梁 文， 許 麗， 李蘭英， 李 妍， 聞艷麗， 徐 勤， 任淑貞， 劉 剛

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院 化學(xué)與電離輻射所，上海 201203)

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轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

梁 文， 許 麗， 李蘭英， 李 妍， 聞艷麗， 徐 勤， 任淑貞， 劉 剛

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院 化學(xué)與電離輻射所，上海 201203)

為了方便、快速地檢測(cè)大豆及其加工食品中的轉(zhuǎn)基因成分，準(zhǔn)確定量轉(zhuǎn)基因大豆的轉(zhuǎn)基因含量，構(gòu)建含常用轉(zhuǎn)基因插入元件花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTⅡ、玄參花葉病毒FMV35S啟動(dòng)子和大豆內(nèi)源基因Lectin-1的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，質(zhì)粒DNA中靶基因元件均為單拷貝。開展了質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性、檢測(cè)適用性、定值及不確定度評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)中，質(zhì)粒DNA的4種轉(zhuǎn)基因插入元件分別與大豆內(nèi)源基因Lectin-1的比值為0.98±0.06(CaMV35S:L-1)，0.95±0.06(FMV35S:L-1)，1.05±0.08(NOS:L-1)，1.11±0.08(NPTII:L-1)(k=2)，靶基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.99，可用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果質(zhì)量控制，能力驗(yàn)證等活動(dòng)。

轉(zhuǎn)基因大豆； 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)； 不確定度評(píng)定

0 引 言

轉(zhuǎn)基因技術(shù)將基因在不同物種之間轉(zhuǎn)移，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在性狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人類所需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變，滿足人類的各種需求，例如提高產(chǎn)量、表達(dá)特殊營養(yǎng)成分甚至獲得抗除草劑抗病毒或抗蟲害的能力[1-3]。但是，隨著轉(zhuǎn)基因作物在全世界范圍內(nèi)的廣泛種植，其食用安全和環(huán)境安全問題也引起了廣大消費(fèi)者和各國政府及相關(guān)機(jī)構(gòu)人員的重視[4-5]。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)已成為各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管的重要部分。qPCR是轉(zhuǎn)基因核酸檢測(cè)的主要方法[6-7]。轉(zhuǎn)基因作物中常用的插入元件CaMV35S、NOS、NPTⅡ、FMV35S常作為靶標(biāo)基因，用于鑒定轉(zhuǎn)基因成分和含量[8-10]，而轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源基因Lectin-1由于保守性強(qiáng)，常作為大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)靶標(biāo)基因[11]。

本文首先構(gòu)建的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含有4個(gè)轉(zhuǎn)基因插入元件和一個(gè)大豆內(nèi)源基因，測(cè)序驗(yàn)證各轉(zhuǎn)基因元件和內(nèi)源基因的比例均為1∶1；然后優(yōu)化了qPCR法檢測(cè)靶標(biāo)基因的引物探針和PCR體系，并用該體系研究了質(zhì)粒DNA的均勻性、穩(wěn)定性、檢測(cè)適用性、量值及不確定度評(píng)價(jià)，為其作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑及儀器

基因組提取試劑盒(OMEGA)；質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA)；限制性內(nèi)切酶、λ-Hind III DNA Marker(寶生物工程有限公司)；質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，全基因人工合成、引物合成(寶生物工程有限公司)；轉(zhuǎn)基因大豆粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ERM-410gk)；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

快速梯度PCR儀(Bio-rad)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life technologies)；微量核酸蛋白定量儀(Nanodrop 2000)；電泳儀、電泳槽(BioRad)；凝膠成像儀(BioRad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 質(zhì)粒DNA分子的構(gòu)建和提取。在數(shù)據(jù)庫中檢索轉(zhuǎn)基因通用元件的保守序列：花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子(269 bp)、NOS終止子(256 bp)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPT Ⅱ(831 bp)、玄參花葉病毒FMV 35S啟動(dòng)子(564 bp)，人工合成并插入到質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)中，得到質(zhì)粒pLW09，設(shè)計(jì)引物序列，提取大豆的基因組DNA，克隆大豆內(nèi)源基因Lectin-1，并插入到質(zhì)粒載體pLW09，得到轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)質(zhì)粒pLW12。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，大量提取質(zhì)粒DNA。

(2) 質(zhì)粒DNA純度的驗(yàn)證。用紫外分光光度法測(cè)定DNA在A230，A260，A280處的吸光值。純DNA的A260/A280應(yīng)為1.8～2.0[12]，而A260/A230應(yīng)達(dá)到2.0。用凝膠電泳圖像分析法鑒定單酶切前后的質(zhì)粒分子。

(3) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物探針和程序。參考已報(bào)道的檢測(cè)4種轉(zhuǎn)基因元件和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin-1的引物探針[13]，并根據(jù)PCR的擴(kuò)增效率對(duì)引物探針進(jìn)行優(yōu)化，序列詳見表1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40個(gè)循環(huán)。

