薛麗佳 黃巧容 林輝 崔貝貝 李茜 劉毅

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院干細(xì)胞生物學(xué)研究室， 四川 成都 610041；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科, 四川 瀘州646000)

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·論著·

B淋巴細(xì)胞微粒在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血和關(guān)節(jié)液中的表達(dá)及臨床意義*

薛麗佳1黃巧容2林輝1崔貝貝1李茜3劉毅1

(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院干細(xì)胞生物學(xué)研究室， 四川 成都 610041；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科, 四川 瀘州646000)

目的 探討B(tài)淋巴細(xì)胞微粒(B-LMPs)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測39例活動期RA患者(RA組)和24例健康體檢者(健康對照組)外周血B-LMPs含量，檢測RA患者外周血CRP、 ESR、RF、ACPA指標(biāo)，分析B-LMPs含量與各指標(biāo)相關(guān)性。其中20例有膝關(guān)節(jié)積液RA患者(關(guān)節(jié)液組)同時(shí)檢測配對外周血和關(guān)節(jié)液B-LMPs含量。結(jié)果 RA患者外周血B-LMPs含量顯著高于健康對照組(P<0.01)；RA患者關(guān)節(jié)液B-LMPs含量明顯高于配對外周血(P<0.05)。RA患者外周血B-LMPs含量與疾病活動性評分DAS28呈正相關(guān)(r=0.5431,P=0.0009),與ESR、CRP、RF、ACPA無相關(guān)性；而關(guān)節(jié)液B-LMPs含量與疾病活動性評分DAS28呈負(fù)相關(guān)(r=-0.470，P=0.0362)，與CRP、ESR、RF、ACPA無相關(guān)性。結(jié)論 RA患者外周血B-LMPs表達(dá)異常，且與疾病活動性顯著相關(guān)，提示B-LMPs在RA疾病活動和關(guān)節(jié)損害中發(fā)揮重要作用。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；B淋巴細(xì)胞微粒；流式細(xì)胞技術(shù)；關(guān)節(jié)液

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是風(fēng)濕免疫科常見的自身免疫性疾病，以對稱性關(guān)節(jié)破壞為主要表現(xiàn)，伴隨慢性、進(jìn)行性、侵襲性發(fā)病為主要特征[1-2]。既往研究認(rèn)為RA的發(fā)病與免疫細(xì)胞活化和細(xì)胞因子參與有關(guān)；深入的研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞活化或凋亡可以分泌一種電鏡下直徑介于100～1000 nm的超微囊泡顆粒，稱之為細(xì)胞微粒(cell-derived microparticles，MPs)[3],其具有源細(xì)胞表面抗原、蛋白質(zhì)、核酸，還能參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、凝血、新生血管生成以及傳遞生長因子等。根據(jù)這些MPs來源不同可分為血小板微粒(Platelet microparticles, PMPs)、內(nèi)皮細(xì)胞微粒(Endothelial microparticles, EMPs)、單核細(xì)胞微粒(Monocyte microparticles, MMPs)以及淋巴細(xì)胞微粒(lymphocyte microparticles, LMPs)[4]等，LMPs又可以進(jìn)一步分為B淋巴細(xì)胞微粒(B-LMPs)和T淋巴細(xì)胞微粒(T-LMPs)。

