李小冬，蔡璐，張瑜，王茜，莫本田，韓永芬，王小利

(貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

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AtmiR156a調(diào)控菊苣營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與品質(zhì)

李小冬，蔡璐，張瑜，王茜，莫本田，韓永芬，王小利*

(貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

菊苣是南方草地生態(tài)畜牧業(yè)發(fā)展的重要牧草資源，其產(chǎn)量與植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段長(zhǎng)短密切相關(guān)。本研究采用轉(zhuǎn)基因的方法將擬南芥AtmiR156a在菊苣中過(guò)量表達(dá)，獲得了140株轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)94.3%。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因菊苣中AtmiR156a表達(dá)量上調(diào)7.9倍。AtmiR156a過(guò)量表達(dá)菊苣與野生型菊苣的發(fā)芽率基本相當(dāng)，但其葉片發(fā)生速率顯著比野生型快，抽薹時(shí)間比野生型推遲20.2 d，開(kāi)花推遲27.3 d，但是株高比野生型要矮，年均產(chǎn)草量與野生型基本相當(dāng)。分析第一茬草的品質(zhì)性狀發(fā)現(xiàn)AtmiR156a過(guò)量表達(dá)菊苣葉片中粗蛋白含量比野生型高3.7%，纖維素降低2%，其他品質(zhì)性狀在兩個(gè)材料中沒(méi)有顯著差異。本研究不僅建立了高效的菊苣遺傳轉(zhuǎn)化體系，培育出晚花、速生的菊苣新種質(zhì)資源，為培育高產(chǎn)耐刈菊苣新品種奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為開(kāi)展借助其他農(nóng)作物重要功能基因進(jìn)行菊苣遺傳改良的研究工作提供借鑒，具有重要的理論研究與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

菊苣；AtmiR156a；營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)；牧草品質(zhì)

菊苣(Cichoriumintybus)是菊科多年生宿根植物，因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同時(shí)具有良好的醫(yī)藥價(jià)值，被廣泛用做食物、飼料以及中藥材原料。作為青鮮牧草，其綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、無(wú)氮浸出物和粗灰分含量等指標(biāo)都優(yōu)于“牧草之王”紫花苜蓿(Medicagosativa)[1]。此外，牧草菊苣適口性好，消化率高，利用年限長(zhǎng)，并且適應(yīng)性廣，產(chǎn)草量高，可用于建設(shè)高產(chǎn)人工割草場(chǎng)和放牧場(chǎng)[2]。然而栽培管理中，刈割時(shí)間對(duì)其影響很大，過(guò)早牧草產(chǎn)量太低，過(guò)晚影響牧草品質(zhì)，同時(shí)還容易發(fā)生根腐病。因此，開(kāi)發(fā)和利用高產(chǎn)耐刈菊苣新種質(zhì)，對(duì)彌補(bǔ)貴州人工草地高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草不足具有建設(shè)性意義。植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短決定著牧草生物產(chǎn)量和品質(zhì)，而開(kāi)花是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)最明顯的形態(tài)標(biāo)記之一，因此人們對(duì)于植物開(kāi)花的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，并發(fā)現(xiàn)開(kāi)花是由光周期、春化、赤霉素和自主途徑4條主要的信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn)小RNAmiR156對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與作物品質(zhì)都起著十分重要的調(diào)控作用。

miR156是植物界中一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能高度保守的小RNA，過(guò)量表達(dá)miR156的擬南芥(Arabidopsisthaliana)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期顯著延長(zhǎng)，生物產(chǎn)量顯著增加；而通過(guò)靶基因模擬方法轉(zhuǎn)化mimicry156植株?duì)I養(yǎng)期明顯縮短，開(kāi)花提前[3]。玉米(Zeamays)顯性突變體Corngrass(Cg)的葉片細(xì)長(zhǎng)、分蘗增加且營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，最近研究發(fā)現(xiàn)Cg是由于miR156b和miR156c上調(diào)表達(dá)造成[4]。類似的表現(xiàn)型在miR156過(guò)量表達(dá)的水稻(Oryzasativa)植株中也能夠觀察到，miR156上調(diào)表達(dá)的水稻植株分蘗增加，植株矮化，開(kāi)花推遲，生物產(chǎn)量大大增加[5]。這些突變體的幼年期延長(zhǎng)，能夠產(chǎn)生更多的幼嫩葉片，部分花器官發(fā)育成葉片。綜上所述，在不同植物中，miR156的上調(diào)表達(dá)能夠不同程度地延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的時(shí)間，促進(jìn)植物生物產(chǎn)量的提高，并且其生物學(xué)功能在單子葉與雙子葉植物中高度保守。