表1 轉(zhuǎn)基因插入基因及植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的引物及探針序列

(4) 適用性考察。梯度稀釋質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度從(106～100)copies/μL，以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，根據(jù)不同濃度模板擴(kuò)增的Ct值與濃度之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5) 均勻性分析。方差分析法是用來統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均勻性的最常用方法，是通過組間、組內(nèi)方差的比較來判斷各組測(cè)量值之間有無系統(tǒng)性差異，如果兩者的比小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的[14]。

具體方法：從質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15瓶；對(duì)所取每個(gè)樣品取樣3次，每次取樣量為5 μL。每個(gè)取樣量用qPCR法進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，將外源轉(zhuǎn)基因元件CaMV35S和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增得到的Ct值相比后，對(duì)測(cè)定結(jié)果用方差分析法(F-檢驗(yàn)法)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，判斷均勻性檢驗(yàn)結(jié)果。

(6) 穩(wěn)定性考察。穩(wěn)定性考察包括短期穩(wěn)定性考察與長期穩(wěn)定性考察[14]。將制備的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置在室溫20 ℃和4 ℃下，以轉(zhuǎn)基因元件和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在PCR擴(kuò)增中的Ct比值為特性量值，進(jìn)行15 d的短期穩(wěn)定性考察。同樣，分別在樣品制備完成后0～4、6個(gè)月對(duì)制備的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)建

質(zhì)粒分子在載體pcDNA3.1(+)上首先連續(xù)插入4種轉(zhuǎn)基因元件CaMV35S(269 bp)、NOS(256 bp)、NPTⅡ(831 bp)、FMV35S(564 bp)，然后再克隆大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin-1(789 bp)，得到總長為8 149 bp的質(zhì)粒分子(見圖1)。

圖1 質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 質(zhì)粒DNA的純度鑒定

質(zhì)粒DNA用紫外分光光度計(jì)Nanodrop2000檢測(cè)，A260/A280=1.89，A260/A230=2.02，均滿足紫外分光光度法鑒定核酸的標(biāo)準(zhǔn)。電泳分析DNA純度，質(zhì)粒DNA經(jīng)內(nèi)切酶Kpn I單酶切處理(37 ℃水浴酶解2 h)，用0.8%瓊脂糖電泳凝膠成像分析DNA條帶(見圖2)。

圖2 酶切前后質(zhì)粒DNA電泳圖

電泳上樣順序：1-Marker，2-環(huán)狀質(zhì)粒，3-酶切后線狀質(zhì)粒(50 ng)，4-酶切后線狀質(zhì)粒(100 ng)

2.3 質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證

通過測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒DNA的序列與設(shè)計(jì)序列的一致性和拷貝數(shù)的單一性。6家單位的測(cè)序結(jié)果均表明，轉(zhuǎn)基因元件和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的序列和設(shè)計(jì)序列的正確性為100%，參與測(cè)序的6家單位分別是：英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，生工生物工程(上海)股份有限公司、上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司，蘇州金唯智生物科技有限公司，上海杰李生物技術(shù)有限公司。最終結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因插入元件和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的比例均為1∶1。

2.4 適用性考察結(jié)果

以質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，相關(guān)線性系數(shù)均達(dá)到0.99，各梯度之間無交叉，每個(gè)靶基因拷貝數(shù)檢測(cè)的最低檢出限(LOD)均小于100 copies/μL，表明質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適合應(yīng)用于qPCR檢測(cè)，可作為qPCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物常用靶基因序列的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

圖3 質(zhì)粒DNA靶基因的PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

(圖(a)～(e)的靶基因分別為大豆內(nèi)標(biāo)基因Lectin-1，轉(zhuǎn)基因元件CaMV35S、NOS、NPTⅡ、FMV35S)

2.5 均勻性分析結(jié)果

將質(zhì)粒DNA作為模板，qPCR擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)基因元件與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的Ct比值為特性量值，用F檢測(cè)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶間均勻性統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在95%置信水平下，F(xiàn)值均小于F0.05(14，30)，證明各質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶間均勻性良好，符合《JJG1006-94 一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》瓶間均勻性檢驗(yàn)合格要求。

2.6 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采用同步穩(wěn)定性研究，利用qPCR法，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各轉(zhuǎn)基因元件基因和植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增的Ct相比，將比值采用線性模型進(jìn)行分析。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在20 ℃和4 ℃下的短期穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，斜率不顯著(P>0.05)，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在20℃和4℃下保存15 d是穩(wěn)定的。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃條件下進(jìn)行6個(gè)月的長期穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，斜率不顯著，因此質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20 ℃條件下保存6個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的，見表2。

表2 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pLW12在-20 ℃保存的長期穩(wěn)定性檢測(cè)數(shù)據(jù)

2.7 定值結(jié)果

用qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)基因元件和植物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在PCR反應(yīng)中的Ct值，以轉(zhuǎn)基因元件和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的Ct比值為特性量值給標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，共得到6組數(shù)據(jù)，每組平行測(cè)定3次取平均值，進(jìn)行定值分析。匯總?cè)吭紨?shù)據(jù)，經(jīng)檢測(cè)，全部原始數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且各組數(shù)據(jù)等精度。以t-檢驗(yàn)法和狄克遜(Dixon)法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，證明每組數(shù)據(jù)的平均值不存在顯著性差異；將6個(gè)平均值再次計(jì)算平均值，求出質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的Ct比值的平均值，即為質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值(單位：1)，數(shù)據(jù)見表3。

