王宏磊，趙永捷，王　玉，高　浩，唐　濤，張明慶，呂宏程

Delta樣配體4和基質(zhì)金屬蛋白酶2、白細(xì)胞分化抗原34在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平及相關(guān)性

王宏磊1，趙永捷1，王玉1，高浩2，唐濤3，張明慶2，呂宏程3

目的：探討Delta樣配體4（DLL4）和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、白細(xì)胞分化抗原34(CD34)在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其之間的相關(guān)性。方法：應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)90例臨床確診為結(jié)直腸癌組織中DLL4及MMP-2、CD34的表達(dá)情況并分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果：通過免疫組化可以發(fā)現(xiàn)，DLL4（均值為4.91）和MMP-2（均值為5.34）、CD34（均值為5.40）在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織、正常組織中的表達(dá)均明顯增高；DLL4和MMP-2、CD34在癌旁組織中的表達(dá)水平較正常組織中也明顯增高。DLL4表達(dá)水平與病理分期T、N分期相關(guān)，呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.226、0.262），但與MMP-2、CD34的表達(dá)水平并無相關(guān)性。結(jié)論：在結(jié)直腸癌組織中，DLL4的表達(dá)水平明顯增高，與腫瘤侵潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。

Delta樣配體4；基質(zhì)金屬蛋白酶2；白細(xì)胞分化抗原34；結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，近年來我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率迅速增長(zhǎng)且發(fā)病年齡明顯提前，中位發(fā)病年齡為58歲，比西方國(guó)家要早12～18年。對(duì)于結(jié)直腸癌，傳統(tǒng)治療以外科手術(shù)為主、放化療輔助。但很多患者在就診時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，且部分患者對(duì)于現(xiàn)有化療藥物敏感性差，這就迫使我們進(jìn)一步尋找新的藥物作用靶點(diǎn)。

在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腫瘤分子信號(hào)通路中，Notch信號(hào)通路可與促使腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的其他關(guān)鍵性通路相互作用，調(diào)節(jié)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖與進(jìn)展。Notch途徑的受體Notch1在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)是其獨(dú)立的預(yù)后影響因素[1]。Notch配體Delta樣配體4（delta like ligand-4,DLL4）是5個(gè)配體中唯一特異性存在于內(nèi)皮細(xì)胞的配體，在正常機(jī)體及腫瘤血管形成的過程中發(fā)揮著重要功能，而且在這個(gè)過程中，有許多分子參與其中，如基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloid proteinase-2,MMP2)、及白細(xì)胞分化抗原34(cluster of differentiation 34,CD34)[2]。

本文研究中選擇的DLL4[3-4]、MMP2、CD34等都是與腫瘤新生血管密切相關(guān)的分子[5-6]，對(duì)尋找新的抗癌藥物靶點(diǎn)和提示病情有重要的指導(dǎo)意義。但在結(jié)直腸癌組織中的DLL4、MMP-2、CD34表達(dá)水平及其之間相關(guān)性的研究目前鮮有報(bào)道，本文將就此進(jìn)行研究，并探討其之間的表達(dá)相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1結(jié)直腸癌標(biāo)本組織芯片制備收集90例天津市人民醫(yī)院2010年1—2010年9月經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的結(jié)直腸癌組織蠟塊，其中男性47例，女性43例；平均年齡68歲（24～90歲）。所有患者均未進(jìn)行新輔助治療。所有患者接受R0切除手術(shù)，檢獲淋巴結(jié)數(shù)目均大于15枚。根據(jù)HE切片對(duì)石蠟標(biāo)本中有代表性的點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，包括典型的腫瘤和鄰近的正常組織。制備受體蠟塊，在組織芯片制作機(jī)上用細(xì)針對(duì)受體蠟塊打孔，同樣在供體蠟塊上標(biāo)記的相應(yīng)部位打孔采集組織芯。將組織芯轉(zhuǎn)移到受體模塊的孔中。將構(gòu)建好的TMA芯片蠟塊放在相宜的塑料盒子內(nèi)，并嚴(yán)密固定防止移位。放入55℃溫箱中約10 min，在蠟將要完全溶解前，取出室溫下冷卻，使受體模塊的蠟與新插入的小圓柱狀組織溶為一體，取下蠟塊，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。切片、烤片?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2DLL4及MMP-2、CD34免疫組化染色將組織芯片進(jìn)行逐步脫蠟和水化，并進(jìn)行抗原修復(fù)：電爐加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10～15 min。采用免疫組化染色SP法：滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體；滴加Ι抗50 μL，室溫靜置1 h或4℃過夜或37℃1 h；PBS洗3次每次2 min；滴加Ⅱ抗45-50 μL，室溫靜置或37℃1 h；PBS洗3次各5 min；DAB顯色5～10 min；PBS或自來水沖洗10 min；蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3病理閱片及免疫組化結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師在不知臨床病理學(xué)資料的情況下對(duì)免疫組化的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。在高倍鏡(×200)下，隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)分。0.0%～5.0%記0分，5.1%～ 25.0%記1分，25.1%～50.0%記2分，50.1%～75.0%記3分，＞75.0%記4分。染色強(qiáng)度按多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特征計(jì)分。未著色記0分，染色呈淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。最后根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度計(jì)分之和進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用LSD-T檢驗(yàn)，兩者相關(guān)性用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義的界值。

