廖 霞，楊小蘭，李 瑤，王麗穎，明 建,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)凝聚法制備槲皮素微膠囊工藝及其理化性質(zhì)

廖 霞1，楊小蘭1，李 瑤1，王麗穎1，明 建1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

以槲皮素為芯材，殼聚糖、海藻酸鈉為壁材，采用復(fù)凝聚法制備槲皮素微膠囊。以包埋率和載藥量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)分析各因素，并對(duì)槲皮素微膠囊的理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：壁材比（殼聚糖-海藻酸鈉質(zhì)量比）1∶3.34（g/g）、芯壁比4.34∶1（g/g）、京尼平用量18.44 g/100 g殼聚糖、固化溫度41.56 ℃時(shí)，包埋率為69.53%。制備的槲皮素微膠囊水分含量為3.26%，休止角為40.39°，溶解度為256.44 μg/mL，粒徑大小較為均勻，平均粒徑為1 362 nm，具有較好的溶解性和穩(wěn)定性。

槲皮素；復(fù)凝聚法；微膠囊；理化性質(zhì)

槲皮素是一類天然的黃酮類化合物[1]，廣泛存在于食用植物，具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抗糖尿病[5]等多種生物活性，近年來(lái)頗受國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視。由于槲皮素親水性、親脂性較差[6]，在酸性和中性條件下易被氧化，對(duì)光、熱和氧氣敏感，生物利用率低，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。為此，國(guó)內(nèi)外大量的研究者對(duì)槲皮素的研究方向主要是對(duì)槲皮素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾、改性、合成槲皮素衍生物，改善槲皮素的生物活性及溶解性，并采用親水性物質(zhì)對(duì)槲皮素進(jìn)行包埋從而提高其水溶性。微膠囊包埋可減少功能因子在加工或貯藏過(guò)程中的

損失，保護(hù)其免受腸道不利環(huán)境的影響，使芯材對(duì)靶細(xì)胞具有較好的靶向性[7]，提高功能因子的生物利用度。殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊在食品中主要用于包埋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、固化酶類制劑，在微膠囊緩釋、控制功能因子釋放方面應(yīng)用廣泛。

復(fù)凝聚法是采用帶有相反電荷的聚電解質(zhì)作為壁材，將芯材分散在壁材溶液中，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH值、溫度、質(zhì)量濃度或加入無(wú)機(jī)鹽電解質(zhì)等，使電解質(zhì)發(fā)生靜電作用，使得壁材溶解度降低，發(fā)生凝聚以形成微膠囊將芯材包覆[8]。其凝聚過(guò)程溫和，適于對(duì)芯材為非水溶性的固體粉末或液體的包埋，尤其對(duì)一些不穩(wěn)定的物質(zhì)，如多酚類物質(zhì)，復(fù)凝聚包埋效率較高。由于有良好的控釋特性[9]，復(fù)凝聚包埋技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品成分微膠囊化、提高食品功能成分穩(wěn)定性[10]。海藻酸鈉和殼聚糖是無(wú)毒、生物相容性高、具有生物降解性、可再生性的天然多糖[11]，由于二者復(fù)合物具有聚電解質(zhì)的性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于微膠囊制備[12]，兩種壁材通過(guò)靜電作用力形成囊壁結(jié)構(gòu)，同時(shí)，氫鍵、范德華力、疏水相互作用、其他非共價(jià)鍵等作用力也對(duì)囊壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有輔助作用[13]。京尼平是近幾年研究比較熱的一種交聯(lián)劑，以共價(jià)鍵的形式對(duì)殼聚糖、明膠、蛋白質(zhì)、膠原等富含自由氨基的聚合物進(jìn)行交聯(lián)[14]，其交聯(lián)殼聚糖等含氨基基團(tuán)的化合物交聯(lián)的機(jī)理還不是很明確，其中，最為成熟的機(jī)理是pH值依賴型機(jī)理，在不同的pH值條件下，京尼平與殼聚糖等的交聯(lián)機(jī)理不同[15-16]。本研究以殼聚糖、海藻酸鈉為復(fù)合壁材，采用復(fù)凝聚法對(duì)槲皮素進(jìn)行微膠囊化包埋，進(jìn)行制備工藝優(yōu)化和理化性質(zhì)分析，進(jìn)而評(píng)價(jià)其溶解性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素、京尼平 西安小草植物科技有限責(zé)任公司；殼聚糖（食品級(jí)） 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；海藻酸鈉（食品級(jí)） 青島明月海藻有限公司；水溶性VE聚乙二醇琥珀酸酯（vitamin E polyethylene glycol succinate，TPGS） 杭州天誠(chéng)藥業(yè)有限公司；其他化學(xué)試劑（均為分析純） 成都科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-D均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；1-15PK離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 金壇市易晨?jī)x器制造有限公司；5810臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；RE-5296旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10真空冷凍干燥 北京松原華興科技發(fā)展有限公司；Nano-ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀 英國(guó)Malvern儀器有限公司；DSC400差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素微膠囊的制備

