張冬梅，張雅明*

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200000)

苦參堿逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細胞株(HT-29)奧沙利鉑耐藥性的作用及機制研究

張冬梅，張雅明*

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200000)

目的研究苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞HT-29/奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXA)耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用并探討其可能的作用機制。方法采用逐步增加藥物濃度的方法建立奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細胞株HT-29/OXA;CCK-8法測定苦參堿對HT-29/OXA細胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)作用，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、周期變化;實時定量PCR檢測各組細胞肺耐藥蛋白（lung resistance protein LRP)和P-glycoprotein(P-gp)mRNA表達水平;Western blot檢測各組細胞LRP和P-gp蛋白的表達水平。結(jié)果苦參堿使HT-29/OXA細胞對奧沙利鉑的敏感性增加，耐藥性得到部分逆轉(zhuǎn)。奧沙利鉑(0.5μg/mL)和苦參堿(3.0μg/mL)單獨用藥對結(jié)腸癌耐藥細胞株HT-29/OXA細胞周期以及細胞凋亡沒有影響；聯(lián)合用藥對HT-29/OXA生長增殖具有明顯抑制作用并且能夠通過改變細胞周期引起凋亡（P＜0.05）。奧沙利鉑(0.5μg/mL)和苦參堿(3.0μg/mL)單獨用藥對HT-29/OXALRP和P-gp mRNA以及蛋白的表達沒有影響；聯(lián)合用藥作用后LRP mRNA和P-gp mRNA表達水平降低（P＜0.01），同時下調(diào)了LRP和P-gp蛋白表達（P＜0.01）。結(jié)論苦參堿部分逆轉(zhuǎn)HT-29/OXA細胞對奧沙利鉑的耐藥性，其機制可能與細胞內(nèi)LRP和P-gp表達降低有關(guān)。

結(jié)腸癌；HT-29;奧沙利鉑；多藥耐藥性；苦參堿

結(jié)腸癌的發(fā)病率以及死亡率位居我國惡性腫瘤的第三位，目前的治療手段以手術(shù)切除為主，同時聯(lián)合放療、化療來降低手復(fù)發(fā)率，提高生存率[1-2]。但目前應(yīng)用的化療藥物以及方案的總體療效并不理想，其主要原因是化療過程中結(jié)腸癌細胞的多藥耐藥現(xiàn)象導(dǎo)致化療失敗[3-4]?？鄥A(Matrine)是中藥苦參的主要活性成分之一,廣泛存在于豆科植物苦參、苦豆子及廣豆根中，藥用廣泛。苦參堿是苦參中的抗癌有效成分，對肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和直腸癌等細胞均具有生長抑制作用[5-9]，但是其對癌細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用尚未有報道。本研究旨在探討苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞HT-29/奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用并探討其可能的作用機制。

1　材料與儀器

1.1細胞

HT-29細胞株購自美國ATCC公司。

1.2主要試劑與藥物

RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清購自美國Gibco公司；奧沙利鉑、苦參堿、四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC apoptosisdetection kit凋亡檢測試劑盒及Cycle TESTTTM PLUS DNA Reagent Kit細胞周期檢測試劑盒均購自美國BD公司；Trizol購自Invitrogen公司；肺耐藥蛋白（lung resistance protein LRP mRNA）、P-glycoprotein（P-gp）、GAPDH引物由廣州瑞博公司合成；鼠抗人LRP蛋白單克隆抗體以及鼠抗人P糖蛋白（P-gp）單克隆抗體購自Abcam公司。

1.3主要儀器

Synergy 2多功能酶標儀(廣州吉源生物科技有限公司)；Light Cycler 480實時定量PCR儀(德國羅氏公司)；Attune NxT流式細胞儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)

結(jié)腸癌細胞HT-29常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%小牛血清、1%雙抗液(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL),于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

