鄧雪琴 王健超 趙莎 雷松 廖殿英 張文燕 葉云霞 劉衛(wèi)平 李甘地

(四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科， 四川 成都 610041)

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·論著·

流式細胞免疫表型分析在淋巴組織增生性病變診斷的應(yīng)用價值*

鄧雪琴 王健超 趙莎 雷松 廖殿英 張文燕 葉云霞 劉衛(wèi)平 李甘地

(四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科， 四川 成都 610041)

目的 探討流式細胞免疫表型分析(FCI)在實體組織中診斷淋巴組織增生性病變的應(yīng)用價值。方法 采用流式細胞術(shù)對261例淋巴組織增生性病變行免疫表型分析，并與病理活檢結(jié)果進行對比。結(jié)果 流式細胞免疫表型分析免疫表型分析與病理活檢結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。通過流式細胞術(shù)診斷非霍奇金淋巴瘤119例，其中B細胞淋巴瘤70例，T細胞淋巴瘤16例，漿細胞腫瘤4例，NK細胞淋巴瘤21例，前體淋巴造血組織腫瘤8例。B細胞淋巴瘤中，以彌漫大B細胞淋巴瘤為多見；T細胞淋巴瘤中，以血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤為多見。FCI與常規(guī)病理活檢有19例結(jié)果不一致。結(jié)論 本研究結(jié)果提示FCI是淋巴組織增生性病變病理診斷的重要輔助手段，可提高診斷的準(zhǔn)確性，并可縮短確診時間，值得推廣應(yīng)用。

流式細胞術(shù)； 免疫表型； 淋巴瘤； 淋巴組織增生性病變

淋巴組織增生性病變的病理診斷需要充分結(jié)合臨床、組織病理形態(tài)學(xué)、免疫表型以及遺傳學(xué)特征等，其中免疫表型是鑒別診斷的重要依據(jù)，對臨床選擇治療方案、預(yù)后判斷都具有重要意義。流式細胞免疫表型(flow cytometric immunophenotyping, FCI)是指通過光學(xué)方法對單個核細胞進行多參數(shù)定性和定量，分析細胞各種免疫表型特征的一種方法，具有快速、敏感及多參數(shù)分析等優(yōu)點。目前流式細胞術(shù)應(yīng)用于實體組織進行淋巴組織增生性病變病理診斷國內(nèi)報道較少，故本研究通過比較四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科2015年實體組織診斷淋巴組織增生性病變的FCI結(jié)果與常規(guī)病理活檢結(jié)果，分析兩者之間的一致率，總結(jié)FCI診斷的疾病構(gòu)成情況，并討論FCI在淋巴組織增生性病變病理診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 資料 收集我院2015年1月～2015年12月淋巴組織增生性病變病理標(biāo)本261例，其中淋巴結(jié)活檢標(biāo)本188例，穿刺標(biāo)本(包括活檢穿刺和細胞學(xué)穿刺)47例，術(shù)中冰凍標(biāo)本26例。所有患者均參照 2008年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)診斷[1]。1.2 實驗儀器與試劑 美國BD公司生產(chǎn)6色流式細胞儀；美國BD公司生產(chǎn)的用于臨床熒光標(biāo)記抗體，采用FITC、PE、PE-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7六色熒光標(biāo)記抗體；破膜打孔試劑盒為美國BD公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 熒光抗體的選擇 初篩抗體包括CD45、CD7、CD2、CD3、CD5、CD4、CD8、CD19、CD20、Kappa、Lambda、CD10、CD38、CD56、CD30；進一步分析診斷抗體包括FMC-7、CD23、TCRαβ、TCRγδ、CD138、CD117等。

1.3.2 細胞懸液的制備 將組織剪碎后機械研磨獲得懸浮細胞，200目細胞篩過濾，細胞計數(shù)后1000 rpm離心5 min，PBS清洗3次，每次1000 rpm離心5 min，調(diào)整細胞懸液濃度至每100 μL細胞懸液1～2×105個細胞。

1.3.3 熒光抗體的標(biāo)記 取100 μL細胞懸液，加入六色膜標(biāo)記抗體5 μL，混勻避光孵育5 min后加入500 μL紅細胞裂解液，5 min后加入等量的PBS緩沖液終止裂解紅細胞，1200 rpm離心5 min，PBS清洗3次，每次1200 rpm離心5 min，最后加入200ulPBS緩沖液重懸上機檢測。