miR156不僅可以影響植物的生物產(chǎn)量，對(duì)作物的抗逆性和生物學(xué)品質(zhì)都有影響。在小麥(Triticumaestivum)及大白菜(Brassicarapa)中，高溫脅迫導(dǎo)致miR156表達(dá)上調(diào)[6-7]。除受溫度影響外，磷脅迫也調(diào)節(jié)miR156的表達(dá)。在缺磷時(shí)，擬南芥中miR156上調(diào)表達(dá)[8]。在作物品質(zhì)改良方面，在油菜(Brassicanapus)中過(guò)量表達(dá)miR156能使油菜種子積累大量胡蘿卜素及葉黃素，而轉(zhuǎn)基因油菜的種子產(chǎn)量及質(zhì)量則不受影響[9]。在能源模式植物柳枝稷(Panicumvirgatum)中過(guò)量表達(dá)miR156，轉(zhuǎn)基因材料的生物產(chǎn)量、可溶性糖含量、淀粉含量以及可消化程度都顯著提高[10-11]，為生物燃料的生產(chǎn)提供了重要的種質(zhì)材料。同樣，在玉米突變體Corngrass中，由于miR156過(guò)量表達(dá)，突變體葉子中的纖維素、半纖維素含量顯著低于對(duì)照[12]。因此在牧草中通過(guò)過(guò)量表達(dá)miR156具有同時(shí)改良作物的產(chǎn)量與品質(zhì)的潛力。

菊苣的遺傳轉(zhuǎn)化體系自20世紀(jì)90年代開(kāi)始就已經(jīng)開(kāi)展研究，并已經(jīng)建立了多種植株再生體系與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)[13-14]，成功培育出一些耐鹽[15-16]、抗旱[17]及抗凍害等種質(zhì)資源。然而通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)菊苣產(chǎn)量和耐刈割等性狀改良還沒(méi)有報(bào)道。通過(guò)對(duì)本項(xiàng)目的研究不僅能夠滿足貴州高效畜牧業(yè)園區(qū)對(duì)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草的需求，同時(shí)晚花耐刈型新種質(zhì)資源也是中藥材的候選材料，具有較大經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的植物材料為黔引普那菊苣(2006年貴州省草業(yè)研究所育成)，植株生長(zhǎng)條件參考Li等[18]的方法，具體為光照16 h，黑暗8 h，生長(zhǎng)溫度22 ℃，光照強(qiáng)度為230～300 μE/(m2·s)。RNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1AtmiR156a的克隆及過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo)從擬南芥基因組DNA中克隆出AtmiR156a全長(zhǎng)DNA片段，引物組合為lxdp 020:(ctaggatccATTCTCATCGTTTCTTGTTTTC, BamHⅠ接頭)與lxdp 021:(ctagagctcAAGCCAGAGTTTAGATCGTATC,SacⅠ接頭)，PCR反應(yīng)混合物：5×Phusion buffer，4 μL；10 mmol/L dNTP，0.5 μL；25 mmol/L MgCl2，1.5 μL；10 mmol/L lxdp020，1 μL；10 mmol/L lxdp021，1 μL；DNA，2 μL；Phusion DNA聚合酶，0.2 μL；dd H2O，10 μL。反應(yīng)程序：98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。通過(guò)測(cè)序分析后，用BamHⅠ與SacⅠ酶切連接到pBI121過(guò)量表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌菌株中備用。

