任淑月，郝慶紅，郭云霞，*，湯群，張英杰，劉月琴

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071001）

添加劑

微貯玉米秸稈對(duì)羊瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

任淑月1，郝慶紅1，郭云霞1，2*，湯群1，張英杰2，劉月琴2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071001）

本研究旨在檢測(cè)飼喂微貯玉米秸稈（0%、25%、50%、75%、100%）對(duì)羊瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行離心過(guò)濾處理，選用2-乙基丁酸（2-EB）作為內(nèi)標(biāo)物，采用氣-質(zhì)聯(lián)用法（Agilent HP-INNOWA色譜柱和FID檢測(cè)器）測(cè)定樣品中揮發(fā)性脂肪酸含量。結(jié)果表明，飼喂微貯玉米秸稈組總揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量增加，其中25%、50%、75%、100%飼喂組VFA分別比對(duì)照組增加了1.02%（P＞0.05）、4.28%（P＞0.05）、5.29%（P＜0.05）、0.16%（P＞0.05）。乙酸含量下降，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別下降了10.56（P＜0.05）、2.81%（P＞0.05）、7.83%（P＜0.05）、15.03%（P＜0.01）。除100%飼喂組外，丙酸含量上升，其中25%、50%、75%飼喂組分別提高了0.59%（P＞0.05）、2.01%（P＞0.05）、4.73%（P＞0.05）。結(jié)果表明，微貯玉米秸稈可以調(diào)節(jié)瘤胃的發(fā)酵功能。

氣-質(zhì)聯(lián)用；揮發(fā)性脂肪酸；瘤胃液；微貯玉米秸稈

微貯玉米秸稈以微生物的增殖為基礎(chǔ)，以降低秸稈中纖維素、木質(zhì)素的含量為目的，可提高微貯后秸稈的適口性，促進(jìn)消化吸收。反芻動(dòng)物飼料中的碳水化合物在瘤胃中被降解為脂肪酸。脂肪酸是脂質(zhì)的重要組成元件，在組織器官中表現(xiàn)一定的生物功能（李春燕等，2015）。脂肪酸中的部分碳鏈為1—6的有機(jī)酸，包括乙酸、丙酸、戊酸等，具有較強(qiáng)的揮發(fā)性，故稱之為揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。VFA在瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生，是厭氧消化過(guò)程的重要中間產(chǎn)物，它可提供反芻動(dòng)物瘤胃消化吸收所需能量的75%左右（Bannink，2008；Van Houter，1996；Bergman，1990）。同時(shí)，VFA能為瘤胃微生物的生長(zhǎng)與繁殖提供一個(gè)較為理想的酸性環(huán)境，利于瘤胃纖維素降解菌的增殖（經(jīng)語(yǔ)佳等，2014）。另外，VFA可以提高血漿胃動(dòng)素水平，從而促進(jìn)胃排空，刺激胃蛋白酶、胰液分泌，刺激膽囊收縮等胃運(yùn)動(dòng)，影響瘤胃上皮吸收運(yùn)轉(zhuǎn)，增加動(dòng)物采食量，促進(jìn)生產(chǎn)性能的提高（楊春濤等，2015；Penner等，2009）。

本試驗(yàn)通過(guò)采用氣-質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定羊瘤胃液中的VFA含量，研究微貯玉米秸稈對(duì)瘤胃發(fā)酵功能的影響。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)處理以枯草芽孢桿菌（N-8和N-10）、解淀粉芽孢桿菌、酵母菌復(fù)合菌劑，按每噸秸稈加入3%的硫酸銨和100 g菌粉的添加量進(jìn)行玉米秸稈發(fā)酵，發(fā)酵后微貯秸稈與青貯秸稈營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。以不同比例的（0%、25%、50%、75%、100%）微貯玉米秸稈替代青貯玉米秸稈。

表1　微貯秸稈與青貯秸稈的營(yíng)養(yǎng)成分比較%

1.2樣品預(yù)處理取飼喂4 h后的羊瘤胃液，經(jīng)四層紗布過(guò)濾，7500 r/min高速離心5 min，取上清。將上清液過(guò)0.22微孔濾膜，濾液備測(cè)。