2.2奧沙利鉑耐藥結(jié)腸癌細胞的建立

取對數(shù)生長期HT-29細胞，調(diào)整細胞密度為1×105/mL,加入奧沙利鉑（0.1μg/mL）培養(yǎng)液連續(xù)作用48 h，棄去上清液；加入不含奧沙利鉑的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞恢復(fù)正常生長后，消化傳代，再用奧沙利鉑（0.1μg/mL）培養(yǎng)液連續(xù)作用細胞48 h。如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高奧沙利鉑的濃度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μg/mL），當細胞在含0.3μg/mL奧沙利鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長時，以含加倍質(zhì)量濃度（0.6、1.2μg/mL）大劑量奧沙利鉑培養(yǎng)液對HT-29細胞進行間斷誘導(dǎo)，最終獲得對奧沙利鉑耐藥的HT-29細胞，即HT-29/OXA。用于后續(xù)實驗的細胞于實驗前1周停止奧沙利鉑的處理。

2.3CCK-8法檢測HT-29細胞活力

取對數(shù)生長期的HT-29/OXA細胞以1×105個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，分為對照組（生理鹽水）、苦參堿單藥組（1.0、3.0、10.0μg/mL）、奧沙利鉑單藥組（0.05、0.5、5.0μg/mL）及梯度濃度奧沙利鉑與苦參堿聯(lián)合用藥組，每組設(shè)3個復(fù)孔，將各組細胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8試劑10μL，37℃孵育1 h，多功能酶標儀在450 nm波長處測定OD值。細胞生長率(%)=實驗組OD平均值／對照組OD平均值×100%。

2.4流式細胞儀分析

將HT-29/OXA細胞接種于6孔培養(yǎng)板，24 h后分為對照組（溶劑組）、苦參堿單藥（3.0μg/mL）、奧沙利鉑單藥（0.5μg/mL）及奧沙利鉑與苦參堿聯(lián)合用藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后獲取細胞，PBS洗滌，加入70%冷乙醇固定后重新收集細胞，PBS洗去固定液，加入RNA酶反應(yīng)過夜，與碘化丙啶（PI）染液混勻后，用流式細胞儀作流式細胞分析，汞激發(fā)波長為488 nm，并用ModFit LT2.0軟件分析細胞周期分布及凋亡情況，計算各期細胞所占比例及凋亡率。

2.5實時定量PCR分析LRPmRNA和P-gp mRNA的表達

將HT-29/OXA細胞接種于6孔培養(yǎng)板24 h后，分為對照組（溶劑組）、苦參堿單藥（3.0μg/mL）、奧沙利鉑單藥（0.5μg/mL）及奧沙利鉑與苦參堿聯(lián)合用藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后獲取細胞，根據(jù)使用說明書，使用Trizol試劑提取HT-29/OXA細胞中的RNA，檢測所提RNA的濃度和純度，使用總RNA作為模板合成cDNA第一鏈。根據(jù)操作說明，使用LightCycler 480實時定量PCR儀對cDNA樣品進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)，LRP,P-gp，GAPDH引物序列如下：LRP上游5’-GCATTATTCGCACTGCTGTC-3’,下游5’-AGCCTCCAGCTCCAAGAGTT-3’;P-gp上游5’-GATATTGCCTGGTTTGATGA-3’,下游5’-TGCATTTTGTGTTAAGACGC-3’,GAPDH上游5’-TTTG-GTATCGTGGAAGGACT-3’;下游5’-AGTAGAGGCAGGGATGATGT-3’。GAPDH作為內(nèi)參，通過比較2-ΔΔCt值進行相對定量分析。

2.6 Western-blot分析LRP和P-gp蛋白表達

將HT-29/OXA細胞接種于6孔培養(yǎng)板24 h后，分為對照組（溶劑組）、苦參堿單藥（3.0μg/mL）、奧沙利鉑單藥（0.5μg/mL）及奧沙利鉑與苦參堿聯(lián)合用藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后獲取細胞，提取蛋白質(zhì)后，進行SDS-PAGE電泳（分離膠12%，濃縮膠5%），每孔加入50 pg蛋白質(zhì)，恒壓120 V電泳至分離膠底部，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉2 h，加入1∶2 000稀釋的LRP單克隆抗體或者1∶1 500稀釋的P-gp單克隆抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次15 min。再加入1∶400稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，振搖2 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，掃描后用ImageJ圖像分析軟件進行光密度積分值分析。