1.2.2 菊苣遺傳轉(zhuǎn)化 采用組培方法實(shí)現(xiàn)對(duì)菊苣轉(zhuǎn)化，將暗光培養(yǎng)子葉在活化的農(nóng)桿菌中浸染10 min，每5 min輕輕搖晃培養(yǎng)皿一次，將侵染后的外植體轉(zhuǎn)到M1培養(yǎng)基中[1/2 MS+10 g/L蔗糖+0.01 mg/L 噻苯隆(TDZ)+1 mg/L 生長(zhǎng)素(IAA)]，置于人工氣候室中共培養(yǎng)2 d。用含有100 mg/mL頭孢霉素的無(wú)菌水清洗共培養(yǎng)的外植體2～3次，然后將外植體轉(zhuǎn)移到M2[MS+10 g/L蔗糖+2 mg/L 芐氨基喋呤(6-BA)+1 mg/L 生長(zhǎng)素(IAA)+50 mg/L 卡那霉素(Km)]培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長(zhǎng)出綠色愈傷。將綠色愈傷轉(zhuǎn)到M3[MS+10 g/L蔗糖+1 mg/L 芐氨基喋呤(6-BA)+1 mg/L 生長(zhǎng)素(IAA)+50 mg/L卡那霉素(Km)]培養(yǎng)基中，每星期繼代一次，直至綠芽長(zhǎng)至2～5 cm。將再生植株從愈傷組織上切下，插入到M4[MS+10 g/L蔗糖+1 mg/L 萘乙酸(NAA)+50 mg/L卡那霉素(Km)]培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)15～20 d，直到根系發(fā)育完成。將無(wú)菌苗移栽到泥炭土∶蛭石=1∶1的基質(zhì)中，置于人工氣候室培養(yǎng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因菊苣鑒定 采用天根DNA提取試劑盒(DP305-2)提取轉(zhuǎn)化植株的DNA，采用PCR擴(kuò)增載體上NPT抗性基因的方法檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，引物組合：NPTF (5′-GTGCCCTGAATGAACTGC-3′)與NPTR (5′-CAATATCACGGGTAGCCA-3′)，PCR反應(yīng)混合物：2×Taq PCR Mixture(上海生工)，10 μL； NPTF(10 mmol/L)，1 μL； NPTR(10 mmol/L)，2 μL；dd H2O，6 μL；DNA，1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因菊苣熒光定量分析AtmiR156a的表達(dá)分析參考[19]。利用Trizol提取轉(zhuǎn)基因以及對(duì)照菊苣的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACGTGCTC，采用PCR方法檢測(cè)AtmiR156a的表達(dá)變化，引物組合：上游引物(5′-GCGGCGGTGACAGAAGAGAGT-3′)與下游引物(5′-GUGCUCACUCUCUUCUGUCA-3′)，熒光定量反應(yīng)混合物：10×Buffer，2 μL；10 mmol/L dNTP，0.4 μL；50 mmol/L MgCl2，1 μL；上游引物 (10 mmol/L)，0.5 μL； 下游引物(10 mmol/L)，0.5 μL；20×核酸染料(Eva green)，1.0 μL；高保真DNA聚合酶(Platinum Taq)，0.1 μL；H2O，11.5 μL；模板，3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，讀取熒光信號(hào)，45個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因菊苣性狀調(diào)查 葉片發(fā)生速率：在人工氣候室中，盆栽野生型和轉(zhuǎn)基因菊苣(T2代，轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)為菊苣At156-15)各30株，發(fā)芽后每7 d統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)，以肉眼可見(jiàn)的葉片統(tǒng)計(jì)為1片葉。發(fā)芽率調(diào)查：取2015年同年收獲的野生型以及轉(zhuǎn)基因菊苣(T2代，轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)菊苣At156-15)飽滿種子，在10 cm的培養(yǎng)皿中加4層滅菌濾紙，用無(wú)菌水浸透，倒出多余水分，每個(gè)培養(yǎng)皿播種30顆種子，每個(gè)材料重復(fù)4次，每3 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。抽薹期、花期、株高與產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)的為T1代植株，平行種植野生型和轉(zhuǎn)基因菊苣各20個(gè)單株(T1代)，野生型為2013年組織培養(yǎng)獲得，轉(zhuǎn)基因材料為同年轉(zhuǎn)化檢測(cè)后陽(yáng)性植株。將檢測(cè)后的轉(zhuǎn)基因以及組培的材料野生型菊苣移栽大田，間距為50 cm×50 cm，種植于2013年10月，調(diào)查統(tǒng)計(jì)于2014年，調(diào)查抽薹期、花期轉(zhuǎn)基因編號(hào)為菊苣At156-1～20，以肉眼可見(jiàn)的莖節(jié)定義為抽薹，以第一朵花開(kāi)放定義為開(kāi)花。調(diào)查株高與產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)為菊苣At156-21～40，株高：測(cè)量刈割前兩組材料從地面到植株頂端高度。產(chǎn)量：當(dāng)植物生長(zhǎng)到40～60 cm時(shí)(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期)開(kāi)始刈割測(cè)產(chǎn)，刈割4次，將各茬草產(chǎn)量相加，再折合成每m2的產(chǎn)草量。

