胡海英，張芮，段艷慧，謝應(yīng)忠*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

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烏拉爾甘草離體再生與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究

胡海英1，張芮2，段艷慧2，謝應(yīng)忠1*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

研究烏拉爾甘草離體再生受體系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)方法，為甘草基因工程育種提供前期實驗基礎(chǔ)。以烏拉爾甘草莖段為外植體，試驗篩選最適不定芽分化培養(yǎng)基和增殖壯苗培養(yǎng)基; 以烏拉爾甘草莖段為受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對烏拉爾甘草進行GUS和GFP基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究。結(jié)果表明，以烏拉爾甘草去腋芽莖段為外植體，其不定芽最適分化和增殖培養(yǎng)基配方為MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA，不定芽分化率達38.8%，增殖倍數(shù)3.67，適宜的壯苗培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。與去腋芽莖段相比，帶腋芽莖段的不定芽分化率達100%，能夠在含抗生素的選擇培養(yǎng)基MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA+50 mg/L Kan+250 mg/L Car上存活，確定為最適轉(zhuǎn)化受體；帶腋芽莖段在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7 d后，經(jīng)OD600=0.6的菌液侵染10 min，共培養(yǎng)3 d，在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，其不定芽分化率為43.75%，經(jīng)GFP熒光檢測可得到78.88%的GFP基因瞬時表達率；隨機選取5株再生轉(zhuǎn)化植株，經(jīng)PCR檢測，均有GFP和GUS基因的目的條帶，GFP基因表達較強烈，初步獲得了5個株系的陽性轉(zhuǎn)化植株。

烏拉爾甘草；莖段；不定芽分化；遺傳轉(zhuǎn)化；綠色熒光蛋白

烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)屬于豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生草本植物，也是荒漠半荒漠地區(qū)重要的防風(fēng)固沙植物和大宗道地藥材[1]；此外，還廣泛用于食品、飲料、卷煙業(yè)和化妝品工業(yè)[2-4]，具備生態(tài)和經(jīng)濟的雙重價值。在寧夏境內(nèi)主要分布在鹽池縣、同心縣、靈武市等干旱、半干旱風(fēng)沙區(qū)。近年來，隨著對甘草需求量的增大，野生甘草資源日漸減少，市場上主要以人工栽培甘草為主來取代野生甘草，但現(xiàn)有甘草品種在長期栽培過程中只種不選，感染病毒、品種混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量下降，這些問題制約著寧夏甘草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，運用基因工程開展甘草遺傳轉(zhuǎn)化、性狀改良和優(yōu)良品種選育研究是當(dāng)前保證高質(zhì)量甘草藥材生產(chǎn)亟待解決的關(guān)鍵理論和技術(shù)問題[5-6]。目前，利用Ti質(zhì)粒將目標(biāo)基因成功轉(zhuǎn)化甘草的研究報道較少，均存在甘草再生率低，再生系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化條件不穩(wěn)定等制約問題[5-9]，多集中在應(yīng)用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化藥用植物建立的毛狀根培養(yǎng)體系研究方面[5-7]。資料顯示，以甘草子葉節(jié)、側(cè)芽莖段為外植體，可得到較高的不定芽分化率[10-11]；以甘草下胚軸、子葉為外植體，不定芽分化較為困難[12]。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是來源于發(fā)光生物水母(Aequoreavitoria)體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白，能夠自身催化形成生色團并在藍光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，能在活細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達，GFP基因作為新型的報告基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究中得到了廣泛應(yīng)用[13-14]。為研究GFP在甘草中的表達，進一步優(yōu)化甘草離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)方法，研究了甘草莖段離體再生和增殖壯苗技術(shù)方法，并應(yīng)用于以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GFP基因的遺傳轉(zhuǎn)化，篩選出了最適轉(zhuǎn)化條件，得到了經(jīng)PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化植株，為甘草基因工程育種提供前期實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為烏拉爾甘草種子，由寧夏鹽池沙標(biāo)子甘草種植基地提供。農(nóng)桿菌菌株為EHA105，攜帶GUS/GFP基因的農(nóng)桿菌雙核質(zhì)粒pKAFCR21表達載體由寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳任教授提供。培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，其中瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8，添加植物激素有6-芐基氨基嘌呤(6-benzyladenine, 6-BA)、噻苯隆(thidiaxuron, TDZ)、α-萘乙酸(α-naphthalene acetic acid, NAA)和吲哚乙酸(indole-3butyric acid, IBA)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)，選擇培養(yǎng)基添加卡那霉素(kanamycin, Kan)和羧卞青霉素(carbenicillin, Car)。消毒液選用上海宇涵生物科技公司生產(chǎn)的新一代無毒級殺菌消毒劑愛立克。RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。