2　結(jié)果

2.1DLL4及MMP-2、CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)情況DLL4在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織、正常組織均明顯增高(P＜0.05)，DLL4在癌旁組織中的表達(dá)水平較正常組織也明顯增高(P＜0.05)；MMP-2在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織、正常組織中的表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)，MMP-2在癌旁組織中的表達(dá)水平較正常組織也明顯增高(P＜0.05)；CD34在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織、正常組織中的表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)，CD34在癌旁組織中的表達(dá)水平較正常組織也明顯增高(P＜0.05)（如表1）。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　DLL4、MMP-2、CD34在腫瘤組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)情況（得分，±s）

表1　DLL4、MMP-2、CD34在腫瘤組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)情況（得分，±s）

DLL4 MMP-2 CD34癌組織4.91±1.36 5.34±0.96 5.40±0.93癌旁組織4.43±1.03 4.67±1.12 4.46±1.00正常組織3.14±0.91 3.09±0.75 3.41±1.01

2.2DLL4與MMP-2、CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)相關(guān)性DLL4與MMP-2在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)無相關(guān)性；DLL4與CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)無相關(guān)性；MMP-2與CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)無相關(guān)性，見表2。

2.3DLL4、MMP-2、CD34在癌組織中的表達(dá)水平與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性DLL-4表達(dá)與病理分期T分期、N分期相關(guān)，呈正相關(guān)，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表達(dá)水平越高。與其余臨床、病理參數(shù)并不相關(guān)。見表3。

3　討論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人們的健康生活，很多患者就診時(shí)已喪失手術(shù)機(jī)會(huì)?；熾m可有效控制腫瘤的發(fā)展，但有部分患者對(duì)于現(xiàn)有化療藥物敏感性差，這就迫使我們進(jìn)一步尋找新的藥物作用靶點(diǎn)。

表2　DLL4、MMP-2、CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)相關(guān)性

表3　DLL4、MMP-2、CD34的表達(dá)水平與臨床、病理參數(shù)之間的相關(guān)性

Notch信號(hào)同路是目前我們發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌信號(hào)傳導(dǎo)同路中的一個(gè)重要通路，該通路在內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育分化、干細(xì)胞分化、血管形成及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。Notch途徑的受體Notch1在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)是其獨(dú)立的預(yù)后影響因素[1]。Notch配體DLL4是5個(gè)配體中唯一特異性存在于內(nèi)皮細(xì)胞的配體，目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)DLL4的表達(dá)與腫瘤血管生成密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，不同研究者通過改變DLL4的狀態(tài)觀察其對(duì)血管生成及腫瘤生長(zhǎng)的作用，Noguera-Troise等[7]將DLL4的表達(dá)的腫瘤細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，腫瘤血管內(nèi)皮增生、血管密度增加。Ridgway等[8]研究也顯示抑制DLL4的表達(dá)可減少人類纖維肉瘤細(xì)胞系或白血病細(xì)胞系的小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。Stewart等[9]還發(fā)現(xiàn)，阻斷DLL4的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血管周細(xì)胞/血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量減少、血管開放、管腔減少及血管功能下降，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。而腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，包括毛細(xì)血管基底膜降解、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、形成管狀結(jié)構(gòu)、基底膜形成、血流貫通等步驟[10]。這一過程既受機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌因素等影響，又受腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的生長(zhǎng)因子調(diào)控。DLL4對(duì)于腫瘤血管生成的調(diào)控可能與其他因素互相影響，共同作用。一項(xiàng)針對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯示，Notch途徑參與了VEGF介導(dǎo)的MMPs的激活，且MMPs抑制劑能夠阻斷Notch活化導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)變化[11]。目前研究已證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在腫瘤的血管生成中發(fā)揮重要的作用。其中MMP-2是參與血管形成的主要成員。此外，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，MMP-2是MMPs中破壞基質(zhì)降解平衡，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的主要因子[12]。在腫瘤血管生成及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過程中，可能同樣存在Notch途徑與MMPs表達(dá)之間的互相影響，共同參與腫瘤血管生成及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。而且已有研究[13-15]表明DLL4的表達(dá)情況與乳腺癌、膽管癌、胰腺癌的預(yù)后都有密切關(guān)系，且在乳腺癌中DLL4的表達(dá)與MMP2相關(guān)[16-17]。但是，結(jié)直腸癌腫瘤組織中的DLL4、MMP-2、CD34表達(dá)水平及其之間相關(guān)性的研究目前鮮有報(bào)道。