工藝流程：殼聚糖+乳化劑→攪拌混合→加入槲皮素→高速剪切乳化→加入海藻酸鈉→充分反應(yīng)→加入固化劑→固化→冷凍干燥→產(chǎn)品。

稱取0.2 g TPGS于燒杯中，置于50 ℃的水浴鍋中熔融成可以流動(dòng)的狀態(tài)，加入10 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的殼聚糖溶液，混勻，加入一定量槲皮素，高速（10 000 r/min）剪切乳化50 s。將乳劑和30 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的海藻酸鈉溶液，同時(shí)滴加到25 mL 10 ℃的蒸餾水中，充分反應(yīng)（800 r/min）30 min。升溫至20 ℃，緩慢加入20 mL京尼平溶液（含20 mg京尼平），固化30 min。調(diào)節(jié)溶液pH 6.0，繼續(xù)反應(yīng)30 min。升溫至50 ℃，繼續(xù)固化反應(yīng)60 min。降溫至20 ℃，靜置，沉降，抽濾，用蒸餾水多次洗滌，真空冷凍干燥得到槲皮素微膠囊樣品。

1.3.2 槲皮素微膠囊的效果評(píng)定

1.3.2.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[17]

精確稱取10 mg槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，于100 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇溶解，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以無(wú)水乙醇為空白，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)在373 nm處。精確量取一定量槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，用無(wú)水乙醇稀釋為質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于373 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并以吸光度為縱坐標(biāo)（Y）、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.096 4x+0.001 4，R2=0.999 8（n=5）。

1.3.2.2 槲皮素含量測(cè)定

精確稱取20 mg槲皮素微膠囊樣品，置于棕色容量瓶中，加入少量無(wú)水乙醇，超聲提取15 min，使得其微膠囊結(jié)構(gòu)被破壞，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，過(guò)濾，準(zhǔn)確量取1 mL上清液，置于棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至50 mL，于373 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.2.3 包埋率計(jì)算

1.3.2.4 載藥量計(jì)算

1.3.3 槲皮素微膠囊制備工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

對(duì)乳化劑（Span 80、Tween 80、PEG 400、

TPGS）、乳化劑加入量（2、3、4、5 g/g殼聚糖）、壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%）、壁材（殼聚糖-海藻酸鈉）比（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g/g））、芯壁比（5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（g/g））、pH值（3.0、4.0、5.0、6.0）、京尼平用量（5、10、15、20、25 g/100 g殼聚糖）、固化溫度（10、20、30、40、50 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)槲皮素微膠囊包埋率和載藥量影響較大的4 個(gè)因素壁材比、芯壁比、京尼平用量、固化溫度為自變量，以包埋率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6分析軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面組合，對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 The coded levels and corresponding actual levels of the factors investigated in response surface analysis

