：初始溫度100℃，時間3 min，以5℃/min的速率升溫至150℃，運行10 min，再以30℃/min的速率升溫至210℃，實現(xiàn)對VFA的良好分離。

2.2.3載氣壓力出峰時間隨著載氣壓力的增加而縮短，壓力過大就會導(dǎo)致各組分分離不完全，壓力小則會延長分析時間，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)為即節(jié)省載氣消耗又能縮短各組分的出峰時間。經(jīng)試驗確定了載氣N2（144.58 LPa，總流量24 mL/min），進樣口溫度250℃；MS四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；可對VFA的組分進行快速分離。

2.3定性分析在程序升溫條件下，對VFA的混合標(biāo)樣和經(jīng)處理的羊瘤胃液上機進行了分析，混合標(biāo)樣結(jié)果如圖1所示。乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、2-乙基丁酸、異戊酸、己酸的保留時間分別為4.635、6.154、6.700、7.887、10.117、10.540、12.305 min，羊瘤胃液中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸、己酸的保留時間見圖2。分別為4.587、6.127、6.694、7.866、10.101、10.540、12.294 min。圖1、圖2相同組分的保留時間基本保持一致，不同組分之間相差較大，分離效果較好，說明在選擇的測定條件下可以取得良好的分析效果。

圖1　混合揮發(fā)性脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2　樣品色譜圖

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進樣，進行分析，將相應(yīng)的VFA標(biāo)品濃度X和各自的色譜峰面積Y作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。相應(yīng)的回歸方程見表1。結(jié)果表明，各組分濃度（X）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比（Y）具有良好的線性關(guān)系。

圖3　VFA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　VFA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.5回收率及精密度空白樣品中加入兩個不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、己酸、戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行測定，回收率和重復(fù)性結(jié)果見表2。

表2　回收率及精密度試驗

2.6羊瘤胃液中VFA檢測采用上述方法，對羊瘤胃液中VFA含量進行分析，其中VFA中的乙酸、丙酸、丁酸含量隨著飼喂量的增加而呈不同的變化趨勢（表3）。與對照組相比，飼喂微貯玉米秸稈組總VFA含量增加，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別增加了1.02%（P＞0.05）、4.28%（P＞0.05）、5.29%（P＜0.05）、0.16%（P＞0.05）。乙酸含量下降，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別下降了10.56（P＜0.05）、2.81%（P＞0.05）、7.83%（P＜0.05）、15.03%（P＜0.01）。除100%飼喂組外，丙酸含量上升，其中25%、50%、75%飼喂組分別上升了0.59%（P＞0.05）、2.01%（P＞0.05）、4.73%（P＞0.05）。丁酸的含量呈顯著上升，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別增加了59.69%（P＜0.01）、58.14%（P＜0.01）、56.49%（P＜0.01）、46.19%（P＜0.01）。異丁酸、戊酸均顯著上升，己酸含量呈下降趨勢。

3　討論

利用GC-MC對羊瘤胃液樣品過濾后直接上樣，回收率為94.50%～98.95%，精密度為0.44%～ 1.90%，提高了試驗結(jié)果的重現(xiàn)性，而且操作簡單，以內(nèi)標(biāo)法進行定量分析，能夠有效地消除載氣流動、柱溫變化等造成的誤差，大大提高了測定的精確度。

反芻動物日糧類型即粗飼料的飼喂比例與揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量相關(guān)。據(jù)報道，隨著日糧中粗飼料比例的降低，VFA合成量增加，其中乙酸含量下降，丙酸含量則隨之上升（Wanapat等2014；熊本海等，2002）。而乙酸大部分用于氧化供能，丙酸則被肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)轶w組織成分，用于生長、繁殖，另外丙酸產(chǎn)量與甲烷的產(chǎn)生量之間呈負相關(guān)，因此，丙酸含量上升可以減少生成甲烷的能量損失（Klieve等，2007）。丁酸經(jīng)瘤網(wǎng)胃壁吸收后大部分轉(zhuǎn)變成為的β-羥基丁酸是作為機體組織尤其是肌肉組織的能量來源，丁酸含量升高，表明微貯玉米秸稈能促進瘤胃內(nèi)微生物的生長，加快碳水化合物的降解，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。試驗測定結(jié)果顯示，飼喂不同比例的微貯玉米秸稈4 h后的瘤胃液中乙酸比例下降趨勢增大，丙酸濃度升高趨勢降低，從而導(dǎo)致乙酸/丙酸的比值降低，總揮發(fā)性脂肪酸的增加，促進了飼料的消化吸收利用率，這與華金玲等（2013）由不同精粗比（3∶7；4∶6；5∶5）日糧對瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸影響的研究結(jié)果一致。VFA含量的變化與瘤胃內(nèi)細菌的增殖相關(guān)，微貯玉米秸稈的飼喂可以調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵功能，促進瘤胃纖維素降解菌的生長，提高VFA的產(chǎn)量。

表3　玉米微貯秸稈對瘤胃液中VFA的影響mmol/L

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The test was conducted to determine influence of fermented corn straw on the sheep rumen volatile fatty acids.After filtered，centrifuged，selecting 2-ethyl butyrate（2-EB）as an internal stander，measuring the sample by GC-MS equipped with a Agilent HP-INNOWA capillary and a FID.The results showed the total volatile fatty concentration were improved by microbial fermentation of corn straw，the 25%，50%，75%，100%group was increased by 1.02%（P＞0.05），4.28%（P＞0.05），5.29%（P＜0.05），0.16%（P＞0.05），the acetic acid concentration were lower by 10.56（P＜0.05），2.81%（P＞0.05），7.83%（P＜0.05），15.03%（P＜0.01），expect for the 100%group，the propionic acid concentration of 25%，50%，75%group were increased by 0.59%（P＞0.05），2.01%（P＞0.05），4.73%（P＞0.05）.The results indicated that the capability of rumen were regulated by microbial fermentation of corn straw.

GC-MS；volatile fatty acids；rumen liquor；fermented corn straw with microbial

S816.6

A

1004-3314（2016）18-0032-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161809

國家肉羊現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-39）；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新訓(xùn)練項目（2015042）