1.3.4 結(jié)果分析 設(shè)門及圈定細胞：初篩時淋巴細胞以CD45/SSC 設(shè)門，B細胞以 CD19/SSC 設(shè)門、T細胞以CD3/SSC設(shè)門；FCM 檢測結(jié)果判斷：熒光強在103以上為陽性表達， 102以下為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS軟件進行樣本的統(tǒng)計學(xué)分析，兩組配對計數(shù)資料比較采用 Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FCI檢測結(jié)果與常規(guī)病理活檢結(jié)果比較 261例標(biāo)本中結(jié)果一致的有242例(92.7%)，不一致的有

19例(7.3%)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；檢測結(jié)果間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 常規(guī)活檢與FCI檢測結(jié)果

2.2 兩種方法結(jié)果比較 診斷結(jié)果顯示，反應(yīng)性增生122例；非霍奇金淋巴瘤(NHL)119例，其中B細胞淋巴瘤70例(58.8%)，T細胞淋巴瘤16例(13.4%)，漿細胞腫瘤4例(3.4%)，NK細胞淋巴瘤21例(17.6%)，前體淋巴造血組織腫瘤8例(6.7%)。FCI診斷病例數(shù)由高到低依次為：RH、B細胞淋巴瘤、NK細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、前體淋巴造血組織腫瘤和漿細胞瘤；其中FCI與常規(guī)病理活檢結(jié)果比較，NK細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、前體淋巴造血組織腫瘤和漿細胞瘤的一致率均為100%，RH和B細胞淋巴瘤的一致率分別為92.4%和88.6%，見表2。

表2 FCI與常規(guī)病理活檢結(jié)果比較

2.3 兩種方法診斷結(jié)果一致的B細胞淋巴瘤FCI結(jié)果 B細胞淋巴瘤中，以彌漫大B細胞淋巴瘤為多見(41例，58.6%)；其余依次為CLL/ SLL(5例，7.1%)；濾泡淋巴瘤(5例，7.1%)；套細胞淋巴瘤(4例，5.7%)；另有15例(20%)為未明確分類B細胞淋巴瘤，見表3。B細胞淋巴瘤主要通過Kappa和Lambda輕鏈限制性表達來判定，主要表現(xiàn)為κ/λ比例異常，同時CD5、CD10、FMC7、CD23等或有表達，分析過程見圖1。

表3 B細胞淋巴瘤FCI診斷結(jié)果

注：CLL：慢性淋巴細胞性白血??；SLL：小淋巴細胞淋巴瘤。

圖1 B細胞淋巴瘤FCI分析

Figure 1 Analysis of FCI in B cell lymphoma

2.4 兩種方法診斷結(jié)果一致的T細胞淋巴瘤FCI結(jié)果 16例與常規(guī)病理診斷結(jié)果一致的T細胞淋巴瘤中，以血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤為多見(7例，43.8%)，非特指外周T細胞淋巴瘤4例(25%)，其他T細胞淋巴瘤5例(31.2%)，見表4。T細胞淋巴瘤主要通過CD3、CD5、CD4、CD8等表面抗原的丟失來判定，通過CD3丟失較常見，分析過程見圖2。

表4 T細胞淋巴瘤FCI診斷結(jié)果

圖2 T細胞淋巴瘤FCI分析

Figure 2 Analysis of FCI in T cell lymphoma

2.5 19例兩種方法診斷結(jié)果不一致的可能原因 FCI與常規(guī)病理活檢比較有19例結(jié)果不一致，其中FCI結(jié)果準(zhǔn)確的有8例，均為FCI給出明確結(jié)果，而常規(guī)活檢因為組織取材或制片原因不能明確診斷，其中2例病人再取淋巴結(jié)活檢后結(jié)果與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果一致。FCI結(jié)果不準(zhǔn)確的有8例，4例是因為腫瘤細胞數(shù)量很少，所以沒有檢出明確的抗原異常表達細胞群；3例因為送檢流式細胞術(shù)的組織標(biāo)本壞死重，碎片太多，對結(jié)果造成干擾；1例是由于腫瘤細胞部分累及，取材差異而導(dǎo)致結(jié)果不一致。

3 討論

目前隨著單克隆技術(shù)和熒光素的發(fā)展，流式細胞術(shù)(FCM)在淋巴組織增生性病變病理診斷中應(yīng)用研究越來越廣泛[2]。FCI與傳統(tǒng)的免疫組化相比較，具有快速、敏感及多參數(shù)分析等優(yōu)點[3]，不僅能滿足臨床病理診斷和鑒別診斷的需求，同時還能客觀地進行定性定量分析，因此國際上已把FCI作為淋巴瘤診斷分類的常規(guī)規(guī)范化方法[4-7]。