1.3.4 槲皮素微膠囊理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1 含水量測(cè)定

參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》[18]直接干燥法測(cè)定。

1.3.4.2 流動(dòng)性測(cè)定

粉體的流動(dòng)性常用休止角來(lái)表示，參照GB 11986—1989《表面活性劑：粉體和顆粒休止角的測(cè)定》[19]固定圓錐底法。

1.3.4.3 溶解度測(cè)定

稱取適量槲皮素微膠囊樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的TPGS溶液，在室溫條件下攪拌3 d，8 000 r/min離心30 min，上清液經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔濾膜，濾液于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至蒸干，然后用少量乙醇溶解，并稀釋適當(dāng)倍數(shù)，于373 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出槲皮素的溶解量，實(shí)驗(yàn)做3 次平行。

1.3.4.4 Zeta電位測(cè)定

稱取一定量槲皮素微膠囊樣品，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的溶液，室溫條件下分別調(diào)至不同pH值，每次測(cè)定吸取1 mL樣液，采用Zeta電位分析儀，于25 ℃測(cè)定不同pH值條件下的Zeta電位。

1.3.4.5 粒度測(cè)定

稱取一定量槲皮素微膠囊樣品，均勻分散在蒸餾水中，配制成0.01 g/L左右溶液，用磁力攪拌器攪拌分散均勻，靜置，用注射器吸取1 mL微膠囊分散液，置于納米粒度分析儀中測(cè)定粒度。

1.3.4.6 DSC分析

稱取3.0 mg槲皮素微膠囊樣品加到DSC鋁盒中，以空白鋁盒為對(duì)照，以10 ℃/min 的速率從25 ℃加熱至400 ℃，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，采用DSC儀記錄加熱過(guò)程中的圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乳化劑種類對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖1 槲皮素在不同乳化劑中的顯微形態(tài)（400×）Fig.1 Morphology of quercetin emulsified with different emulsifiers (400 ×)

由圖1可知，1% PEG 400、1% Tween 80、1% TPGS為均勻的分散乳液，槲皮素乳劑易過(guò)濾，澄清透明，穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)分層。1% TPGS槲皮素乳劑為溶液狀，在1% TPGS條件下乳劑顏色最深，槲皮素相對(duì)質(zhì)量濃度最大；1% Span 80條件下槲皮素乳劑為乳黃色半透明混懸液，呈現(xiàn)圓球狀，液滴不均勻，槲皮素乳劑粒徑較大，不易過(guò)濾，放置一段時(shí)間（24 h）會(huì)出現(xiàn)分層，穩(wěn)定性差。乳劑特性與表面活性劑親水親油平衡值相關(guān)，考慮到溶解性等綜合因素，后續(xù)試驗(yàn)選用TPGS作為表面活性劑。

2.1.2 TPGS加入量對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖2 TPGS加入量對(duì)微膠囊包埋效果的影響Fig.2 Effects of TPGS addition on the embedding efficiency and yield of quercetin microcapsules

如圖2所示，乳化劑加入量增加，包埋率和載藥量相應(yīng)增加，TPGS加入量為3 g/g殼聚糖溶液時(shí)，包埋效果最好。當(dāng)TPGS加入量超過(guò)3 g/g殼聚糖溶液時(shí)，包埋率和載藥量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)?？赡艿脑蚴荰PGS室溫條件下在水中溶解度為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），超過(guò)此質(zhì)量分?jǐn)?shù)將形成高黏度的液晶相。隨著TPGS在水中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，液晶相結(jié)構(gòu)逐漸變化，從各向同性的球狀膠束到圓筒狀膠束、正反六角形膠束、反球狀膠束變化，最后形成薄層片狀液晶態(tài)[20]，在一定程度上將影響槲皮素的乳化性和溶解性。為此，后續(xù)試驗(yàn)確定TPGS加入量為3 g/g殼聚糖溶液。

2.1.3 壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖3 壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊包埋效果的影響Fig.3 Effect of wall material concentration on the embedding efficiency and yield of quercetin microcapsules