LMPs是由活化或凋亡的淋巴細(xì)胞出芽脫落形成的一種超微囊泡結(jié)構(gòu)，靜息狀態(tài)下，細(xì)胞膜內(nèi)層帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺組成[5]，當(dāng)細(xì)胞受到活化和外界刺激時(shí)，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞膜上的氨基磷脂特異性移位酶、非特異性脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶、非特異性脂質(zhì)爬行酶、鈣離子依賴蛋白酶活性，隨著磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外層，細(xì)胞骨架發(fā)生伸展變形[6]，最終形成LMPs。LMPs能表達(dá)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3、CD4、CD8、CD20，但是T-LMPs不能表達(dá)CD28和CD45[7]。有研究發(fā)現(xiàn)LMPs具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控血管生成和調(diào)節(jié)血管張力等作用，在心血管疾病和糖尿病中均檢測到LMPs的存在[8]。對于B-LMPs參與RA的發(fā)病炎癥機(jī)制，國內(nèi)研究較少，本研究通過比較RA患者外周血和關(guān)節(jié)液B-LMPs數(shù)量的變化，探索B-LMPs在RA發(fā)病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年12月至2015年7月四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科病房或門診中重度活動期RA患者39例，其中女性34例，男性5例，平均年齡(48.95±14.30)歲。所有患者均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)或2010年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)RA分類標(biāo)準(zhǔn)。疾病活動度判斷采用疾病活動指數(shù)28(DAS28)，以DAS28≥3.2為疾病中重度活動。入選患者平均DAS28為(5.04±1.15),其中20例抽取膝關(guān)節(jié)液，標(biāo)本采集前1個月患者未服用改善病情抗風(fēng)濕藥(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)，未服用激素或口服低劑量激素(潑的松≤10 mg/d)。另納入24例無免疫性疾病及近期感染史的健康體檢者作為對照組，性別與年齡均匹配，其中女性19例，男性5例， 平均年齡(42.75±8.62)歲。健康組無關(guān)節(jié)積液。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①急慢性感染；②惡性腫瘤；③合并或重疊其他結(jié)締組織??；④糖尿病；⑤伴有過敏、哮喘等其他變態(tài)反應(yīng)性疾??；⑥心血管疾??；⑦懷孕或哺乳患者。本研究獲得四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且取得受試者的知情同意。

1.2 試劑與儀器 APC-抗人Annxin V購自美國eBioscience公司，PECR-Cy5.5-抗人CD20抗體及相應(yīng)同型對照抗體(美國Beckon-Dickinson公司)； Annexin V Binding Buffer(10×)購自美國Beckon-Dickinson公司；絕對計(jì)數(shù)熒光微球試劑盒購自美國 Beckman Coulter公司；黃色納米熒光標(biāo)準(zhǔn)試劑盒, 流式細(xì)胞級別購自美國Spherotech公司。FACS Aria流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，TCL-16高速離心機(jī)購自中國湘儀公司，不銹鋼換膜過濾器購自美國Millipore公司。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料 詳細(xì)記錄每個RA患者的年齡、性別、病程、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(SJC)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(TJC)。

1.3.2 檢測ESR、CRP、RF和ACPA水平 取RA患者清晨空腹靜脈血以枸櫞酸鈉3.7 ml抗凝，同時(shí)無菌操作抽取RA患者的膝關(guān)節(jié)液5 ml至枸櫞酸鈉抗凝管中，分別采用魏氏法檢測血沉(ESR)水平，速率散色比濁法檢測C反應(yīng)蛋白(CRP)和類風(fēng)濕因子(RF)水平，ELISA法檢測抗環(huán)網(wǎng)氨酸肽抗體(ACPA)水平。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測RA患者外周血和關(guān)節(jié)液B-LMPs數(shù)量 分別取外周血和關(guān)節(jié)液樣本10 μL，加入1 μL APC標(biāo)記的抗人Annxin V抗體和1 μL Annexin V Binding Buffer(10×)，避光孵育10 min后，加入1 μL PECR-Cy5.5標(biāo)記的抗人CD20抗體，室溫下避光孵育30 min，同時(shí)設(shè)同型對照反應(yīng)管，以150 μL Annexin V Binding Buffer(1×)重懸細(xì)胞，并加入絕對計(jì)數(shù)熒光微球漩渦震蕩后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本之間采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；兩配對樣本之間采用非參數(shù)檢驗(yàn)Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)；Spearman直線相關(guān)分析及線性回歸分析RA患者外周血、關(guān)節(jié)液MPs的水平與病情活動指標(biāo)相關(guān)性，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較 RA組和關(guān)節(jié)液組在年齡、性別、病程、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)(TJC)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(SJC)、ESR、CRP、RF陽性率、ACPA陽性率、DSA28率方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 RA患者與健康對照組外周血B-LMPs比較 RA患者外周血B-LMPs表達(dá)水平高于健康對照組(P<0.01)，RA患者關(guān)節(jié)液B-LMPs表達(dá)水平顯著高于配對關(guān)節(jié)液外周血(P< 0.05)，見表2。