2014年5月開始烏拉爾甘草種子的無菌培養(yǎng)試驗，烏拉爾甘草種子經(jīng)75%酒精(無菌水配制)浸泡40 s，消毒液浸泡20 min去菌后無菌播種，獲得甘草無菌實生苗。

1.2 烏拉爾甘草去腋芽莖段不定芽分化、增殖及壯苗培養(yǎng)基的篩選

經(jīng)無菌播種獲得的甘草試管苗切成1.0 cm長去腋芽莖段，接種到含有不同濃度的6-BA、TDZ、IBA正交設(shè)計[L9(33)]的培養(yǎng)基中(表1)，30 d后統(tǒng)計不定芽的分化情況。得到的再生不定芽進行增殖培養(yǎng)后，在5種培養(yǎng)基配方中篩選適宜的壯苗培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分別為MS+0.5 mg/L IBA；1/2 MS；1/2 MS+0.5 mg/L IBA； 1/2 MS+0.5 mg/L NAA；MS+0.5 mg/L NAA。培養(yǎng)條件：光照16 h/d，光強:2000 lx，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃。每個培養(yǎng)基處理重復(fù)3次。

1.3 烏拉爾甘草遺傳轉(zhuǎn)化條件的篩選

1.3.1 最適轉(zhuǎn)化條件的試驗篩選 無菌條件下，將無菌苗莖段切成0.5～1.0 cm長，平放于篩選出的分化培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)時間7 d。培養(yǎng)條件：黑暗培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃。

將準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)物于6000 r/min離心5 min，棄去上清液，用液體培養(yǎng)基懸浮，使其OD值分別為OD600=0.4，0.6，0.8，1.0。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的材料分別投入4種不同濃度的菌液中進行侵染，每個濃度的菌液分別設(shè)4個侵染的時間梯度，分別為5，10，15，20 min，將外植體取出后，用無菌的濾紙吸去多余的菌液，然后將外植體放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基(篩選出的分化培養(yǎng)基添加20 mg/L AS)中進行共培養(yǎng)3 d，以未感染的莖段作對照，培養(yǎng)條件：黑暗培養(yǎng)，溫度(25±1) ℃。然后轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基(篩選出的分化培養(yǎng)基添加50 mg/L Kan和250 mg/L Car)進行選拔培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：每天光照16 h, 光照強度2000 lx，溫度(25±1) ℃。每個處理重復(fù)3次。

1.3.2GFP表達熒光檢測 選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后，利用徠卡熒光顯微鏡DM2500檢測轉(zhuǎn)化外植體和再生不定芽GFP基因的瞬時表達。

1.3.3 轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR檢測 獲得的烏拉爾甘草轉(zhuǎn)化苗在篩選出的壯苗培養(yǎng)基(添加50 mg/L Kan+250 mg/L Car)培養(yǎng)4周后，隨機提取5株再生植株進行PCR檢測。將待檢測植株和對照植株的葉片用CTAB(十六烷基三甲基溴化胺，cetyltrimethyl ammonium bromide)法[15]提取總DNA，因農(nóng)桿菌雙核質(zhì)粒pKAFCR21表達載體攜帶GFP和GUS基因，分別設(shè)計引物，sGFP-F：5′-AGCTGGACGGCGACGTAAA-3′，sGFP-R：5′-CAGGACCATGTGATCGCGCTT-3′，GUS-F：5′-TTTAACTATGCCGGGATCCATCGC-3′，GUS-R：5′-CCAGTCGAGCATCTCTTCAGCGTA-3′，對獲得的轉(zhuǎn)化植株中GFP和GUS基因的表達分別進行PCR檢測。預(yù)期片段大小為610 bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min, 95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、74 ℃ 2 min，30個循環(huán)，74 ℃延伸7 min，4 ℃反應(yīng)結(jié)束。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

不定芽分化率(%)=(產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)量/接種的外植體數(shù)量)×100

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=(形成愈傷組織的外植體數(shù)量/接種的外植體數(shù)量)×100

GFP基因瞬時表達率(%)=(檢測有熒光表現(xiàn)的不定芽數(shù)/產(chǎn)生的不定芽總數(shù))×100

采用SAS軟件對統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)誤及多重比較檢驗，SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏拉爾甘草去腋芽莖段不定芽分化、增殖及壯苗培養(yǎng)