由圖3可知，當(dāng)壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，包埋率和載藥量都較低，對(duì)槲皮素的包埋效果較差；當(dāng)壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，包埋率和載藥量都達(dá)到最高值。當(dāng)壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，包埋率和載藥量都有所下降。而壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，壁材對(duì)槲皮素包覆不完全，形成的微膠囊囊壁厚度不均勻，穩(wěn)定性差，容易破裂，使芯材滲漏；隨著壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其黏度增大，流動(dòng)性也相應(yīng)變差，微膠囊容易聚集成團(tuán)，黏連較嚴(yán)重，不利于形成均一穩(wěn)定的槲皮素微膠囊。根據(jù)包埋率和載藥率的綜合評(píng)價(jià)，壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，包埋效果最好。

2.1.4 壁材比對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖4 壁材比對(duì)微膠囊包埋效果的影響Fig.4 Effect of wall material ALG/CS ration on the embedding efficiency and yield of quercetin microcapsules

由圖4可知，壁材比在1∶1～1∶3區(qū)間，隨著壁材海藻酸鈉比例增加，包埋率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；壁材比為1∶3時(shí)，槲皮素的包埋率達(dá)到最高值；而1∶3后，包埋率則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。載藥量隨著壁材中海藻酸鈉比例的增大一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)殼聚糖-海藻酸鈉質(zhì)量比在1∶3之后，載藥量增加趨勢(shì)趨于平緩。為此優(yōu)化試驗(yàn)壁材選用殼聚糖與海藻酸鈉最佳質(zhì)量比為1∶3。

2.1.5 芯壁比對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖5 芯壁比對(duì)微膠囊包埋效果的影響Fig.5 Effect of core/wall material ratio on the embedding efficiency and yield of quercetin microcapsules

由圖5可知，芯壁比在4∶1～1∶1區(qū)間，包埋率較高，隨著體系芯材比例提高，包埋率和載藥量逐漸提高，因?yàn)殡S芯材比例的增加，單位質(zhì)量的壁材包埋芯材的量也逐漸增加。當(dāng)芯壁比為4∶1時(shí)，包埋率達(dá)到最高。但隨著芯材比例不斷增大，單位質(zhì)量的壁材包埋芯材的量也逐漸增加，會(huì)導(dǎo)致凝聚在芯材液滴周圍的壁材復(fù)合物含量減少[21]，使得微膠囊的囊壁越來(lái)越薄，難以形成完整的囊壁而呈現(xiàn)裂縫，未包埋芯材易滲透出來(lái)[22]，微囊粒相互黏連嚴(yán)重。當(dāng)壁材含量升高時(shí)，包埋率和載藥量都相應(yīng)的降低。當(dāng)壁材含量過(guò)高時(shí)，微膠囊壁材所帶的正負(fù)電荷相互吸引，容易發(fā)生聚集，不利于微膠囊的形成。綜合考慮后續(xù)試驗(yàn)確定芯壁比為4∶1。

2.1.6 pH值對(duì)槲皮素微膠囊的影響

當(dāng)體系的pH值為3.0時(shí)，微膠囊粒徑均一，囊粒之間不黏連，包埋效果好，與吳春等[23]的研究結(jié)果相似；當(dāng)pH值為4.0、5.0、6.0時(shí)，微膠囊囊粒黏連非常嚴(yán)重，聚

集成團(tuán)，因此包埋率和載藥量的計(jì)算值不準(zhǔn)確。為此，確定制備槲皮素微膠囊的pH 3.0為最佳值，其微膠囊包埋率和載藥量分別為68.34%和56.50%。

2.1.7 京尼平用量對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖6 京尼平用量對(duì)微膠囊包埋效果的影響Fig.6 Effect of cross-linker (genipin) concentration on the embedding efficiency and yield of quercetin microcapsules