2.7統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用獨立樣本的t檢驗或者單因子方差分析（One-way ANOVA）檢驗，對不同實驗組之間的數(shù)據(jù)進行比較。所有數(shù)據(jù)以“±s”來表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1苦參堿對HT-29/OXA細胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)作用

通過CCK-8實驗進一步發(fā)現(xiàn)（表1），不同濃度(0-5μg/mL)的奧沙利鉑聯(lián)合1.0、3.0、10.0μg/mL苦參堿作用于HT-29/OXA細胞，其IC50分別為3.7、1.6、1.1μg/mL，與空白對照組（0μg/mL苦參堿,IC50為4.2μg/mL）相比具有顯著性差異(P＜0.001)?？鄥A使HT-29/OXA細胞對奧沙利鉑的敏感性增加，耐藥性得到部分逆轉(zhuǎn)。

3.2苦參堿聯(lián)合奧沙利鉑用藥對HT-29/OXA細胞的細胞周期分布以及細胞凋亡率的影響

表1　CCK-8檢測梯度濃度苦參堿聯(lián)合奧沙利鉑作用HT-29/OXA細胞的生存率（%）及IC50的比較(±s,n=3,%)

表1　CCK-8檢測梯度濃度苦參堿聯(lián)合奧沙利鉑作用HT-29/OXA細胞的生存率（%）及IC50的比較(±s,n=3,%)

注：奧沙利鉑聯(lián)合1.0μg/mL苦參堿組IC50與奧沙利鉑聯(lián)合0μg/mL苦參堿組IC50相比，*P＜0.05;奧沙利鉑聯(lián)合3.0、10.0 μg/mL苦參堿組IC50分別與奧沙利鉑聯(lián)合0μg/mL苦參堿組IC50相比，***P＜0.001。

奧沙利鉑(μg/mL)苦參堿(μg/mL)0 5 0 1.0 3.0 10.0 F值P值100 96.4±3.8 91.7±5.5 84.1±8.7 0.05 94.2±5.3 92.0±6.4 81.7±5.9 71.2±6.9 0.5 92.3±7.2 83.1±4.6 70.1±10.4 67.2±5.5 42.7±8.6 37.2±9.9 14.3±10.9 10.5±3.6 IC50(μg/mL) 4.2±0.15 3.7±0.17* 1.6±0.11*** 1.1±0.33*** 162.6＜0.001

與對照組相比，奧沙利鉑（0.5μg/mL）和苦參堿（3.0μg/mL）單獨用藥對細胞周期以及細胞凋亡沒有影響。奧沙利鉑（0.5μg/mL）聯(lián)合苦參堿（3.0μg/mL）作用于HT-29/OXA細胞48 h后，流式細胞儀的檢測結(jié)果顯示HT-29/OXA細胞周期明顯受到影響，其中G0/G1期細胞的比例顯著性地高于奧沙利鉑組(P＝0.027)和苦參堿組(P＝0.032)，而S期和G2/M細胞比例顯著性地高于奧沙利鉑組(S期: P＝0.012;G2/M期:P＝0.024)和苦參堿組(S期:P＝0.041;G2/M期:P＝0.021)，證實了奧沙利鉑聯(lián)合苦參堿用藥可以抑制HT-29/OXA細胞的增殖。流式細胞術(shù)結(jié)果同時顯示聯(lián)合組的細胞凋亡率（45.3± 6.7）%顯著高于奧沙利鉑組[(20.7±5.5）%；P=0.0025]和苦參堿組[(20.3±4.5）%;P=0.0037)，進一步證明了奧沙利鉑聯(lián)合苦參堿對結(jié)腸癌耐藥細胞株HT-29/ OXA生長增殖具有明顯抑制作用。見表2。