在預(yù)實驗中，將6-BA和KT(kinetin，激動素)配合使用無法誘導(dǎo)出甘草去腋芽莖段的不定芽，只產(chǎn)生愈傷組織。故在正交設(shè)計的9個配方中，均添加了具有細(xì)胞分裂素作用的TDZ，其能誘導(dǎo)離體培養(yǎng)材料的多種途徑形態(tài)發(fā)生，尤其在離體分化不定芽、胚狀體等試驗研究中常被用到[6-9]。從表1可知，添加TDZ、6BA、IBA不同激素濃度配比的培養(yǎng)基對甘草去腋芽莖段分化不定芽效果有一定的差異。但方差分析表明3種激素各水平之間差異不顯著(表2)，處理5的不定芽分化率最高(圖1A)，為38.8%。每個處理的材料均有不同程度的愈傷化，愈傷組織誘導(dǎo)率較高的處理(圖1B)，其未分化或未愈傷化的外植體很少有褐化或壞死現(xiàn)象，說明外植體材料處于良好分化潛能和狀態(tài)。要保證接種外植體材料的良好狀態(tài)，莖段粗壯、節(jié)間較長的外植體比較適合。因此，在分化不定芽前進行試管苗的壯苗培養(yǎng)非常必要。

將烏拉爾甘草帶腋芽莖段與去腋芽莖段分別置于5號培養(yǎng)基培養(yǎng)，其帶腋芽莖段不定芽分化率達100%，去腋芽莖段只有30.8%。經(jīng)重復(fù)試驗，選擇5號培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA)為最適不定芽分化培養(yǎng)基。得到的不定芽繼續(xù)在5號培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，20 d后產(chǎn)生了密集叢生芽(圖1C)，增殖3.67倍。在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L NAA中壯苗培養(yǎng)30 d，不定芽伸長生長明顯，節(jié)間長，葉片嫩綠，生根明顯(圖1D)，其為最適壯苗培養(yǎng)基。

表1 不同激素配比對誘導(dǎo)烏拉爾甘草去腋芽莖段分化不定芽的影響

TDZ: Thidiaxuron噻苯隆; 6-BA: 6-benzyladenine 6-芐基氨基嘌呤; IBA: Indole-3butyric acid吲哚乙酸。下同 The same below.

表2 方差分析(F檢驗)結(jié)果

a.R2=0.555 (AdjustedR2=-0.186).

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的烏拉爾甘草遺傳轉(zhuǎn)化

烏拉爾甘草去腋芽莖段在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1周，經(jīng)不同濃度侵染菌，侵染不同時間，共培養(yǎng)3 d后，經(jīng)熒光顯微鏡檢測在莖段切口處有加強熒光點，但選擇培養(yǎng)1周后，其不定芽分化率幾乎為零，且材料陸續(xù)失去活性而死亡，在有選擇壓和侵染菌液的條件下去腋芽莖段分化不定芽比較困難。經(jīng)多次重復(fù)試驗，去腋芽莖段在選擇培養(yǎng)后無法分化不定芽而失活，不能完成轉(zhuǎn)化全過程，而帶腋芽莖段能夠在選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后存活，且能保證較高的不定芽分化率。因此，選擇帶腋芽莖段作為轉(zhuǎn)化受體。

烏拉爾甘草帶腋芽莖段在分化培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7 d，再經(jīng)侵染菌侵染過程。GFP表達的熒光檢測顯示，在未轉(zhuǎn)化莖段中都沒有檢測到熒光(圖2A)，轉(zhuǎn)化莖段中能檢測到GFP的瞬時表達(圖2B)，轉(zhuǎn)化再生不定芽中也有GFP表達(圖2C)，且熒光帶(點)明顯。

如表3所示，甘草帶腋芽莖段不定芽分化率和瞬時表達率隨著侵染菌液濃度和時間的不同效果不一。在濃度為OD600=0.6的菌液侵染10 min后，共培養(yǎng)3 d，其不定芽分化率為43.75%，瞬時表達率達78.88%。方差分析可知不同處理得到的瞬時表達率之間有顯著差異(P<0.05)，而不定芽分化率差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)多重比較檢驗，侵染菌OD600=0.6、侵染10 min條件下，其GFP瞬時表達率差異極顯著，而不定芽分化率差異不顯著；經(jīng)重復(fù)試驗，確定“預(yù)培養(yǎng)(圖3A)7 d后，用侵染菌OD600=0.6侵染10 min，共培養(yǎng)(圖3B)3 d”為最適侵染轉(zhuǎn)化條件，在選擇培養(yǎng)(圖3C)20 d后，得到具有GFP熒光反應(yīng)的不定芽(圖3D)長成小植株(圖3E)24株。