由圖6可知，當(dāng)京尼平用量為20?g/100 g殼聚糖時(shí)，包埋率和載藥量都達(dá)到最大值。當(dāng)京尼平用量較小時(shí)，京尼平與壁材中的殼聚糖結(jié)合量少，微膠囊因交聯(lián)不充分而發(fā)生變形，囊粒間出現(xiàn)黏連，包埋率和載藥量較低。當(dāng)京尼平用量低于20 g/100 g殼聚糖時(shí)，隨著京尼平用量增加，交聯(lián)劑與殼聚糖的氨基結(jié)合數(shù)量增加，包埋率和載藥量也相應(yīng)增加。當(dāng)京尼平用量高于20 g/100 g殼聚糖，殼聚糖與京尼平交聯(lián)度過(guò)高，囊粒也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的黏連，甚至析出京尼平。過(guò)量的京尼平在與殼聚糖分子上的氨基反應(yīng)的同時(shí)，京尼平還能自發(fā)的與官能團(tuán)氨基發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生自聚反應(yīng)，生成一種藍(lán)色素，導(dǎo)致包埋率和載藥量下降。最后確定固化劑的最佳用量為20 g/100 g殼聚糖。

2.1.8 固化溫度對(duì)槲皮素微膠囊的影響

圖7 固化溫度對(duì)微膠囊包埋效果的影響Fig.7 Effect of cross-linking temperature on the embedding efficiency and yield of quercetin microcapsules

由圖7可知，當(dāng)京尼平的固化溫度為40 ℃時(shí)，包埋率和載藥量最高。體系溫度的升高，一方面可以提高京尼平在水中的溶解性。另外，分子運(yùn)動(dòng)速率會(huì)隨著溫度的升高而加劇，促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，提高微膠囊的包埋率和載藥量。但京尼平在高溫條件下穩(wěn)定性差，超過(guò)55 ℃，京尼平會(huì)發(fā)生分解。當(dāng)體系交聯(lián)溫度為50 ℃時(shí)，京尼平穩(wěn)定性降低，所以交聯(lián)溫度升高，微膠囊的包埋率和載藥量下降。因此，確定京尼平的固化溫度為40 ℃，這個(gè)反應(yīng)溫度值與Peng Chao等[24]的研究結(jié)果相吻合。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)確定TPGS作為乳化劑、TPGS加入量3 g/g殼聚糖、pH 3.0。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)影響槲皮素微膠囊包埋率的壁材比、芯壁比、京尼平用量、固化溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 槲皮素微膠囊響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 The experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次完全回歸分析，得到4 個(gè)因素與包埋率的回歸方程：Y/%=69.66+0.42A+0.63B-0.53C+0.39D-0.42AB-0.18AC+0.67AD+0.34BC-0.14BD+0.96CD-0.64A2-0.53B2-0.52C2-0.87D2。

由表3可知，用回歸方程描述的方程的全體自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，回歸模型達(dá)到顯著水平（P＜0.01），R2=0.940 5，失擬項(xiàng)不顯著，純誤差值小，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)中的實(shí)際情況擬合較好，試驗(yàn)誤差小。方差分析還表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)中各因素對(duì)包埋率都有較顯著影響，交互項(xiàng)CD高度顯著。結(jié)果顯示，

一次項(xiàng)中影響槲皮素微膠囊包埋率的各因素按大小排序依次為：B（芯壁比）＞C（京尼平用量）＞A（壁材比）＞D（固化溫度）。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table3 Analysis of variance and significance test of the response surface quadratic regression model

2.2.2 響應(yīng)面及等高線分析

圖8 因素交互作用對(duì)包埋率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface and corresponding contour plots showing the effects of preparation conditions on the embedding efficiency of quercetin microcapsules