3.3實時定量PCR檢測LRPmRNA和P-gp mRNA表達的變化

結(jié)果顯示，與對照組相比，奧沙利鉑（0.5μg/mL）和苦參堿（3.0μg/mL）單獨用藥對LPR mRNA以及P-gp mRNA的表達水平?jīng)]有影響(圖1A);奧沙利鉑（0.5μg/mL）聯(lián)合苦參堿（3.0μg/mL）作用于HT-29/ OXA細胞48 h后，LRP mRNA和P-gp mRNA表達水平相對于奧沙利鉑組(LRP mRNA:P=0.0082; P-gp mRNA:P=0.0073)或者苦參堿組(LRP mRNA: P=0.0056;P-gp mRNA:P=0.0087)顯著性地降低(圖1A)。

表2　流式細胞儀分析不同藥物作用48 h后HT-29/OXA細胞的細胞周期和凋亡(±s,n=3,%)

表2　流式細胞儀分析不同藥物作用48 h后HT-29/OXA細胞的細胞周期和凋亡(±s,n=3,%)

注：與奧沙利鉑組相比，*P＜0.05;與苦參堿組相比，ΔP＜0.05。

組別對照組奧沙利鉑組苦參堿組聯(lián)合組F值P值G0/G153.4±7.3 50.7±3.6 49.6±5.4 70.2±2.1*Δ11.12＜0.05 S 32.5±6.9 31.4±8.2 25.4±6.3 17.9±5.4*Δ3.94＜0.05 G2/M 23.4±4.8 21.5±2.8 19.1±4.2 9.57±4.2*Δ6.84＜0.05凋亡率17.8±4.3 20.7±5.5 20.3±4.5 45.3±6.7*Δ15.57＜0.05

3.4 LRP蛋白和P-gp蛋白表達的變化

實時定量PCR實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，奧沙利鉑（0.5μg/mL）和苦參堿（3.0μg/mL）單獨用藥對LPR蛋白以及P-gp蛋白的表達水平?jīng)]有影響(圖1B);奧沙利鉑（0.5μg/mL）聯(lián)合苦參堿（3.0μg/mL）作用于HT-29/OXA細胞48 h后，LRP蛋白和P-gp蛋白表達水平相對于奧沙利鉑組(LRP蛋白:P=0.000 23;P-gp蛋白:P=0.004 5)或者苦參堿組(LRP蛋白:P=0.000 29;P-gp蛋白:P= 0.000 54)顯著性地降低(圖1B)。電泳圖見圖2。

圖1　不同藥物作用48 h后對HT-29/OXA中LRP和P-gp mRNA以及蛋白表達的影響柱形圖

圖2　不同藥物作用48 h后對HT-29/OXA中LRP和P-gp mRNA以及蛋白表達的影響電泳圖

4　討論

中藥苦參為豆科多年生落落葉灌木植物苦參(Sophora flavescens Ait.)的干燥根?？鄥⑿钥唷⒑?具清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效,用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、濕疹等?？鄥A是苦參中的抗癌有效成分，對肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和直腸癌等細胞均具有生長抑制作用[5-9]。

奧沙利鉑能夠通過作用于DNA形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)來抑制DNA的合成，產(chǎn)生抗腫瘤活性以及細胞毒作用[10]。由于因個體基因遺傳差異，結(jié)腸癌患者對于奧沙利鉑化療敏感性存在較大的差異，其中產(chǎn)生奧沙利鉑的耐藥性是導(dǎo)致患者化療失敗的主要原因。腫瘤細胞多藥耐藥（multi drug resistance,MDR）機制復(fù)雜，如MDR基因過多表達、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ活性降低或含量減少、谷胱甘肽解毒酶系統(tǒng)活性增高、MDR相關(guān)蛋白基因表達增高等[11]。其中P-gp和LRP介導(dǎo)的MDR研究較多，是機制最為明確的MDR產(chǎn)生途徑。P-gp和LRP在細胞的表達水平與細胞耐藥程度呈正相關(guān)[12-14]。