圖1 烏拉爾甘草去腋芽莖段不定芽分化、增殖及壯苗生長過程Fig.1 The process of adventitious buds differentiation, propagation and elongation from stem without axillary buds of G. uralensis A:誘導(dǎo)不定芽分化; B:誘導(dǎo)愈傷組織形成；C:不定芽增殖培養(yǎng); D:叢生芽壯苗培養(yǎng)。A: Differentiated adventitious buds; B: Induced callus; C: Adventitious buds propagation; D: Elongation

圖2 GFP 在烏拉爾甘草組織中的瞬時表達Fig.2 Transient expressing of GFP gene in G. uralensis A:沒有經(jīng)過浸染的對照的熒光圖像; B:培養(yǎng)20 d后的莖段傷口處GFP的瞬時表達(箭頭所示); C:培養(yǎng)20 d后GFP在不定芽(箭頭所示)中表達A: Fluorescence image of an untransformed control; B: Transient expression of GFP gene at the wounding edge (showed by arrow); C: Stable GFP expression in putative transformed bud (showed by arrow).

圖3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)烏拉爾甘草莖段遺傳轉(zhuǎn)化獲得再生轉(zhuǎn)化植株的過程Fig.3 Obtaining transformed plants from stem of G. uralensis mediated by Agrobacterium A: 預(yù)培養(yǎng)；B：共培養(yǎng)； C：選擇分化培養(yǎng)；D：轉(zhuǎn)基因再生不定芽；E: 轉(zhuǎn)基因再生植株。A: Pre-culturing; B: Co-culturing; C: Selective culture of adventitious buds differentiation; D: Transformed adventitious buds; E: Transformed plant.

2.3 烏拉爾甘草轉(zhuǎn)基因再生植株的檢測與分析

取5株烏拉爾甘草轉(zhuǎn)化苗經(jīng)PCR擴增反應(yīng)，電泳分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株可擴增到610 bp的特異性條帶，而未轉(zhuǎn)化的植株中無該片段的產(chǎn)生，從而初步證明這5個株系的再生植株為轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖4)。

3 討論

通過組織培養(yǎng)和植株再生來實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化是目前最主要的方法。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化體系需有較高的轉(zhuǎn)化植株再生率和感染率，在這2個先決條件中，植株高效再生體系的建立非常關(guān)鍵，直接影響后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化。通過不定芽或胚狀體發(fā)生通常被認(rèn)為是少數(shù)細(xì)胞或單細(xì)胞起源的植株再生途徑，對轉(zhuǎn)基因是有利的，可以避免產(chǎn)生嵌合體[16]。而分生組織及伴有活躍細(xì)胞分裂的外植體如莖尖、胚芽、頂芽、腋芽等作為轉(zhuǎn)化受體容易出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象，但其再生能力強大。有研究表明在含較高濃度的細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基中對不定芽進行切割增殖，可能會降低嵌合體產(chǎn)生的比例[17]。

表3 不同侵染條件對烏拉爾甘草不定芽分化和GFP基因瞬時表達的影響

注: 不同小寫字母代表P<0.05水平顯著。

Note: Different small letters represent significant differences atP<0.05 level.

圖4 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR 檢測Fig.4 PCR identification of transformed plants A: Gly-GFP基因PCR檢測電泳圖；B: Gly-GUS基因PCR檢測電泳圖。1為Marker，2為陰性對照，3～7為陽性對照，8～12為轉(zhuǎn)化植株。A: The fragment of Gly-GFP gene; B: The fragment of Gly-GUS gene. 1: Marker; Lane 2: Control; Lanes 3-7: Plasmid; Lanes 8-12: Transformed plants.