1.2.6 品質(zhì)分析 取營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的第一茬菊苣葉片(T1代植物)分析牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，測(cè)定牧草粗纖維、粗蛋白、粗脂肪以及灰分等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分的含量。測(cè)定方法按照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，其中粗蛋白參照GB/5915-2008，粗脂肪參照GB/T6433-2006，粗纖維參照GB/T 6434-2006，粗灰分參照GB/T 6438-2007進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定6個(gè)獨(dú)立植株。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，熒光定量、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)以及物候期性狀差異顯著性分析采用t測(cè)驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為是差異顯著，作圖采用Excel 與PowerPoint。

2 結(jié)果與分析

2.1AtmiR156a的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 AtmiR156a的克隆與載體構(gòu)建Fig.1 Cloning of AtmiR156a and constructing of pBI121-AtmiR156a vector酶切回收AtmiR156a(A)與pBI121(B)，并連接成pBI121-AtmiR156a過(guò)量表達(dá)載體(C)。 Gel-recycle of AtmiR156a (A) and pBI121 (B), then ligate into pBI121-AtmiR156a overexpression vector (C).

以野生型擬南芥基因組DNA為模板，采用Phusion DNA聚合酶擴(kuò)增包含整個(gè)成熟AtmiR156a片段(約1000 bp)的基因組序列，并進(jìn)行測(cè)序分析得到正確的序列。分別利用BamHⅠ與SacⅠ酶切pMD19-AtmiR156a與pBI121空載體，并回收對(duì)應(yīng)目的片段(圖1A，B)，利用T4連接酶連接線性化載體和目的基因完成載體構(gòu)建(圖1C)。

2.2AtmiR156a轉(zhuǎn)化菊苣獲得與鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)法將AtmiR156a轉(zhuǎn)入黔引普那菊苣。在愈傷誘導(dǎo)階段加入50 mg/L卡那霉素進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)15～20 d的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞能形成綠色愈傷(圖2A)，將分生旺盛的愈傷轉(zhuǎn)移到含有50 mg/L Km分化培養(yǎng)基培養(yǎng)25～30 d(圖2B)，將3～5 cm的再生芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d(圖2C)，將轉(zhuǎn)基因苗轉(zhuǎn)移到泥炭土培養(yǎng)基質(zhì)煉苗(圖2D)，并通過(guò)PCR擴(kuò)增抗性基因檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得了140個(gè)再生植株，132個(gè)能夠擴(kuò)出NPT條帶，陽(yáng)性率達(dá)94.3%(圖2E)，采用35S與AtmiR156下游引物隨機(jī)檢測(cè)22個(gè)單株都是陽(yáng)性(圖2F)。