2.8 不確定度評(píng)定

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源由三部分組成：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性引起的不確定度；②標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動(dòng)性引起的不確定度；③標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度，包括數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度和通過對(duì)定值方法中測(cè)量影響因素進(jìn)行分析評(píng)定的不確定度[15]。

表3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pLW12的定值結(jié)果

(1) 均勻性引入的不確定度。均勻性分析結(jié)果表明，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶間差異極小。瓶間均勻性引入的不確定度(具體數(shù)據(jù)見表4)：

(2) 穩(wěn)定性引入的不確定度。在6個(gè)月穩(wěn)定性檢測(cè)中，有效期t=6月長期穩(wěn)定性引起的不確定度為：

其中：s(β1)為長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)部分求出的與斜率相關(guān)的不確定度因素。

(3) 定值和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程帶來的不確定度包括：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度和通過對(duì)定值方法中測(cè)量影響因素進(jìn)行分析評(píng)定的不確定度。

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度為由6組測(cè)量結(jié)果計(jì)算的A類不確定度。合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為下式所示：

通過對(duì)測(cè)量影響因素的分析，得出B類不確定度的分量(uB)。該分量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的整個(gè)過程有關(guān)，本研究主要考慮移液器的加樣過程，移液器帶來的不確定度主要為質(zhì)粒核酸溶液取用的重復(fù)性偏差。根據(jù)10 μL移液器的檢定結(jié)果，最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%，按照均勻分布轉(zhuǎn)化，則

(4) 擴(kuò)展不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成不確定度：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度u(c)計(jì)算，取擴(kuò)展因子k=2，結(jié)果見表4。

3 結(jié) 語

本研究通過調(diào)研國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因作物PCR相關(guān)檢測(cè)方法，構(gòu)建了一個(gè)包含4種轉(zhuǎn)基因常用插入元件靶基因序列CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、新霉素磷酸

表4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度分量

不確定度分量CaMV35SFMV35SNOSNPTIIurel(bb)0.0080.0080.0080.007urel(s)0.0240.0320.0400.032urel(A)0.0100.0090.0080.011urel(B)0.0020.0020.0020.002u(c)0.0600.0600.0800.080

轉(zhuǎn)移酶基因NPTⅡ、FMV35S啟動(dòng)子和大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin-1的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使轉(zhuǎn)基因檢測(cè)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的轉(zhuǎn)基因元件和作物內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的比例為1∶1，即轉(zhuǎn)基因含量為100%，利于轉(zhuǎn)基因成分含量的計(jì)算。對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法進(jìn)行了探索，應(yīng)用基因測(cè)序法和qPCR兩種方法對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了定值；依照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)要求對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，證明其具有良好的均勻性和穩(wěn)定性。用優(yōu)化后的qPCR檢測(cè)方法，以研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板，針對(duì)5種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)靶標(biāo)基因均能建立線性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，證明其適用于轉(zhuǎn)基因大豆的qPCR法檢測(cè)。

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LIANGWen,XULi,LILan-ying,LIYan,WENYan-li,XUQin,RENShu-zhen,LIUGang

(Chemical and Ionizing Radiation Metrolology Institute, Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology, Shanghai 201203, China)

In order to find a simplified and accurate detection of the genetically modified soybean and its processed food, we developed an unique plasmid molecule for genetically modified soybean PCR analysis, it contained four exogenous target DNA element of genetically modified organisms (CaMV35S, NOS, NPTII and FMV35S), and one element of soybean endogenous (Lectin-1 gene, L-1). All the target genes were inserted into the plasmid with single copy. We quantified the ratios of the exogenous target DNAs and the L-1 as the certified valued of the reference material, and we evaluated the uniformity, stability, and the uncertainty, and examined the applicability of our plasmid. The certified values and expanded uncertainties (k=2) for the candidate reference material in the real time PCR were 0.98±0.06 (CaMV35S:L-1), 0.95±0.06 (FMV35S:L-1), 1.05±0.08 (NOS:L-1), 1.11±0.08 (NPTII:L-1), respectively. TheR2values of the standard curve for target genes were all higher than 0.99. The plasmid reference material can be used in quality control and proficiency testing for GMOs analysis. It is innovative that plasmid DNA standard material containing multiple transgenic testing element and the ratio of gene copy number for each element and soybean is 1∶1.

genetically modified roundup ready soybean; plasmid reference material; uncertainty evaluation

2015-08-06

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310016)；上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院項(xiàng)目(HOORY1406)

梁 文 (1986-)，女，四川德陽人，碩士，工程師，主要研究方向?yàn)樯镉?jì)量。

Tel.：021-38839800*35350；E-mail：liangw@simt.com.cn

Q 819

A

1006-7167(2016)05-0018-04