王 磊， 陳夢(mèng)云， 李 曉， 陸 峰， 許激揚(yáng)

(1. 中國藥科大學(xué) 生化教研室，江蘇 南京 210009；2. 第二軍醫(yī)大學(xué) 藥分教研室，上海 200433)

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TLC-SERS法快速分析抗精神失常類中藥的化藥成分

王 磊1， 陳夢(mèng)云2， 李 曉2， 陸 峰2， 許激揚(yáng)1

(1. 中國藥科大學(xué) 生化教研室，江蘇 南京 210009；2. 第二軍醫(yī)大學(xué) 藥分教研室，上海 200433)

建立了一種薄層色譜(TLC)結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)用于快速檢測(cè)抗精神失常類中藥中非法摻雜化學(xué)成分的方法。通過優(yōu)化銀溶膠、動(dòng)態(tài)-表面增強(qiáng)拉曼光譜(D-SERS)檢測(cè)方法及激光強(qiáng)度等因素后，利用TLC對(duì)中藥基質(zhì)和摻偽4種化藥成分，即奮乃靜、卡馬西平、利培酮、舒必利進(jìn)行初步分離，以三氯甲烷∶甲醇∶水(8∶2∶0.2)為展開劑，于254 nm紫外燈下檢視定位，進(jìn)而使用SERS技術(shù)對(duì)分離的微量物質(zhì)進(jìn)行鑒別。結(jié)果表明，該方法具有專屬性、靈敏度好等特點(diǎn)，且檢測(cè)限可低至0.02 mg/mL；與HPLC法相比，該方法簡(jiǎn)單快速，無需樣品前處理，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

表面增強(qiáng)拉曼光譜； 薄層色譜； 中藥； 非法添加

0 引 言

近年來，中藥制劑及中藥材摻假的現(xiàn)象屢有發(fā)生，不法商販為了牟取暴利，向其中非法添加功效相近的化藥成分[1]。由于非法添加物的不確定性，患者長(zhǎng)期服用這種含有化藥成分的中藥，極易導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。例如向清熱類中藥中摻雜化藥成分可能會(huì)導(dǎo)致皮疹、皮炎、哮喘，甚至黏膜脫落等不良癥狀；而向抗精神失常類藥物中非法添加化藥成分，更容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)眩暈、嘔吐、言語障礙的癥狀，甚至引起智力和性格的改變。目前，對(duì)于中藥摻雜化藥成分的主要檢測(cè)方法包括：高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)[2]、高效液相法(HPLC)[3]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[4]等，然而這些方法雖然準(zhǔn)確性好、靈敏度高，但分析周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高，大多局限于實(shí)驗(yàn)室使用，不能很好適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，甚至快檢分析。然而，薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼聯(lián)用技術(shù)(TLC-SERS)作為近十幾年來發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，可以有效地克服此類問題。TLC法可以用于復(fù)雜樣品的分離，具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)；此外，SERS能夠提供精細(xì)的樣品分子振動(dòng)指紋圖譜，更可以使拉曼散射信號(hào)增強(qiáng)104～106倍[5]，具有靈敏度高、專屬性好的優(yōu)點(diǎn)。由此可見，TLC與SERS聯(lián)用，能夠有效地將兩者優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，對(duì)中藥復(fù)雜體系進(jìn)行簡(jiǎn)單的分離，進(jìn)而利用SERS法實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的定性鑒別，達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)高效檢測(cè)的目的[6]。目前TLC-SERS聯(lián)用分析技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于各種領(lǐng)域，如生物血液中嗎啡[7]、水中污染物[8-9]、中成藥中摻雜西藥成分[10]等方面的研究。

本研究建立了基于TLC-SERS聯(lián)用技術(shù)快速檢測(cè)抗精神失常類中藥中非法添加奮乃靜、卡馬西平、利培酮、舒必利4種化藥成分的方法，并對(duì)使用的薄層展開條件、銀溶膠等因素進(jìn)行了優(yōu)化，為快速檢測(cè)抗精神失常類藥物中非法添加化藥成分提供了一種新方案，同時(shí)為藥品監(jiān)管部門檢測(cè)中藥真?zhèn)翁峁┝擞辛ΡＵ稀?/p>