圖2 AtmiR156a轉(zhuǎn)化菊苣及其抗性檢測(cè)與表達(dá)分析檢測(cè)Fig.2 The processes and detections of AtmiR156a transgenic chicory A：外植體培養(yǎng)愈傷；B：愈傷分化成苗；C：生根培養(yǎng)；D：煉苗移栽；E：轉(zhuǎn)基因苗抗性分子(NPT引物)檢測(cè)示意圖，其中M為DNA maker，1～20為樣品，21為陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因菊苣)，22為陽(yáng)性對(duì)照(pBI121質(zhì)粒)；F：轉(zhuǎn)基因苗抗性分子(基因特異引物)檢測(cè)示意圖，其中M為DNA maker，1～22為樣品，23為陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因菊苣)，24為陽(yáng)性對(duì)照(pBI121質(zhì)粒)；G：轉(zhuǎn)基因菊苣miR156a熒光表達(dá)分析，1是野生型菊苣，2是AtmiR156轉(zhuǎn)基因菊苣，用actin基因做內(nèi)參, 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，*表示差異在P<0.05達(dá)顯著水平。A: Induction of callus from cotyledon explants. B: Regeneration seedlings inducted from calluses. C: Rooting of the regeneration transgenic seedlings. D: Acclimatization and transplantation. E: Representative pictures of molecular detection of transgenic plants based on PCR analysis with NPT primiers, M stands for DNA maker, 1-20 were plants samples, 21 was the negative control (non-transgenic plants), 22 was the positive control (plasmid). F: Representative pictures of molecular detection of transgenic plants based on PCR analysis with gene specific primiers, M stands for DNA maker, 1-22 were plants samples, 23 was the negative control (non-transgenic plants), 24 was the positive control (plasmid). G: qRT-PCR analysis of transgenic plants, 1 was the wild chicory, 2 was the AtmiR156 transgenic chicory plants, actin was used as internal control, n=3. *stands for a significant difference at P<0.05 level.

2.3 轉(zhuǎn)AtmiR156a菊苣基因表達(dá)分析

采用熒光定量PCR的方法分析陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因菊苣與野生型菊苣中AtmiR156a的表達(dá)變化。在野生型菊苣中只檢測(cè)到微量AtmiR156a的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因菊苣中，miR156a表達(dá)量顯著升高7.9倍(圖2G)，說(shuō)明轉(zhuǎn)化的AtmiR156a能夠在菊苣中正常表達(dá)行使功能。

2.4 轉(zhuǎn)AtmiR156a菊苣品質(zhì)性狀分析

平行比較轉(zhuǎn)基因菊苣與對(duì)照普那菊苣營(yíng)養(yǎng)組分的變化，以第一茬草的葉片組織為樣品，其粗蛋白含量達(dá)23.5%，比普那菊苣高3.7%；纖維素含量為12.3%，比普那菊苣低2%；與對(duì)照相比，粗脂肪、無(wú)氮浸出物、粗灰分、鈣以及磷等含量都與野生菊苣沒(méi)有顯著差異(表1)。

表1 AtmiR156a轉(zhuǎn)基因菊苣品質(zhì)分析

n=6，*表示差異在P<0.05達(dá)顯著水平。 *stands for a significant difference atP<0.05 level.

2.5 轉(zhuǎn)AtmiR156a菊苣農(nóng)藝性狀調(diào)查

通過(guò)盆栽試驗(yàn)比較轉(zhuǎn)AtmiR156a菊苣與野生型菊苣發(fā)芽速率以及早期葉片發(fā)生速率。在人工氣候條件下，轉(zhuǎn)基因菊苣的發(fā)芽速率與野生菊苣相當(dāng)，在第3～4天開(kāi)始發(fā)芽，第7～8天發(fā)芽速度最快，10～12 d轉(zhuǎn)基因和野生型材料基本全部發(fā)芽，但野生型與轉(zhuǎn)基因材料差異不顯著(圖3A)。在早期葉片發(fā)生速率調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)的前期(28 d之前)兩者沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，從28 d開(kāi)始轉(zhuǎn)基因菊苣葉片發(fā)生速率顯著快于野生型(圖3B，P<0.05)。對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)渡期間的性狀也進(jìn)行了考察，轉(zhuǎn)基因菊苣的平均抽薹時(shí)間為223.1 d，比對(duì)照(202.9 d)要晚20.2 d(P<0.05)，開(kāi)花時(shí)間為251.9 d，比對(duì)照(224.6 d)要晚27.3 d(圖3C，P<0.05)。但相同的生長(zhǎng)時(shí)間，轉(zhuǎn)基因菊苣的株高相對(duì)于野生型有變矮的趨勢(shì)，但差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平(圖3D)，2014年總共刈割4次測(cè)產(chǎn)，每次及年總產(chǎn)草量與對(duì)照沒(méi)有顯著差異(P>0.05，圖3E)。

