安徽省靈璧一中　吳　浩

基因表達載體相關問題解讀

安徽省靈璧一中吳浩

基因工程操作的核心是構建基因表達載體，圍繞表達載體的考題有逐年增多的趨勢。下面從不同的角度對表達載體進行解讀。

一、基因表達載體的一般結構及各部分的功能

如上圖，基因表達載體一般由目的基因（插入基因）、啟動子、終止子、標記基因（抗生素抗性基因）等結構組成。

啟動子是復制原點附近的一段有特殊結構的DNA，位于基因的首端。啟動子和特定的物質（如激素）作用后，通過一系列復雜的正反饋機制，激活復制原點（復制原點通常與某些酶結合）。

終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結構的DNA。終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄或復制在所需要的地方停止下來。

復制原點處的A和T特別多，氫鍵相對較少，不穩(wěn)定，DNA容易解旋，因此易與引物結合，成為轉錄的起點或復制的起點。

抗生素抗性基因作為標記基因，其作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。標記基因又稱報告基因，抗生素抗性基因是其中的一種。

二、基因表達載體中啟動子、終止子的來源及特點

（1）如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子，因為目的基因中已含有啟動子、終止子。（2）如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。若只將基因的編碼序列導入受體細胞，目的基因沒有啟動子、終止子，是無法轉錄或復制的，因此，在構建基因表達載體時，在與質粒結合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。（3）特異性啟動子。組織特異性啟動子又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調節(jié)的特性。如用乳房生物反應器生產藥用蛋白，使用的便是該類基因。

三、標記基因是否為質粒結構

作為運載體必須具備以下幾個特點：能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存；具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選。質粒是基因工程最常用的運載體，它存在于許多細菌等生物體中，是能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子。根據(jù)此分析可知，標記基因是質粒上固有的。但在實踐中，由于構建載體的目的不同，需要的標記基因也會不同，有的標記基因是需要另外加上的，如將綠色熒光蛋白基因與目的基因做成融合基因，根據(jù)熒光蛋白的特性來確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位。

四、載體上標記基因的標記原理

載體上的標記基因一般是一些抗生素抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，原理如上圖所示。