從圖8可以看出，C（京尼平用量）與D（固化溫度）交互作用顯著，等高線圖最扁平，說(shuō)明這兩個(gè)因素之間的交互作用最大；A（壁材比）與D（固化溫度）的交互作用較顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；A（壁材比）與B（芯壁比）交互作用最小。而其他因素之間的交互作用不顯著，曲面圖較平滑。響應(yīng)面結(jié)果與響應(yīng)面方差分析結(jié)果相同。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)合回歸方程和響應(yīng)曲面圖可以得到復(fù)凝聚法制備槲皮素微膠囊的最佳工藝參數(shù)為壁材比1∶3.34、芯壁比4.34∶1、京尼平用量18.44 g/100 g殼聚糖、固化溫度41.56 ℃，此工藝條件下，理論最高包埋率為69.95%。根據(jù)最優(yōu)方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到槲皮素的最高包埋率為69.53%，與理論值接近，表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的方案可靠。

2.3 槲皮素微膠囊的理化特性

2.3.1 槲皮素微膠囊的含水量、流動(dòng)性和溶解度

槲皮素微膠囊水分含量為3.26%，此條件有利于微膠

囊產(chǎn)品保存。粉體產(chǎn)品的休止角越小，摩擦力越小，流動(dòng)性也越好，測(cè)定槲皮素微膠囊粉末的休止角為40.39°，說(shuō)明產(chǎn)品的流動(dòng)性較好。未包埋之前，槲皮素幾乎不溶于水，在水中的溶解度僅有5.48 μg/mL，包埋后溶解度為256.44 μg/mL，提高了近50 倍。溶解度的提高與制備中使用了TPGS乳化劑有關(guān)，此外微膠囊壁材采用水溶性殼聚糖和海藻酸鈉，對(duì)槲皮素的溶解度有促進(jìn)作用。

2.3.2 槲皮素微膠囊的Zeta電位及粒徑分布分析

圖9 槲皮素微膠囊的Zeta電位分布圖Fig.9 Zeta potential distribution of quercetin microcapsules

圖9中槲皮素微膠囊的Zeta電位為-51.3 mV。體系Zeta電位絕對(duì)值大于30 mV時(shí)，粒子之間能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[25]。本體系Zeta電位絕對(duì)值足夠大，微膠囊穩(wěn)定性較好。由圖10可知，槲皮素微囊平均粒徑為1 362 nm，多分散系數(shù)為0.204，粒徑呈正態(tài)分布且區(qū)域狹窄，說(shuō)明槲皮素膠粒均勻。

圖10 槲皮素微膠囊的粒徑分布圖Fig.10 Particle size distribution of quercetin microcapsules

2.3.3 槲皮素微膠囊的DSC分析

圖11 槲皮素微膠囊及其單體成分的DSC圖譜Fig.11 DSC curves of quercetin microcapsules and its individual components

由圖11可知，所有的物質(zhì)在25～100 ℃范圍內(nèi)，都出現(xiàn)了一個(gè)吸熱峰，這是由于在升溫的過(guò)程中，樣品失水和結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的一個(gè)放熱過(guò)程。殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合物的吸熱峰的溫度與殼聚糖、海藻酸鈉以及殼聚糖-海藻酸鈉物理混合物相比要低，這可能是由于殼聚糖和海藻酸鈉發(fā)生靜電相互作用過(guò)程中發(fā)生能量變化引起的。殼聚糖、海藻酸鈉的放熱峰304.74、226.29 ℃。槲皮素和槲皮素微膠囊的DSC曲線趨勢(shì)大致相同，二者在25～75 ℃范圍內(nèi)，由于水分丟失以及溫度升高引起的槲皮素的結(jié)構(gòu)變化而引起的一個(gè)吸熱峰分別為314.81、305.28 ℃。說(shuō)明，槲皮素與殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合物之間的相互作用一定程度上導(dǎo)致了吸收熱量的變化，影響了槲皮素的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本研究以殼聚糖、海藻酸鈉復(fù)凝聚法制備槲皮素微膠囊，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)制備工藝優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為TPGS為乳化劑、TPGS加入量3 g/g殼聚糖、壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、壁材比（殼聚糖-海藻酸鈉質(zhì)量比）1∶3.34、芯壁比4.34∶1、pH 3.0、京尼平用量18.44 g/100 g殼聚糖、固化溫度41.56 ℃，得到的包埋率為69.53%。所得槲皮素微膠囊具有較好的熱穩(wěn)定性、流動(dòng)性和溶解性，冷凍干燥后易于保存。