圖3 AtmiR156a轉(zhuǎn)基因菊苣表型性狀調(diào)查Fig.3 Phenotypic observations of AtmiR156a transgenic chicory A, B, n=30;C, D, E, n=20.*表示差異在P<0.05達(dá)顯著水平。*stands for a significant difference at P<0.05 level.

3 討論

牧草是以營(yíng)養(yǎng)器官為主要收獲目標(biāo)的作物，通過(guò)改變植物的形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間能顯著提高植物生物產(chǎn)量[20]，類似的研究在能源草柳枝稷中已經(jīng)報(bào)道[11]。前人通過(guò)突變體以及過(guò)量表達(dá)等研究成功鑒定了許多控制植物形態(tài)建成和開(kāi)花的關(guān)鍵基因，其中，SPL (squamosa promoter binding like)家族基因參與調(diào)控植物頂端優(yōu)勢(shì)建成與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變；但是SPL在植物基因組中存在多個(gè)同源基因，通過(guò)RNAi干涉或者突變很難獲得理想效果[21]。SPL基因受miR156的調(diào)控，通過(guò)上調(diào)miR156的表達(dá)能夠整體上調(diào)節(jié)SPL家族基因的表達(dá)變化，最終調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與形態(tài)建成[22-23]。在本研究中，通過(guò)在菊苣中過(guò)量表達(dá)擬南芥的AtmiR156a基因，同樣能夠推遲抽薹、開(kāi)花時(shí)間，說(shuō)明在菊苣和擬南芥中，miR156a的結(jié)構(gòu)和功能具有很強(qiáng)的保守性，但是由于菊苣基因組序列信息的限制，沒(méi)能夠進(jìn)一步分析菊苣SPL家族基因的表達(dá)變化。

在擬南芥、水稻以及玉米中都報(bào)道m(xù)iR156過(guò)量表達(dá)會(huì)造成植株矮化等生長(zhǎng)發(fā)育異常表型[4-5]，對(duì)于收獲籽實(shí)為目標(biāo)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，很難被直接利用。然而，在過(guò)量表達(dá)miR156的柳枝稷中，植物的形態(tài)建成與生物產(chǎn)量與miR156過(guò)量表達(dá)的程度有關(guān)：在一定范圍內(nèi)(1.6～6.4倍)，miR156的表達(dá)量與植株生物產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，但表達(dá)量過(guò)高會(huì)造成植株矮化導(dǎo)致生物產(chǎn)量下降[11]。在本研究中，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育正常的單株進(jìn)行表型與表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)AtmiR156a的表達(dá)上調(diào)了7.9倍，葉片發(fā)生速率加快，但植株高度下降，產(chǎn)草量與野生型菊苣基本相當(dāng)。該結(jié)果與前人在水稻、玉米以及柳枝稷中的報(bào)道都有不同，造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)化使用的基因?yàn)閿M南芥來(lái)源AtmiR156a，該基因在菊科以及十字花科中功能存在保守性的同時(shí)也發(fā)生了分化；還有可能是因?yàn)橛糜诜治龅霓D(zhuǎn)基因植株為T1代轉(zhuǎn)基因植物，在T-DNA插入位點(diǎn)還沒(méi)有純合，具體原因還有待于后續(xù)研究。