葛淑俊等[11]、雷呈[18]認(rèn)為烏拉爾甘草的子葉莖段和側(cè)芽莖段誘導(dǎo)的叢生苗數(shù)量多，計巧靈[10]認(rèn)為甘草愈傷組織誘導(dǎo)比較容易，但通過愈傷組織分化不定芽較為困難，用下胚軸、子葉或去腋芽莖段均很難直接分化不定芽，分化率低，李興欣等[9]研究認(rèn)為甘草去子葉胚的不定芽分化能力最強，試管苗生根順利，是進行甘草遺傳轉(zhuǎn)化的適宜外植體。從這些研究中可以看出較容易得到再生不定芽的是甘草子葉莖段、去子葉胚、帶腋芽莖段，而以不帶芽器官或組織(如子葉、胚軸、去芽莖段、愈傷組織等)的植株再生培養(yǎng)體系不穩(wěn)定，重復(fù)性差，致使后續(xù)轉(zhuǎn)化程序無法進行。本研究用甘草的去腋芽莖段作為外植體，在MS+0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L 6BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上無菌培養(yǎng)，得到了較好的不定芽分化率，最高達38.8%；但去腋芽莖段經(jīng)侵染菌液浸泡，在添加抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，無法得到穩(wěn)定的不定芽分化率，且分化的不定芽存活困難，無法繼續(xù)下一步的遺傳轉(zhuǎn)化操作試驗。而帶腋芽莖段不定芽分化率為100%，雖然受侵染菌液和選擇培養(yǎng)基的影響，其分化的不定芽能夠存活，且具有78.88%的GFP瞬時表達率，且GFP基因能夠在甘草植株的器官和組織中充分表達，這與李興欣等[9]的研究結(jié)果相似。

因此，本研究認(rèn)為選擇轉(zhuǎn)化受體時，應(yīng)該將來源穩(wěn)定且可以大量供應(yīng)的帶芽組織或器官作為轉(zhuǎn)化受體，其具有高效穩(wěn)定的再生能力，在獲得一定數(shù)量的再生轉(zhuǎn)化不定芽后，采用切割增殖等方法，結(jié)合轉(zhuǎn)基因PCR檢測、Southern雜交、Northern雜交、RT-PCR等檢測方法，可以獲得非嵌合體的轉(zhuǎn)基因再生植株。

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Invitroresearch on receptor regeneration and genetic transformation inGlycyrrhizauralensis

HU Hai-Ying1, ZHANG Rui2, DUAN Yan-Hui2, XIE Ying-Zhong1*

1.AgriculturalCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China； 2.LifeScienceCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China

A study has been undertaken to investigate the system of receptor regeneration and genetic transformation ofGlycyrrhizauralensisinvitro, in order to provide a preliminary experimental basis for breedingG.uralensisvia genetic engineering. Using stem segments as explants, tests were done to select the most appropriate medium formula for adventitious bud differentiation, propagation and elongation. Furthermore, GUS and GFP genes were transferred intoG.uralensisthroughAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation methods. The results showed that the optimum formula for bud differentiation and proliferation was a Murashing and Skoog (MS) medium supplemented with 0.1 mg/L thidiaxuron, 0.1 mg/L 6-benzyladenine and 0.1 mg/L indole-3butyric acid. Using this formula, the differentiation rate of adventitious buds was 38.8% and the rate of multiplication 3.67. The most suitable formula for bud elongation was a MS medium containing 0.5 mg/L α-naphthalene acetic acid. Compared to stems without axillary buds, the differentiation rate of adventitious buds reached 100%. Moreover, these buds can survive in antibiotic containers and so become the optimal transformation explants. Stems with axillary buds were pre-cultured for 7 days in the differentiation medium, then infected by an Agrobacterium tumefaciens solution (OD600=0.6) for 10 min and co-cultured for 3 days, following which the explants were transferred to a selective medium based on the differentiation medium and supplemented with 50 mg/L kanamycin and 250 mg/L carbenicillin. After 20 days, theGFPtransient expression rate reached 78.88% andGFPexpressed strongly byGFPdetection. 5 transformed plants were selected randomly for testing and the presence ofGUSandGFPgenes in the genome were confirmed by polymerase chain reaction, indicating that 5 transformed plantlets had been successfully produced.

Glycyrrhizauralensis; stem segments; adventitious bud differentiation; genetic transformation; green fluorescent protein (GFP)

10.11686/cyxb2015590

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-12-31；改回日期：2016-03-07

寧夏自然科學(xué)研究基金項目(NZ13034)資助。

胡海英(1976-)，女，寧夏平羅人，副教授，在讀博士。E-mail: haiying@nxu.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail: xieyz@nxu.edu.cn

胡海英，張芮，段艷慧，謝應(yīng)忠. 烏拉爾甘草離體再生與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究. 草業(yè)學(xué)報, 2016, 25(11): 50-56.

HU Hai-Ying, ZHANG Rui, DUAN Yan-Hui, XIE Ying-Zhong.Invitroresearch on receptor regeneration and genetic transformation inGlycyrrhizauralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(11): 50-56.