2.3 RA患者外周血、關(guān)節(jié)液B-LMPs與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析 RA患者外周血B-LMPs數(shù)量與DAS28呈正相關(guān)(r=0.5431,P=0.0009)，與ESR、CRP、RF、ACPA無相關(guān)性；而關(guān)節(jié)液B-LMPs 數(shù)量與DAS28呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4707,P=0.0362)，與CRP、ESR、RF、ACPA無相關(guān)性，見表3。

表1 臨床資料比較

注：RA: 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎； SF:關(guān)節(jié)液; SJC:腫脹關(guān)節(jié)數(shù); TJC: 壓痛關(guān)節(jié)數(shù); ESR: 血沉; CRP:C-反應(yīng)蛋白； RF: 類風(fēng)濕因子; Anti-CCP: 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體；DAS 28: 28個關(guān)節(jié)活動度指標(biāo)。

表2 4組B-LMPs檢測值

注：與健康對照比較，①P<0.01；與配對關(guān)節(jié)液比較，②P<0.05

表3 RA患者B-LMPs與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

Table 3 Correlation of B-LMPs counts in plasma of RA patientsand synovial fluid of RAwith clinical parameters

患者外周血B-LMPsrP患者關(guān)節(jié)液B-LMPsrPDAS280.54310.0009①-0.47070.0362②CRP-0.27170.0943-0.21540.3618ESR0.09700.5569-0.38140.1072RF-0.07830.67020.66020.8303ACPA0.13100.43950.10280.6849

注：①P<0.05;②P<0.05。

3 討論

RA的發(fā)病伴隨各種炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞活化，在關(guān)節(jié)滑膜處炎性因子的浸潤，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞是RA的主要臨床特點(diǎn)。近年來隨著MPs的研究深入，發(fā)現(xiàn)其不僅是一種細(xì)小的碎片，更具有生物學(xué)活性物質(zhì)，參與細(xì)胞間信號傳遞、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等[10]；來源于活化B淋巴細(xì)胞的B-LMPs，在某種程度上也參與了RA的免疫調(diào)控階段[15]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，B-LMPs能誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1和TNF-α，介導(dǎo)慢性炎癥。Baka等[12]在皮肌炎和多肌炎患者外周血檢測到T-LMPs和B-LMPs數(shù)量明顯增加，且與抗JO-1抗體、肺損傷程度相關(guān)，提示LMPs可能參與炎性肌病的發(fā)病。有研究表明，硬皮病患者外周血中PMPs、LMPs及EMPs含量均升高[13- 14]。Berckmans等[15]最早研究了RA患者外周血和關(guān)節(jié)液中的細(xì)胞微粒，其中關(guān)節(jié)液中B-LMPs含量約為(10～304)×106/L，與外周血(10～31)×106/L相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在RA關(guān)節(jié)液中仍以T-LMPs和MMPs為主。本研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中B-LMPs的含量顯著高于健康對照組，而Berckmans等[15]的研究則未觀察到差異存在。既往有報(bào)道LMPs可以通過巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，當(dāng)LMPs被小鼠單核細(xì)胞白血病RAW264.7細(xì)胞吞噬后，誘導(dǎo)其凋亡，巨噬細(xì)胞得到活化繼而釋放炎癥因子[16]。LMPs在調(diào)節(jié)血管生成方面同時(shí)具有抑制和促進(jìn)兩種功能，低濃度的LMPs能減少內(nèi)皮細(xì)胞上一氧化氮的產(chǎn)生，這一過程依賴P13K途徑，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損害和血管生成受損，而高濃度LMPs能直接改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能，一方面，LMPs增加血管內(nèi)皮生長因子、IL-1β、細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮釋放和促進(jìn)血管生成[17-19]。另一方面， LMPs表達(dá)音猬因子(sonic hedgehog，shh)基因、shh蛋白，作用于血管內(nèi)皮生長因子。Distler等[20]發(fā)現(xiàn)，LMPs促進(jìn)關(guān)節(jié)滑液中成纖維細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、MMP-3 、MMP-9、MMP-13的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中B-LMPs含量均顯著高于健康對照組，提示B-LMPs參與了RA的免疫反應(yīng)，而RA患者關(guān)節(jié)液中B-LMPs含量較外周血相比明顯增高，B-LMPs作用與滑膜成纖維細(xì)胞，釋放眾多炎癥因子，進(jìn)一步吸引白細(xì)胞聚集在關(guān)節(jié)腔中產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。由于RA患者關(guān)節(jié)液中的B-LMPs作用于滑膜成纖維細(xì)胞，釋放IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)以及MCP-2，進(jìn)一步吸引白細(xì)胞聚集在關(guān)節(jié)腔中產(chǎn)生炎癥。這與我們觀察到外周血B-LMPs與疾病活動度DAS28呈正相關(guān)，而RA關(guān)節(jié)液中B-LMPs與疾病活動度DAS28呈負(fù)相關(guān)一致，推測B-LMPs可作用與滑膜成纖維細(xì)胞相互作用，升高的炎癥因子在某種程度上會抑制炎癥因子的產(chǎn)生。