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

便攜式拉曼光譜儀(BWS415)，激發(fā)功率300 mW，分辨率3 cm-1，激發(fā)波長(zhǎng)785 nm；掃描電子顯微鏡(SEM)(Zeiss EVO MA-10 Carl-Zeiss, Germany)；WFH-203B型三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；普析通用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)； KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；離心機(jī)(TG16-WS，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司)。

對(duì)照品舒必利(批號(hào)：100203-200503)、利培酮(批號(hào)：00570-201102)、奮乃靜(批號(hào)：100133-200602)、卡馬西平(批號(hào)：100142-201105)均購自中國食品藥品檢定研究院；硝酸銀、三水合檸檬酸三鈉、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有、限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；薄層板HSGF254(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司)；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中抗精神失常中成藥樣品均由山東省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 銀溶膠的制備。

DMF銀溶膠的制備：將10 mL的PVP-硝酸銀溶液(PVP 9 mg、硝酸銀0.02 mol/L)加入到100 mL沸騰的DMF中，繼續(xù)加熱一段時(shí)間，當(dāng)溶液由無色最終變?yōu)辄S棕色停止加熱，取出冷卻，制得DMF銀溶膠，備用。

乙二醇還原法制備銀溶膠：精密稱定PVP(Mw=55 000)2.5 g、硝酸銀0.5 g溶于200 mL乙二醇中，機(jī)械攪拌下加熱至130 °C并維持1 h，待溶液變?yōu)辄S綠色粘稠狀時(shí)停止反應(yīng)，冷卻至室溫。將反應(yīng)得到的銀溶膠用800 mL丙酮離心洗滌后重新分散于200 mL去離子水中，制得乙二醇還原法銀溶膠，備用。

(2) 樣品溶液的配制。稱取適量舒必利、利培酮、奮乃靜、卡馬西平對(duì)照品，加入甲醇溶解，分別配成1 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

取某抗精神失常類中成藥樣品適量，研細(xì)，精密稱取舒必利、利培酮、奮乃靜、卡馬西平適量加入其中，使各成分的添加量均為1%(質(zhì)量百分比)，加入甲醇溶解，超聲20 min，10 000 r/min離心20 min，取上清液作為模擬陽性樣品溶液，備用。

取真實(shí)樣品適量，研細(xì)，加入1 mL甲醇溶解，超聲20 min，10 000 r/min離心20 min，取上清液作為真實(shí)樣品溶液，備用。

(3) 對(duì)照品原位SERS采集。分別取舒必利、利培酮、奮乃靜、卡馬西平對(duì)照品適量，在積分時(shí)間15 s、激光強(qiáng)度80%且點(diǎn)膠量5 μL的條件下使用便攜式拉曼儀進(jìn)行檢測(cè)，每種樣品采集20條光譜，將20條光譜的平均光譜作為每個(gè)樣品的最終光譜，即可得到4種對(duì)照品的原位SERS圖譜。

(4) TLC-SERS檢測(cè)方法。分別吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液、模擬陽性對(duì)照品溶液各1 μL，點(diǎn)于同一硅膠板上，展開劑條件為三氯甲烷∶甲醇∶水(8∶2∶0.2)，展開后晾干，置于254 nm紫外下檢視定位。于對(duì)照品色譜條帶的斑點(diǎn)處和模擬陽性對(duì)照品中相同Rf值處分別滴加5 μL銀溶膠，滴加銀溶膠的位置進(jìn)行檢測(cè)，激光強(qiáng)度160 mW，積分時(shí)間15 s，每種樣品采集20條光譜，將20條光譜的平均光譜作為每個(gè)樣品的最終光譜，即可得到對(duì)應(yīng)的SERS圖譜。取5 μL的銀溶膠滴于空白硅膠板上，以相同的條件進(jìn)行檢測(cè)，類似地，獲得銀溶膠的空白對(duì)照?qǐng)D譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中對(duì)展開劑進(jìn)行了考察與優(yōu)化，主要考察了乙酸乙酯∶乙醇∶水(7∶3.0∶0.2)和三氯甲烷∶甲醇∶水(8∶2.0∶0.2)兩種展開劑的展開效果。以乙酸乙酯∶乙醇∶水(7∶3.0∶0.2)為展開劑體系時(shí)，分離效果并不理想，各物質(zhì)的比移值接近，出現(xiàn)斑點(diǎn)重疊，甚至拖尾現(xiàn)象。而采用三氯甲烷∶甲醇∶水(8.0∶2.0∶0.2)作為展開劑體系時(shí)，4種物質(zhì)的分離效果較好且無拖尾現(xiàn)象，舒必利、奮乃靜、利培酮、卡馬西平的Rf值分別為0.37、0.72、0.81、0.90，如圖1所示。因此最終采用三氯甲烷∶甲醇∶水(8.0∶2.0∶0.2)作為展開劑。