[1] CATAURO M, BOLLINO F, PAPALE F, et al. Sol-gel synthesis and characterization of SiO2/PCL hybrid materials containing quercetin as new materials for antioxidant implants[J]. Materials Science and Engineering C, 2016, 58: 945-952. DOI:10.1016/j.msec.2015.09.054.

[2] HEO D J, SHON M S, KIM G N, et al. Effect of UV irradiation on the antioxidant and anti-adipogenic activities of quercetin[J]. Food Science and Biotechnology, 2015, 24(1): 341-345. DOI:10.1007/s10068-015-0045-8.

[3] CíNTIA J K, FABRíCIO F, FABRíCIA D, et al. Quercetin derivative induces cell death in glioma cells by modulating NF-κB nuclear translocation and caspase-3 activation[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016, 84: 116-122. DOI:10.1016/ j.ejps.2016.01.019.

[4] GUAZELLI C F S, FATTORI V, COLOMBO B B, et al. Quercetinloaded microcapsules ameliorate experimental colitis in mice by antiinflammatory and antioxidant mechanisms[J]. Journal of Natural Products, 2013, 76(2): 200-208. DOI:10.1021/np300670w.

[5] BARDY G, VIRSOLVY A, QUIGNARD J F, et al. Quercetin induces insulin secretion by direct activation of L-type calcium channels in pancreatic beta cells[J]. British Journal of Pharmacology, 2013, 169(5): 1102-1113. DOI:10.1111/bph.12194.

[6] 彭游, 付小蘭, 陶春元, 等. 槲皮素化學(xué)修飾與體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2012, 24(3): 398-405. DOI:10.3969/ j.issn.1001-6880.2012.03.028.

[7] ARMIN M, REBECCA N, NIGEL C T, et al. Microencapsulation as a novel delivery method for the potential antidiabetic drug, Probucol[J]. Drug Design, Development and Therapy, 2014, 8: 1221-1230. DOI:10.2147/DDDT.S67349.

[8] 楊小蘭, 袁婭, 譚玉榮, 等. 納米微膠囊技術(shù)在功能食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(21): 359-368. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201321076.

[9] ASHAY J, DEEPIKA T, GARGI G, et al. Characterization of microcapsulated β-carotene formed by complex coacervation using casein and gum tragacanth[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 87: 101-113. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2016.01.117.

[10] DONG Die, QI Zhengliang, HUA Yufei, et al. Microencapsulation of flaxseed oil by soya proteins-gum arabic complex coacervation[J]. International Journal Food Science Technology, 2015, 50(8): 1785-1791. DOI:10.1111/ijfs.12812.

[11] XIAO Congming, SUN Fei. Fabrication of distilled water-soluble chitosan/alginate functional multilayer composite microspheres[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 98(2): 1366-1370. DOI:10.1016/ j.carbpol.2013.07.068.

[12] HUANG Guoqing, CHENG Lingyun, XIAO Junxia, et al. Preparation and characterization of o-carboxymethyl chitosan-sodium alginate polyelectrolyte complexes[J]. Colloid and Polymer Science, 2015, 293(2): 401-407. DOI:10.1007/s00396-014-3432-4.

[13] SCHMITT C, SANCHEZ C, DESOBRY B S, et al. Structure and techno-functional properties of protein-polysaccharide complexes: a review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1998, 38(8): 689-753. DOI:10.1080/10408699891274354.

[14] MUZZARELLI R A A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 77(1): 1-9. DOI:10.1016/j.carbpol.2009.01.016.