1.3試驗(yàn)儀器及藥品氣相色譜儀（Agilent MSD-5975C）-質(zhì)譜儀（Agilent GC-7890A型），自動(dòng)進(jìn)樣器（Agilent 7683B Series）；色譜柱（Agilent HP-INNOWA：30 m×0.250 mm×0.25 μm）；檢測(cè)器：FID檢測(cè)器；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和2-乙基丁酸（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4色譜條件載氣N2（144.58LPa，總流量24 mL/min）；進(jìn)樣口溫度250℃；MS四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；采用程序升溫：初始溫度100℃，時(shí)間3 min，以5℃/min的速率升溫至150℃，運(yùn)行13 min，再以30℃/min的速率升溫至210℃；進(jìn)樣量為1 μL。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測(cè)定準(zhǔn)確移取70 μL乙酸、20 μL丙酸、2.5 μL異丁酸、20 μL丁酸、4 μL戊酸、7.5 μL 2-乙基丁酸、1 μL異戊酸、5 μL己酸，至于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得245 mmol/L（14.68 g/L）的乙酸，53.62 mmol/L（3.97 g/L）丙酸，43.52 mmol/L（3.83 g/L）正丁酸，5.40 mmol/L（0.475 g/）異丁酸，7.37 mmol/L（0.752 g/L）戊酸，2.08 mmol/L（0.183 g/L）異戊酸，11.79 mmol/L（1.38 g/L）2-乙基丁酸，7.5 mmol/L（0.93 g/L）己酸儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋2、4、8、16的比例，制備成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定羊瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸等VFA的濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1微貯秸稈的營(yíng)養(yǎng)成分分析由表1可以看出，微貯秸稈與青貯秸稈比較，干物質(zhì)、粗灰分、粗脂肪含量差異不顯著（P＞0.05），而粗蛋白質(zhì)含量因添加了無(wú)機(jī)氮差異顯著（P＜0.05）。秸稈經(jīng)微貯處理后，粗蛋白質(zhì)含量提高了106.5%。NDF、ADF、CF的含量分別降低了58.60%（P＜0.05）、37.45%（P＜0.05）、20.8%（P＜0.05）。無(wú)機(jī)氮的殘留為0.0025%，99.9%的無(wú)機(jī)氮通過(guò)菌體的生長(zhǎng)而轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮。提高了秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降低了纖維素的含量。

2.2色譜分析條件選擇

2.2.1色譜柱根據(jù)相似相容原理，試驗(yàn)中分離VFA時(shí)，對(duì)非極性柱和極性柱進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，與非極性柱相比，極性柱中的各組分分離效果好，峰型好。這和乙酸、丙酸、丁酸等VFA的極性較強(qiáng)是相符合的，故本試驗(yàn)中選擇極性較強(qiáng)的聚乙二烯為固定相（Agilent HP-INNOWA）的毛細(xì)管柱。

2.2.2柱溫的選擇10個(gè)碳原子以下的脂肪酸大部分具有揮發(fā)性，但是它們的沸點(diǎn)是不同的，乙酸沸點(diǎn)為117.5℃，而己酸的沸點(diǎn)是205℃，故試驗(yàn)中對(duì)柱溫條件進(jìn)行了對(duì)比。在色譜分析中柱溫的選擇分為恒溫和程序升溫兩種方式。本試驗(yàn)對(duì)兩種方式的分離效果進(jìn)行了對(duì)比，試驗(yàn)證明，程序升溫分析的分離效果是明顯優(yōu)于恒溫分析的。所以試驗(yàn)采用程序升溫：初始溫度100℃，時(shí)間3 min，以5℃/min的速率升溫至150℃，運(yùn)行10 min，再以30℃/min的速率升溫至210℃，實(shí)現(xiàn)對(duì)VFA的良好分離。

2.2.3載氣壓力出峰時(shí)間隨著載氣壓力的增加而縮短，壓力過(guò)大就會(huì)導(dǎo)致各組分分離不完全，壓力小則會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)為即節(jié)省載氣消耗又能縮短各組分的出峰時(shí)間。經(jīng)試驗(yàn)確定了載氣N2（144.58 LPa，總流量24 mL/min），進(jìn)樣口溫度250℃；MS四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；可對(duì)VFA的組分進(jìn)行快速分離。

2.3定性分析在程序升溫條件下，對(duì)VFA的混合標(biāo)樣和經(jīng)處理的羊瘤胃液上機(jī)進(jìn)行了分析，混合標(biāo)樣結(jié)果如圖1所示。乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、2-乙基丁酸、異戊酸、己酸的保留時(shí)間分別為4.635、6.154、6.700、7.887、10.117、10.540、12.305 min，羊瘤胃液中乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、異戊酸、己酸的保留時(shí)間見(jiàn)圖2。分別為4.587、6.127、6.694、7.866、10.101、10.540、12.294 min。圖1、圖2相同組分的保留時(shí)間基本保持一致，不同組分之間相差較大，分離效果較好，說(shuō)明在選擇的測(cè)定條件下可以取得良好的分析效果。

圖1　混合揮發(fā)性脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2　樣品色譜圖

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)行分析，將相應(yīng)的VFA標(biāo)品濃度X和各自的色譜峰面積Y作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。相應(yīng)的回歸方程見(jiàn)表1。結(jié)果表明，各組分濃度（X）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比（Y）具有良好的線性關(guān)系。