1-陰性對(duì)照品，2-模擬陽性樣品，3-舒必利，4-奮乃靜，5-利培酮，6-卡馬西平

圖1 模擬陽性樣品和4種對(duì)照品的薄層色譜圖

2.2 銀溶膠的考察與選擇

本實(shí)驗(yàn)以不同的方法制備了兩種納米銀溶膠[11-12]，并對(duì)兩種銀溶膠的SERS增強(qiáng)效果進(jìn)行了對(duì)比考察，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，以乙二醇作為還原劑制備的銀溶膠對(duì)4種對(duì)照品的增強(qiáng)效果均低于以DMF為還原劑和溶劑制備的銀溶膠，實(shí)驗(yàn)中對(duì)乙二醇還原制備的銀溶膠進(jìn)行了濃縮處理，并使用硝酸鉀、氯化鉀等作為凝聚劑，均未能取得理想的增強(qiáng)效果。SERS增強(qiáng)效果的強(qiáng)弱取決于SERS‘熱點(diǎn)’的形成及待測(cè)物分子與‘熱點(diǎn)’的距離，當(dāng)待測(cè)物分子無法有效接近‘熱點(diǎn)’區(qū)域時(shí)，SERS增強(qiáng)效果就會(huì)降低。本實(shí)驗(yàn)中乙二醇還原制得的納米銀溶膠分散于水中，而4種對(duì)照品均不溶于水，所以不能有效地接近納米銀粒子之間形成的SERS‘熱點(diǎn)’，可能導(dǎo)致乙二醇還原制備的銀溶膠增強(qiáng)效果較差。以DMF為還原劑和溶劑可以制備有機(jī)相納米銀溶膠，4種疏水性的對(duì)照品均能有效地接近有機(jī)相銀溶膠形成的‘熱點(diǎn)’，故可以得到較好的SERS增強(qiáng)效果。因此，最終選擇以DMF作為還原劑和溶劑制備的有機(jī)相納米銀溶膠。

(a)奮乃靜(b)舒必利(c)利培酮(d)卡馬西平

a-DMF為還原劑，b-乙二醇為還原劑

圖2 兩種銀溶膠檢測(cè)4種對(duì)照品的SERS圖

2.3 銀溶膠的SEM與紫外表征

采用DMF為還原劑和溶劑、PVP為穩(wěn)定劑還原硝酸銀，成功地合成出了銀納米粒子。溶液由無色到最終變?yōu)辄S棕色的顏色轉(zhuǎn)變，直觀地呈現(xiàn)了銀納米顆粒的合成。利用掃描電鏡和紫外可見光譜對(duì)合成的銀納米粒子進(jìn)行表征，結(jié)果見圖3。以DMF為還原劑制備的銀溶膠的紫外表征圖(圖3(a))，其在414 nm處存在一個(gè)最大吸收峰，表明其中的銀納米粒子為球形，且直徑為50 nm左右[13]。紫外光譜的半峰寬窄，說明制得的銀納米顆粒粒徑均勻。該銀溶膠的SEM圖(圖3(b))顯示，制備的銀納米粒子大致呈球形，直徑為50 nm左右，與紫外表征結(jié)果相一致。