菊苣在南方草畜業(yè)中主要利用方式為青飼，作為一種優(yōu)質(zhì)牧草，其本身蛋白含量較高，纖維素含量較低。過(guò)量表達(dá)AtmiR156a的菊苣葉片發(fā)生速率加快，植株矮化，在一定程度上增加了幼葉比例，提高了營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。在實(shí)際測(cè)定中，確實(shí)發(fā)現(xiàn)AtmiR156a過(guò)量表達(dá)的菊苣中蛋白質(zhì)含量提高了3.7%，纖維素含量降低了2%，然而，這種變化幅度并沒(méi)有預(yù)期的明顯，可能與選用的作物本身為優(yōu)質(zhì)牧草有關(guān)，其本身的蛋白含量較高，而纖維含量較低，整體效果沒(méi)有禾本科作物明顯，因?yàn)樵贔u等[11]的研究中，大部分轉(zhuǎn)基因柳枝稷中的碳水化合物被糖解酶降解的效率大大提高。

4 小結(jié)與展望

通過(guò)過(guò)量表達(dá)AtmiR156a能夠顯著推遲植株抽薹、開(kāi)花時(shí)間，提高植物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，更加精準(zhǔn)的定向遺傳改良及其調(diào)控機(jī)制研究還有待于菊苣基因組(轉(zhuǎn)錄組)數(shù)據(jù)的發(fā)掘與高世代純合遺傳轉(zhuǎn)化株系的獲得。

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AtmiR156aregulates the vegetative growth and forage quality of chicory (Cichoriumintybus)

LI Xiao-Dong, CAI Lu, ZHANG Yu, WANG Qian, MO Ben-Tian, HAN Yong-Fen, WANG Xiao-Li*

GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China

Chicory is an important forage plant for animal husbandry in south China. The yield of chicory is closely related to the length of the plants’ vegetative growth phase. In this study,ArabidopsisAtmiR156awas over-expressed in chicory and a total of 140 independent lines of transgenic plants were obtained. PCR analysis detected 94.3% positive expression in these plants. q-PCR analysis showed that, compared with the wild-type chicory used as control, the expression ofAtmiR156awas promoted by 7.9 times in the transgenic plants. Germination rates for theAtmiR156aover-expressed lines were similar to that of the control, but the leaf emergence rate was significantly faster. Bolting time and flowering time were delayed by 20.2 and 27.3 days respectively in theAtmiR156aover-expressed lines. However, plant height was reduced, which led to similar annual forage yields for both the wild type and transgenic plants. Forage quality was analyzed via a first cutting of leaves. The results showed that crude protein content was 3.7% higher and fiber content was 2% lower in theAtmiR156aover-expressed lines; other quality traits showed no significant differences from the control seedlings. Our results establish an efficient method for the genetic transformation of chicory. The experiment also created a pool of late-flowering and fast-growing germplasm resources, laying a foundation for the breeding of high-yield and cutting-resistant chicory varieties. The results provide a reference for theoretical studies and practical applications aiming to improve chicory performance through the use of genes from other crops.

chicory;AtmiR156; vegetative growth; forage quality

10.11686/cyxb2016128

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-23；改回日期：2016-05-10

貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目“利用AtmiR156a培育高產(chǎn)耐刈菊苣種質(zhì)新材料”(黔科合J字LKN[2013]04號(hào))，貴州主要優(yōu)良牧草種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用研究農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)(黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)字[2014]010號(hào))和貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士啟動(dòng)基金“四倍體菊苣種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用研究”(黔農(nóng)科院人才啟動(dòng)項(xiàng)目[2013]01)資助。

李小冬(1984-)，男，湖南邵陽(yáng)人，副研究員，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: wangxiaolizhenyuan@126.com

李小冬, 蔡璐, 張瑜, 王茜, 莫本田, 韓永芬, 王小利.AtmiR156a調(diào)控菊苣營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與品質(zhì). 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(11): 160-166.

LI Xiao-Dong, CAI Lu, ZHANG Yu, WANG Qian, MO Ben-Tian, HAN Yong-Fen, WANG Xiao-Li.AtmiR156aregulates the vegetative growth and forage quality of chicory (Cichoriumintybus). Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 160-166.