[15] MI F L, SHYU S S, PENG C K. Characterization of ring-opening polymerization of genipin and pH-dependent crosslinking reactions between chitosan and genipin[J]. Polymer Science. Part A: Polymer Chemistry, 2005, 43(10): 1985-2000. DOI:10.1002/pola.20669.

[16] BUTLER M F, NG Y F, PUDNEY P D A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin[J]. Polymer Science. Part A: Polymer Chemistry, 2003, 41(24): 3941-3953. DOI:10.1002/pola.10960.

[17] 郭晨煜. 槲皮素納米脂質(zhì)載體制劑及其經(jīng)皮給藥的研究[D]. 青島:山東大學(xué), 2011. DOI:10.7666/d.y1936021.

[18] 衛(wèi)生部. 食品中水分的測(cè)定: GB 5009.3—2010[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[19] 輕工業(yè)部日用化學(xué)工業(yè)科學(xué)研究所. 表面活性劑: 粉體和顆粒休止角的測(cè)定: GB 11986—1989[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1989.

[20] 于永新, 俞紅凱, 王中彥. 聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯應(yīng)用進(jìn)展[J].沈陽(yáng)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 23(6): 407-412. DOI:10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2006.06.018.

[21] HUANG Y Y, CHUNG T W, TZENG T W. Drug release from PLA/ PEG microparticulates[J]. International Journal of Pharmaceutics, 1977, 156: 9-15. DOI:10.1016/S0378-5173(97)00154-3.

[22] 曾治平. 葉黃素的微膠囊制備及其穩(wěn)定性的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2010.

[23] 吳春, 孔琪, 李健, 等. 槲皮素微膠囊的穩(wěn)定性及緩釋性能研究[J]. 化學(xué)與黏合, 2006(1): 11-13. DOI:10.3969/ j.issn.1001-0017.2006.01.004.

[24] PENG Chao, ZHAO Suqing, ZHANG Jun, et al. Chemical composition, antimicrobial property and microencapsulation of Mustard (Sinapis alba) seed essential oil by complex coacervation[J]. Food Chemistry, 2014, 165: 560-568. DOI:10.1016/ j.foodchem.2014.05.126.

[25] 呂怡. 復(fù)合凝聚反應(yīng)制備茉莉香精微/納米膠囊及其機(jī)理研究[D].無(wú)錫: 江南大學(xué), 2012.

Response Surface Optimization of Preparation of Microencapsulated Quercetin Using Complex Coacervation and Its Physicochemical Properties

LIAO Xia1, YANG Xiaolan1, LI Yao1, WANG Liying1, MING Jian1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Quercetin microcapsules were prepared by complex coacervation using sodium alginate and chitosan as the wall materials and quercetin as the core material. Single factor experiments and response surface methodology were employed to optimize the preparation conditions based on embedding rate and drug loading. The physicochemical properties of quercetin microcapsules were investigated as well. Under the optimized conditions: sodium alginate/chitosan ratio, 3.34:1; core/wall material ratio, 4.34:1; genipin concentration, 18.44 g/100 g chitosan; and curing temperature, 41.56 ℃, the embedding rate could reach 69.53%. The moisture content, repose angle and solubility of the quercetin microcapsules was 3.26%, 40.39° and 256.44 μg/mL, respectively. The encapsulated quercetin had good solubility and stability.

quercetin; complex coacervation; microencapsulation; physicochemical properties

10.7506/spkx1002-6630-201622004

R151.2

A

1002-6630（2016）22-0020-08

廖霞, 楊小蘭, 李瑤, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)凝聚法制備槲皮素微膠囊工藝及其理化性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 20-27. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622004. http://www.spkx.net.cn

LIAO Xia, YANG Xiaolan, LI Yao, et al. Response surface optimization of preparation of microencapsulated quercetin using complex coacervation and its physicochemical properties[J]. Food Science, 2016, 37(22): 20-27. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622004. http://www.spkx.net.cn

2016-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471576）；重慶市社會(huì)民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2015shmszx80019）

廖霞（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：994671521@qq.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：mingjian1972@163.com