圖3 (a) 銀溶膠的紫外表征圖譜和(b) 銀溶膠的SEM圖譜

2.4 D-SERS法檢測(cè)

SERS檢測(cè)技術(shù)通常是在濕態(tài)溶液或干態(tài)成膜中進(jìn)行的，然而在這兩種情況下都很難保證SERS基底的最大增強(qiáng)效果。此時(shí)，就要尋找一個(gè)最佳的基底狀態(tài)，即“熱點(diǎn)”來進(jìn)行SERS檢測(cè)，才能保證最大程度的增強(qiáng)效果。本實(shí)驗(yàn)使用現(xiàn)有的D-SERS方法[14-16]進(jìn)行檢測(cè)，即將銀溶膠滴加到待測(cè)物斑點(diǎn)上，在納米銀溶膠由濕態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦蓱B(tài)的過程中進(jìn)行動(dòng)態(tài)SERS檢測(cè)。期間，銀溶膠的納米顆粒在溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生的毛細(xì)引力作用下相互靠近，源源不斷地產(chǎn)生SERS‘熱點(diǎn)’，同時(shí)銀溶膠也在不斷地濃縮從而使SERS信號(hào)得到很大的提高。同一般的SERS檢測(cè)方法相比，D-SERS方法具有很高的靈敏度和重現(xiàn)性，且無需樣品的前處理，真正體現(xiàn)了拉曼光譜方法在快速檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)。

2.5 激光強(qiáng)度的考察

拉曼儀器的激光強(qiáng)度會(huì)對(duì)SERS檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)中隨著激光強(qiáng)度的提高，SERS的檢測(cè)信號(hào)也會(huì)逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)激光強(qiáng)度超過一定的臨界值時(shí)，激光強(qiáng)度過高會(huì)引起待測(cè)物燒損，導(dǎo)致無法得到可用的SERS信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同的激光強(qiáng)度10%、20%、50%、80%、90%、100%進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，當(dāng)激光強(qiáng)度從10%逐漸提高至80%，SERS檢測(cè)信號(hào)也逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)激光強(qiáng)度超過80%，待測(cè)物斑點(diǎn)極易被燒灼，不利于SERS光譜的采集。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選定激光強(qiáng)度為80%。

2.6 模擬陽性樣品的檢測(cè)

采用以DMF為還原劑和溶劑制備的銀溶膠，按照TLC-SERS檢測(cè)方法對(duì)模擬陽性樣品和對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)，并同其原位SERS圖譜進(jìn)行比較，得到的結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，以DMF為還原劑制備的銀溶膠本身的特征峰有659、865、1 095、1 410、1 440 cm-1，其特征峰均來自溶劑DMF；舒必利SERS圖譜主要的特征峰有674、795、923、1 168、1 246、1 597 cm-1；利培酮SERS圖譜主要的特征峰有610、760、779、956、1 272、1 350 cm-1；奮乃靜SERS圖譜主要的特征峰有586、678、1 040、1 245、1 294、1 566 cm-1；卡馬西平SERS圖譜的主要特征峰有697、719、1 021、1 039、1 219、1 307、1 563、1 599 cm-1。從圖4可以看出，對(duì)照品的原位SERS圖譜、對(duì)照品的TLC-SERS圖譜以及模擬陽性樣品的TLC-SERS圖譜的主要特征峰均一致，表明該方法具有良好的專屬性。

2.7 檢測(cè)限的考察

精密稱取舒必利、利培酮、奮乃靜、卡馬西平對(duì)照品適量加入到抗精神失常類中藥中，使其摻雜量梯度分別為2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/mL，按照制備模擬陽性對(duì)照品的方法進(jìn)行溶液制備，再TLC-SERS檢測(cè)。根據(jù)信噪比S/N為3時(shí)，確定各物質(zhì)的最低檢測(cè)限(LOD)分別為舒必利0.1 mg/mL、利培酮0.1 mg/mL、奮乃靜0.05 mg/mL、卡馬西平0.02 mg/mL。

(a)奮乃靜(b)舒必利(c)利培酮(d)卡馬西平

a-對(duì)照品的原位SERS圖譜，b-對(duì)照品的TLC-SERS圖譜，

c-模擬陽性樣品的TLC-SERS圖譜，d-銀溶膠的空白圖譜

圖4 4種化合物的原位SERS和TLC-SERS圖譜

2.8 真實(shí)樣品檢測(cè)

