黎敏

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

MACC1和CIP2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系

黎敏

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

目的檢測(cè)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）蛋白在胃癌病變組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，以及與胃癌各臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步分析MACC1與蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）蛋白表達(dá)是否具有相關(guān)性，評(píng)估胃癌預(yù)后，并為治療提供思路。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)胃癌組織和癌旁正常組織中MACC1蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)差異性。免疫組織化學(xué)法測(cè)定30例胃癌組織和癌旁正常組織中MACC1和CIP2A蛋白的表達(dá)，分析MACC1蛋白與胃癌臨床不同病理特征的關(guān)系，同時(shí)分析MACC1和CIP2A蛋白的相關(guān)性。結(jié)果MACC1蛋白在癌旁正常組織和胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.7%和76.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIP2A蛋白在癌旁正常組織和胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為23.3%和73.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同性別、年齡、組織類型的MACC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同組織分化程度、腫瘤侵潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期的的MACC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MACC1與CIP2A蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論MACC1與CIP2A蛋白呈正相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測(cè)可以判斷患者的預(yù)后。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1蛋白；蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子蛋白；胃癌；預(yù)后

胃癌在消化道腫瘤的發(fā)病率中居首位，患病率高，生存期短，預(yù)后差，總體療效不佳。其預(yù)后與很多因素相關(guān)，如性別、年齡、Borrmann分型、腫瘤細(xì)胞的分化程度、腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、手術(shù)的根治情況、術(shù)后化療的方案及次數(shù)、患者本身對(duì)化療的敏感程度等綜合因素有關(guān)。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）蛋白是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）/C-met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的連接蛋白，起紐帶作用。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的MACC1蛋白表達(dá)高，可作為獨(dú)立的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）蛋白通過(guò)穩(wěn)定c-Myc，促進(jìn)細(xì)胞增殖和錨定獨(dú)立生長(zhǎng)，阻滯衰老和分化來(lái)促進(jìn)體內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。本研究旨在尋找MACC1蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)，以及與CIP2A基因表達(dá)的相關(guān)性及其意義，為識(shí)別與尋找診斷靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本收集

選取2013年4月-2013年10月于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切取的胃癌組織，配對(duì)距癌組織邊緣＞5 cm的正常組織，所有組織經(jīng)病理科蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色證實(shí)，每組30例。樣本離體后一份立即裝入凍存管，30 min內(nèi)迅速放置入-80℃冰箱冷凍保存，另一份石蠟包埋。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）免疫組織化學(xué)二抗試劑盒（SP-0023，美國(guó)Zymed公司），bs-5948R兔抗人CIP2A多克隆抗體、bs-4293R兔抗人MACC1多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司，超純RNA提取試劑盒、引物設(shè)計(jì)為北京德元國(guó)際生物公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)提取組織總RNA， RNA電泳，RNA消化，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)，結(jié)果判定依照實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)最先檢測(cè)的數(shù)據(jù)，按2-△△ct相對(duì)定量公式計(jì)算，各反應(yīng)管Ct值進(jìn)行相關(guān)換算，得到mRNA相對(duì)表達(dá)量。即以正常組織為對(duì)照樣本，求出每種被試目的基因?qū)?yīng)定量值，以便找出目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

F=2-[（待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均值Ct值）-（對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組管家基因平均Ct值）]

1.3.2免疫組織化學(xué)法本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP染色法，即過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈菌卵白素染色法。根據(jù)顯色程度：細(xì)胞無(wú)著色計(jì)0分，弱陽(yáng)性（+）（淡黃色）1分，中度陽(yáng)性（++）（棕黃色）2分，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）（棕黑色）3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞中所占比例：弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%+；中度陽(yáng)性（++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為25%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（+++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%。綜合計(jì)量=弱陽(yáng)性百分比×1+中度陽(yáng)性百分比×2+強(qiáng)陽(yáng)性百分比×3。最終結(jié)果（隨機(jī)觀察≥10個(gè)高倍視野）：0分為陰性（-）；總分值＜1分（+）；總分值1.0～1.5分（++）；總分值＞1.5分（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組無(wú)序計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，兩組等級(jí)計(jì)數(shù)資料等級(jí)強(qiáng)度比較用秩和檢驗(yàn)；用Pearson修正系數(shù)檢驗(yàn)MACC1與CIP2A蛋白的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