本研究結(jié)果顯示FCI與常規(guī)病理活檢之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明FCI對淋巴組織增生性病變診斷有很高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，能在病理診斷中常規(guī)應(yīng)用和開展。淋巴組織增生性病變的標(biāo)本來源廣泛，包括手術(shù)切除標(biāo)本、穿刺活檢標(biāo)本以及細胞學(xué)標(biāo)本等。穿刺活檢具有創(chuàng)傷小、快速等優(yōu)點，因此越來越多的患者和醫(yī)師選擇穿刺活檢和穿刺細胞學(xué)進行檢查[8]。但是穿刺標(biāo)本組織較小，在常規(guī)病理組織學(xué)診斷時僅能看到少量淋巴組織，而且有時組織擠壓明顯，不能觀察到病變的生長浸潤模式以及細胞的形態(tài)，從而給病理診斷帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。在本研究中，F(xiàn)CI與常規(guī)病理活檢診斷不一致且FCI診斷正確的8例中有5例為穿刺標(biāo)本。由于流式細胞術(shù)具有較高的敏感性和多參數(shù)分析特點，能充分彌補穿刺標(biāo)本的缺點，因此將流式細胞術(shù)和穿刺活檢及細胞學(xué)聯(lián)合應(yīng)用能提高淋巴組織增生性病變病理診斷的準(zhǔn)確性[9-10]，也能更好的發(fā)揮穿刺活檢和穿刺細胞學(xué)在淋巴組織增生性病變診斷中重要的初篩地位。

淋巴組織增生性病變的流式細胞術(shù)免疫表型分析，在B細胞淋巴瘤中，主要通過Kappa和Lambda輕鏈限制性表達來判定，主要表現(xiàn)為κ/λ值異常[11-13]。T細胞淋巴瘤主要通過部分T細胞表面抗原的丟失來判定。不同種類的淋巴瘤均有不同程度的表達一些抗原，從而表明淋巴瘤的不同成熟階段和不同疾病過程[14-15]。在流式細胞術(shù)分析過程中，我們發(fā)現(xiàn)FCI不僅僅需要觀察主要細胞群的細胞抗原異常表達，同時也應(yīng)該關(guān)注不同F(xiàn)SC和SSC的細胞群，這樣才能避免流式細胞術(shù)的漏診和誤診。

通過對FCI與病理活檢結(jié)果不一致的19例進行分析，其結(jié)果也提示了FCI在實體腫瘤免疫分型中具有一定的局限性。比如當(dāng)標(biāo)本壞死較重，組織碎片會對FCI分析造成干擾[12]，或者當(dāng)送檢組織含有腫瘤細胞成分較少時，F(xiàn)CI未能發(fā)現(xiàn)異常細胞，所以需要結(jié)合組織病理形態(tài)學(xué)綜合分析。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明流式細胞術(shù)是淋巴組織增生性病變病理診斷的重要輔助手段，可提高診斷的準(zhǔn)確性，并可縮短確診時間，應(yīng)予推廣應(yīng)用。

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Application of flow cytometric immunophenotyping in the diagnosis of lymphoid tissue proliferative disorders

DENG Xueqin，WANG Jianchao，ZHAO Sha，et al

(DepartmentofPathology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Objective To investigate the value of flow cytometric immunophenotyping (FCI) in the diagnosis of lymphoid tissue proliferative disorders. Methods We used FCI to analyze 261 cases of lymphoid tissue proliferative disorders, and compared with the result of pathological biopsies. Result There was no statistically difference between FCI and pathological biopsy in diagnosis of lymphoid tissue proliferative disorders. 119 non-Hodgkin lymphoma(NHL) were diagnosed by FCI, including 70 cases of B cell lymphoma, 16 cases of T cell lymphoma, 4 cases of plasma cell neoplasms, 21 cases of NK cell lymphoma, and 8 cases of precursor lymphatic hematopoietic tissue tumors. Diffuse large B cell lymphoma was the common type in B cell lymphoma and angioimmunoblastic T-cell lymphoma was the common type in T cell lymphoma. There were 19 inconsistent cases between FCI and the routine pathological biopsy results.Conclusion This study results suggest that FCI is a very important auxiliary method for diagnosis of lymphoid tissue proliferative disorders, which can improve the accuracy of diagnosis and shorten the diagnostic time. FCI is worthy of application in diagnosis of lymphoid tissue proliferative disorders.

Flow cytometry; Immunophenotype； lymphoma； lymphoid tissue proliferative disorders

國家自然科學(xué)基金青年基金(30900534)

趙莎，副教授，本刊審稿專家，E-mail：HXBLZHAOSHA@126.com

R 733.4

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.004

2016-07-26； 編輯： 黎仕娟)