利用建立的TLC方法對(duì)6種抗精神失常類中藥(編號(hào)1～6)進(jìn)行檢測(cè)，得到的結(jié)果如圖5所示。圖中結(jié)果顯示，2號(hào)樣品的色譜條帶中出現(xiàn)了與舒必利對(duì)照品比移值相近的斑點(diǎn)；而4號(hào)樣品的色譜條帶中出現(xiàn)了與卡馬西平比移值相近的斑點(diǎn)，說明2號(hào)樣品可能添加了舒必利，4號(hào)樣品中可能添加了卡馬西平。

1～6-6種抗精神失常類中成藥樣品，7-舒必利，8-奮乃靜，9-利培酮，10-卡馬西平

圖5 真實(shí)樣品薄層色譜圖

然而，由于中藥體系十分復(fù)雜，僅憑TLC法并不能準(zhǔn)確地確認(rèn)是否摻雜了化藥成分。為此做了進(jìn)一步結(jié)果驗(yàn)證，即對(duì)2號(hào)和4號(hào)樣品中出現(xiàn)的與對(duì)照品比移值相近的斑點(diǎn)處進(jìn)行SERS光譜采集，并與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照品SERS圖譜對(duì)比。圖6結(jié)果顯示，2號(hào)樣品在與舒必利相應(yīng)位置處斑點(diǎn)的SERS光譜和舒必利對(duì)照品的SERS光譜主要特征峰一致；4號(hào)樣品在與卡馬西平相應(yīng)位置處斑點(diǎn)的SERS光譜和卡馬西平對(duì)照品的SERS光譜主峰一致。因此可以初步判定，2號(hào)樣品中添加了舒必利，4號(hào)樣品中添加了卡馬西平。

a-色譜條帶中斑點(diǎn)處的SERS圖譜，b-舒必利薄層展開處的SERS圖譜

圖6 2、4號(hào)樣品SERS檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 語

本文建立了一種TLC-SERS法用于快速檢測(cè)抗精神失常類中成藥中化藥成分的方法，并運(yùn)用D-SERS方法成功檢測(cè)出中成藥中的化學(xué)摻偽成分。該方法同傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，為中藥摻偽的現(xiàn)場(chǎng)快檢提供了一種新的解決方案。

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Rapid Detection of Chemical Drugs in Antipsychotic Traditional Chinese Medicine by TLC-SERS

WANGLei1,CHENMeng-yun2,LIXiao2,LUFeng2,XUJi-yang1

(1. Department of Biochemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Pharmaceutical Analysis, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

A rapid detection method was established for chemicals illegally added in Antipsychotic traditional Chinese medicine (TCM). The method used thin layer chromatography (TLC), and combined with surface-enhanced Raman scattering (SERS). After optimizing several experimental factors of the silver colloid, detection method of D-SERS and intensity of laser, TLC was used to separate TCM matrixes and four types of adulterated chemicals such as perphenazine, carbamazepine, risperidone and sulpiride. Trichloromethane, methanol and water (8∶2∶0.2) was used as the mobile phase and TCM was located under UV 254 nm, then the separated trace substances in TLC plant were tested by SERS method. In conclusion, the established specific and sensitive TLC-SERS technique could be used to detect the chemical adulteration in antipsychotic drugs of Chinese medicine, and the lowest limit of detection was to 0.02 mg/mL. Compared with the HPLC method, this method was simple, rapid and without sample pretreatment. In this case, the TLC-SERS method has potentially broad application in the fields of on-line fast screening.

surface enhanced Raman scattering; thin layer chromatography; traditional Chinese medicine; illegally added chemicals

2015-08-18

國家重大科學(xué)儀器專項(xiàng)(2012YQ180132)資助

王 磊(1990-)，男，山東日照人，碩士生，主要研究方向?yàn)橹兴帗絺蔚谋砻嬖鰪?qiáng)拉曼研究。

許激揚(yáng)(1964-)，男，浙江金華人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)椋菏中运幬锖铣伞el.：025-83271306;E-mail：jiyangx@126.com

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1006-7167(2016)05-0022-05