最近已經(jīng)有多項研究表明苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌細胞的生長。Huang等研究發(fā)現(xiàn)2.0 mg/mL苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌細胞HT-29的生長并且能夠抑制COX-2的表達[15]；Zhou等人也觀察了苦參堿能夠抑制結(jié)腸癌細胞SW116的增殖，并且抑制細胞端粒酶的活性[16]；Chang等人進一步深入研究發(fā)現(xiàn)苦參堿通過上調(diào)Bax的表達以及下調(diào)Bcl-2的表達來誘導(dǎo)HT-29細胞的調(diào)亡，從而起到抑制結(jié)腸癌細胞HT-29增殖的作用[17]。最新的研究也發(fā)現(xiàn)苦參堿通過抑制Akt信號從而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖[9]。本研究結(jié)果顯示低濃度的苦參堿能增強奧沙利鉑對HT-29/ OXA細胞增殖的抑制作用，當奧沙利鉑與低毒劑量苦參堿（3.0μg/mL）共同作用HT-29/OXA細胞時，奧沙利鉑的IC50值明顯降低，提示奧沙利鉑聯(lián)合苦參堿對HT-29/OXA具有較好的化療增敏作用。同時流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，奧沙利鉑聯(lián)合低毒劑苦參堿組的細胞凋亡率和單藥組相比顯著增加。

P-gp是由1280個氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白，通過激活A(yù)TP泵阻礙藥物向細胞內(nèi)被動擴散，將細胞內(nèi)諸如阿霉素、長春新堿等細胞毒藥物向膜外主動轉(zhuǎn)運，降低細胞內(nèi)的藥物濃度，從而產(chǎn)生多藥耐藥作用[18]。LRP僅表達于大腸癌的細胞質(zhì)中，主要通過核靶點屏蔽機制引起多藥耐藥，即阻止以細胞核為靶點的藥物通過核孔進入細胞核，進入胞核的藥物也能夠通過轉(zhuǎn)運載體運出胞核，降低藥物的核質(zhì)分布比例，也可使進入胞質(zhì)的藥物通過胞吐作用排出細胞[19]。本研究中實時定量PCR檢測結(jié)果顯示奧沙利鉑聯(lián)合苦參堿干預(yù)HT-29/OXA細胞后能有效降低細胞LRP mRNA和P-gp mRNA的表達；蛋白印跡實驗結(jié)果顯示HT-29/OXA細胞經(jīng)奧沙利鉑聯(lián)合苦參堿干預(yù)后，其LRP和P-gp蛋白的表達均明顯降低，提示苦參堿的作用機制與降低細胞內(nèi)LRP和P-gp表達降低，進而逆轉(zhuǎn)抗腫瘤藥物外排、增加細胞內(nèi)藥物蓄積有關(guān)。至于奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌細胞對苦參堿的作用機制是否與其他凋亡信號通路相關(guān)蛋白有關(guān)，有待進一步的探索和研究。相信通過進一步的研究，苦參堿作為有效的臨床抗腫瘤輔助藥物，其逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細胞的多藥耐藥將得到更深層次分子機制的支持。

[1]DeSantis CE,Lin CC,Mariotto AB,et al.Cancer treatment and survivorship statistics[J].CA Cancer JClin,2014,64(4):252-271.

[2]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[3]Metzger-Filho O,Moulin C,Awada A.Molecular targeted therapy in prevalent tumors:learning from the past and future perspectives[J].Curr Clin Pharmacol,2010,5(3):166-177.

[4]Temraz S,Mukherji D,Alameddine R,et al.Methods of overcoming treatment resistance in colorectal cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol,2014,89(2):217-230.

[5]Guo B,Zhang T,Su J,et al.Oxymatrine targets EGFR(p-Tyr845)and inhibits EGFR-related signaling pathways to suppress the proliferation and invasion of gastric cancer cells[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2015,75(2):353-363.

[6]Li H,Li X,Bai M,et al.Matrine inhibited proliferation and increased apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells via upregulation of Bax and downregulation of Bcl-2[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14793-14799.

[7]Lin Y,Lin L,Jin Y,et al.Combination of Matrine and Sorafenib Decreases the Aggressive Phenotypes of Hepatocellular Carcinoma Cells[J].Chemotherapy,2014,60(2):112-118.

[8]Rong B,Zhao C,Gao W,et al.Matrine promotes the efficacy and safety of platinum-based doublet chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(9):14701-14717.