圖3　VFA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　VFA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.5回收率及精密度空白樣品中加入兩個(gè)不同濃度的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、己酸、戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，回收率和重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　回收率及精密度試驗(yàn)

2.6羊瘤胃液中VFA檢測(cè)采用上述方法，對(duì)羊瘤胃液中VFA含量進(jìn)行分析，其中VFA中的乙酸、丙酸、丁酸含量隨著飼喂量的增加而呈不同的變化趨勢(shì)（表3）。與對(duì)照組相比，飼喂微貯玉米秸稈組總VFA含量增加，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別增加了1.02%（P＞0.05）、4.28%（P＞0.05）、5.29%（P＜0.05）、0.16%（P＞0.05）。乙酸含量下降，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別下降了10.56（P＜0.05）、2.81%（P＞0.05）、7.83%（P＜0.05）、15.03%（P＜0.01）。除100%飼喂組外，丙酸含量上升，其中25%、50%、75%飼喂組分別上升了0.59%（P＞0.05）、2.01%（P＞0.05）、4.73%（P＞0.05）。丁酸的含量呈顯著上升，其中25%、50%、75%、100%飼喂組分別增加了59.69%（P＜0.01）、58.14%（P＜0.01）、56.49%（P＜0.01）、46.19%（P＜0.01）。異丁酸、戊酸均顯著上升，己酸含量呈下降趨勢(shì)。

3　討論

利用GC-MC對(duì)羊瘤胃液樣品過(guò)濾后直接上樣，回收率為94.50%～98.95%，精密度為0.44%～ 1.90%，提高了試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，而且操作簡(jiǎn)單，以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，能夠有效地消除載氣流動(dòng)、柱溫變化等造成的誤差，大大提高了測(cè)定的精確度。

反芻動(dòng)物日糧類(lèi)型即粗飼料的飼喂比例與揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生量相關(guān)。據(jù)報(bào)道，隨著日糧中粗飼料比例的降低，VFA合成量增加，其中乙酸含量下降，丙酸含量則隨之上升（Wanapat等2014；熊本海等，2002）。而乙酸大部分用于氧化供能，丙酸則被肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)轶w組織成分，用于生長(zhǎng)、繁殖，另外丙酸產(chǎn)量與甲烷的產(chǎn)生量之間呈負(fù)相關(guān)，因此，丙酸含量上升可以減少生成甲烷的能量損失（Klieve等，2007）。丁酸經(jīng)瘤網(wǎng)胃壁吸收后大部分轉(zhuǎn)變成為的β-羥基丁酸是作為機(jī)體組織尤其是肌肉組織的能量來(lái)源，丁酸含量升高，表明微貯玉米秸稈能促進(jìn)瘤胃內(nèi)微生物的生長(zhǎng)，加快碳水化合物的降解，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示，飼喂不同比例的微貯玉米秸稈4 h后的瘤胃液中乙酸比例下降趨勢(shì)增大，丙酸濃度升高趨勢(shì)降低，從而導(dǎo)致乙酸/丙酸的比值降低，總揮發(fā)性脂肪酸的增加，促進(jìn)了飼料的消化吸收利用率，這與華金玲等（2013）由不同精粗比（3∶7；4∶6；5∶5）日糧對(duì)瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸影響的研究結(jié)果一致。VFA含量的變化與瘤胃內(nèi)細(xì)菌的增殖相關(guān)，微貯玉米秸稈的飼喂可以調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵功能，促進(jìn)瘤胃纖維素降解菌的生長(zhǎng)，提高VFA的產(chǎn)量。

表3　玉米微貯秸稈對(duì)瘤胃液中VFA的影響mmol/L

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The test was conducted to determine influence of fermented corn straw on the sheep rumen volatile fatty acids.After filtered，centrifuged，selecting 2-ethyl butyrate（2-EB）as an internal stander，measuring the sample by GC-MS equipped with a Agilent HP-INNOWA capillary and a FID.The results showed the total volatile fatty concentration were improved by microbial fermentation of corn straw，the 25%，50%，75%，100%group was increased by 1.02%（P＞0.05），4.28%（P＞0.05），5.29%（P＜0.05），0.16%（P＞0.05），the acetic acid concentration were lower by 10.56（P＜0.05），2.81%（P＞0.05），7.83%（P＜0.05），15.03%（P＜0.01），expect for the 100%group，the propionic acid concentration of 25%，50%，75%group were increased by 0.59%（P＞0.05），2.01%（P＞0.05），4.73%（P＞0.05）.The results indicated that the capability of rumen were regulated by microbial fermentation of corn straw.

GC-MS；volatile fatty acids；rumen liquor；fermented corn straw with microbial

S816.6

A

1004-3314（2016）18-0032-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161809

國(guó)家肉羊現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（CARS-39）；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（2015042）