4 結(jié)論與啟示

本研究結(jié)果顯示，RA患者外周血中B-LMPs水平與炎癥指標(biāo)密切相關(guān)，在一定程度上反映了體內(nèi)炎癥水平，但尚需探索B-LMPs水平與RA局部關(guān)節(jié)破壞的關(guān)系，PMPs的檢測對RA早期診斷和病情監(jiān)測具有重要的臨床價(jià)值。PMPs不僅參與血栓形成和動脈粥樣硬化，在RA炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要作用。

目前有關(guān)B-LMPs在炎癥狀態(tài)下的病理生理特性，B-LMPs對RA的影響機(jī)制尚不十分明確，未來還將探討B(tài)-LMPs功能以及與其他免疫細(xì)胞的相互作用，從而為深入認(rèn)識RA分子機(jī)制，尋找新的RA治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

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Association of elevated B-lymphocyte Microparticles with disease activity in rheumatoid arthritis

XUE Lijia1,HUANG Qiaorong2,LIN Hui2,et al

(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology,WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China;2.LaboratoryofStemCellBiology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;3.DepartmentofRheumatologyandImmunology，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000,Sichuan,China)

Objective To test the expression of B-lymphocyte Microparticles (B-LMPs) in rheumatoid arthritis (RA) patient’s plasma and synovial fluid and compare the difference between patients and healthy controls (HC).Methods The levels of B-LMPs in plasma were detected by flow cytometry in 39 active RA patients and 24 healthy volunteers. Synovial fluid (SF) was collected from 20 patients. Clinical parameters including CRP, ESR, RF, ACPA in the patients and volunteers were observed and analyzed. The potential correlation of B-LMPs counts and clinical parameters was analyzed. Results The B-LMPs levels in SF from RA patients were higher than paired plasma (P<0.05) and in plasma from HC (P<0.01). The levels of plasma B-LMPs were positively correlated with Disease Activity Score DAS28 (r=0.5431,P=0.0009) and not correlated with ESR, CRP, RF and ACPA. B-LMPs levels in SF were not correlated DAS28, ESR, CRP, RF and ACPA (P>0.05). Conclusion B-LMPs may be involved in immune regulation and systemic inflammation of RA. The elevated levels of PMPs could be a potential biomarker for RA.

Rheumatoid arthritis; Flow cytometry; B-lymphocyte Microparticles; Synovial fluid

國家自然科學(xué)基金(81102274)；四川省科技廳國際合作項(xiàng)目(2014HH0027)；成都市科技攻關(guān)項(xiàng)目(10GGYB644SF-023)

林輝，博士，副主任醫(yī)師，本刊審稿專家，E-mail：lhacd@163.com

R 593.22

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.006

2016-07-01；

2016-08-13； 編輯： 黎仕娟)