[9]Zhang S,Cheng B,Li H,et al.Matrine inhibits proliferation and induces apoptosis of human colon cancer LoVo cells by inactivating Akt pathway[J].Mol Biol Rep,2014,41(4):2101-2108.

[10]Peixoto RD,Kumar A,Lim HJ.Palliative oxaliplatin-based chemotherapy after exposure to oxaliplatin in the adjuvant setting for colon cancer[J].JGastrointest Oncol,2015,6(5):487-491.

[11]Rahman M,Hasan MR.Cancer Metabolism and Drug Resistance[J].Metabolites,2015,5(4):571-600.

[12]Higgins CF.The multidrug resistance P-glycoprotein[J].Curr Opin Cell Biol,1993,5(4):684-687.

[13]Izquierdo MA,Scheffer GL,Flens MJ,et al.Broad distribution of the multidrug resistance-related vault lung resistance protein in normal human tissues and tumors[J].Am J Pathol,1996, 148(3):877-887.

[14]Laurencot CM,Scheffer GL,Scheper RJ,et al.Increased LRPmRNA expression is associated with the MDR phenotype in intrinsically resistant human cancer cell lines[J].Int JCancer,1997,72 (6):1021-1026.

[15]Huang J,Zhang MJ,Qiu FM.Study on inhibitory effect of matrine on cyclooxygenase-2 expression in colon cancer HT-29 cell line[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 2005,25(3):240-243.

[16]周喜漢.韋星，黃贊松，等.苦參堿對結(jié)腸癌SW1116細胞增殖及端粒酶活性的影響[J].中藥材，2009，32(6):923-925.

[17]Chang C,Liu SP,Fang CH,et al.Effects of matrine on the proliferation of HT29 human colon cancer cells and its antitumor mechanism[J].Oncol Lett,2013,6(3):699-704.

[18]Borst P,Schinkel AH,Smit JJ,et al.Classical and novel forms of multidrug resistance and the physiological functions of P-glycoproteins in mammals[J].Pharmacol Ther,1993,60(2): 289-299.

[19]Scheffer GL,Schroeijers AB,Izquierdo MA,et al.Lung resistance-related protein/major vault protein and vaults in multidrugresistant cancer[J].Curr Opin Oncol,2000,12(6):550-556.

（本文編輯 楊瑛）

The Reversal Effects of Matrine on the Multi-drug Resistance of Oxaliplatin in Human Colon HT-29 Cells and its Mechanism Research

ZHANG Dongmei,ZHANG Yaming*
(Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200000,China)

Objective To study of matrine on the reversal of multi-drug resistance in HT-29/OXA cells and explore its underlying mechanisms.Methods Oxaliplatin resistant HT-29/OXA cells were established by gradually increasing the concentration of medicines.The reverse efficacy of Matrine on HT-29/OXA cells was determined by CCK-8 assay.The apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.The expression levels of lung resistance protein(LRP)and P-glycoprotein(P-gp)mRNA and proteins was determined by quantitative real time PCR(qRT-PCR)and Western blot, respectively.Results Matrine can increase the sensibility of HT-29/OXA to oxaliplatin and reverse the part resisitance.Matrine(0.5μg/mL)and matrine(3.0μg/mL)alone had no effect on the cell cycle and apoptosis in HT-29/OXA cells.The oxaliplatinin combination with matrine significantly inhibited cell proliferation and induced apoptosis.Oxaliplatin(0.5μg/mL) and matrine(3.0μg/mL)alone had no effect on the expression level of LRP and P-gp mRNA and protein in HT-29/OXA cells.The expression of LRP and P-gp mRNA and protein was lower with drug combination.Conclusion Matrine could partially reverse the multi-drug resistance of HT-29/OXA cells to oxaliplatin,which may be related to the lower expression levels of LRP and P-gp.

colon cancer;HT-29;oxaliplatin;multi-drug resistance;matrine

R285.5；R735.3+5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.11.006

2016-03-26

上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃資助（2014-2016年，編號ZY3-CCCX-1-1008）。

張冬梅，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合肛腸疾病防治。

*張雅明，女，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:ym_zhang56@sina.com。