本文研究發(fā)現(xiàn)DLL4和MMP-2、CD34在癌組織中的表達(dá)水平均較癌旁組織、正常組織中明顯增高，且癌旁組織中的表達(dá)也較正常組織明顯增高。但DLL4與MMP-2、DLL4與CD34、MMP-2與CD34在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)并無明顯相關(guān)性。DLL4是VEGF信號(hào)通路的下游信號(hào)分子，也是腫瘤血管新生的條件，而MMP-2是腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)必須的酶，同時(shí)CD34是血管內(nèi)皮的標(biāo)記物，理論上三者應(yīng)該有密切的關(guān)聯(lián)性。但我們研究中發(fā)現(xiàn)三者之間并無明顯相關(guān)性。這可能是由于腫瘤生長(zhǎng)是VEGF-Notch/DLL4信號(hào)通路和其他促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的因素共同作用的結(jié)果，有其他因素干預(yù)或者調(diào)節(jié)這條信號(hào)同路。

我們同時(shí)對(duì)DLL4、MMP-2、CD34的在結(jié)直腸癌組織表達(dá)水平與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)DLL4的表達(dá)DLL-4表達(dá)與病理分期T分期、N分期相關(guān)，呈正相關(guān)，即病理分期T分期、N分期越高，DLL-4表達(dá)水平越高。這提示我們DLL4在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平可能與腫瘤侵潤(rùn)程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生影響，但仍需進(jìn)一步的隨訪調(diào)查來探究。

綜上，DLL4、MMP-2、CD34在癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織、正常組織中均明顯增高，且DLL4的表達(dá)水平與病理分期T分期、N分期呈正相關(guān)。但是，DLL4與MMP-2、CD34的表達(dá)水平與臨床預(yù)后之間的關(guān)系目前仍不清楚，仍需進(jìn)一步的隨訪調(diào)查來探究。這也是我們下一步的研究方向。

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（收稿：2016-02-06修回：2016-04-26）

（責(zé)任編輯李 勇屈振亮）

The Expression of Delta Like Ligand-4,Matrix Metalloid Proteinase-2 and Cluster of Differentiation 34 in Colorectal Cancer Tissues and its Correlation with clinicopathologic Feature

WANG Hong-lei, ZHAO Yong-jie,WANG Yu,et al.Department of General Surgery,Tianjin Union Medical Center,Tianjin (300121)，China

ObjectiveTo investigate the expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in colorectal cancer tissues and its correction with clinicopathologic feature.MethodsImmunohistochemical methods were used to detect the expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in 90 cases of clinically diagnosed colorectal cancer tissues and investigate their correlation with clinicopathologic feature.ResultsThe expression level of DLL4 (average 4.91),MMP-2(average 5.34)and CD34(average 5.40)in tumor tissues were significantly higher than in adjacent tissues and normal tissues.Expression level of DLL4,MMP-2 and CD34 in adjacent tissues was sig?nificantly higher than those in normal tissues.The expression level of DLL4 was positively corrected with patho?logical stage of T and N.(correlation index 0.226,0.262),but it was not related with the expression level of MMP-2 and CD34.ConclusionIn colorectal cancer tissues,the expression level of DLL4 was significantly increased and correlated with extent of tumor invasion and lymph node metastasis.

Delta like ligand-4；matrix metalloid proteinase-2；cluster of differentiation 34；colorectal can?cers

R735.3+5

A

1007-6948(2016)03-0211-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.001

天津市衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目(2012KR13)

天津市人民醫(yī)院1.普外科;2.肛腸外科;3.病理科（天津 300121）

趙永捷，E-mail:zhaoyongjie@umc.net.cn