胃癌組織MACCl蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（10.75± 0.06），癌旁組織為（1.00±0.06），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=627.996，P=0.000）。

2.2免疫組織化學(xué)法

2.2.1不同組織中MACC1蛋白的表達(dá)MACC1蛋白多表達(dá)于細(xì)胞漿，細(xì)胞核內(nèi)有少量表達(dá)。胃癌組織MACC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為76.7%（23/30），癌旁組織為16.7%（5/30），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.696，P=0.000）。兩組MACCA蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.970，P= 0.000），等級(jí)強(qiáng)度差別明顯。結(jié)果證實(shí)MACC1蛋白在胃癌組織中表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)，在癌旁正常組織中表達(dá)強(qiáng)度弱。見(jiàn)表1和圖1、2。

表1　不同組織中MACC1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度（n=30，例）

圖1　MACC1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)（Elivision×400）

圖2　MACC1蛋白在正常組織中的表達(dá)（Elivision×400）

2.2.2不同組織中CIP2A蛋白的表達(dá)CIP2A蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)，CIP2A蛋白多表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞漿中有少量表達(dá)。胃癌組織CIP2A蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為73.3%（22/30），癌旁組織為23.3%（7/30），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 15.017，P=0.000）。兩組間CIP2A蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.381，P= 0.000），等級(jí)強(qiáng)度差異明顯，表明CIP2A蛋白在胃癌組中的表達(dá)由低到高呈等級(jí)遞增關(guān)系，而在癌旁正常組織中表達(dá)強(qiáng)度由高到低呈等級(jí)遞減關(guān)系。結(jié)果證實(shí)MACC1蛋白在胃癌組織中表達(dá)強(qiáng)，在癌旁正常組織中表達(dá)弱。見(jiàn)表2和圖3、4。

表2　不同組織中CIP2A蛋白的表達(dá)強(qiáng)度（n=30，例）

圖3　CIP2A蛋白在胃癌組織中的表達(dá)（Elivision×400）

圖4　CIP2A蛋白在正常組織中的表達(dá)（Elivision×400）

2.2.3不同病理特征組織中MACC1的表達(dá)根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2010年第7版），收集同期手術(shù)切取的胃癌組織及對(duì)應(yīng)的距離癌組織＞5 cm的癌旁組織各30例，收集臨床資料，對(duì)所收集的胃癌進(jìn)行分期，對(duì)患者臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，男性18例，平均年齡56.5歲；女性12例，平均年齡58.2歲，兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但男性發(fā)病率高于女性。其中，Ⅳ期6例患者已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅲ期12例中有10例患者伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Ⅰ期5例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，T4組7例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，T1組2例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。通過(guò)對(duì)各臨床因素與MACC1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，胃癌的臨床分期、浸潤(rùn)深度、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化的MACC1蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明胃癌組織內(nèi)的MACC1蛋白高表達(dá)，MACC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤的惡性程度相關(guān)，而不同性別、年齡、組織類型組的MACC1蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明腫瘤的發(fā)展與性別、年齡、組織類型無(wú)關(guān)，MACC1蛋白高表達(dá)的患者提示預(yù)后差。見(jiàn)表3。

表3　不同臨床病理特征組織中MACC1的表達(dá)

2.2.4胃癌組織中MACC1與CIP2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性CIP2A蛋白與胃癌的關(guān)系比較明確，CIP2A蛋白與胃癌的惡性程度相關(guān)，在臨床分期晚、組織分化低、有轉(zhuǎn)移的患者癌組織內(nèi)呈高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，惡性程度越高表達(dá)越高。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MACC1蛋白在胃癌組織中同樣高表達(dá)，且與胃癌的惡性程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)30例胃癌組織中，83.3%（25/30）MACC1蛋白和CIP2A蛋白表達(dá)相同。其中，19例MACC1和CIP2A蛋白表達(dá)都為顯性，5例MACC1和CIP2A蛋白表達(dá)都為隱性，通過(guò)Pearson修正系數(shù)檢驗(yàn)胃癌組織中MACC1與CIP2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.478，P= 0.013）。見(jiàn)表4。

表4　胃癌組織中MACC1與CIP2A蛋白表達(dá)的相關(guān)性例

3 討論

CIP2A位于人類3號(hào)染色體上，是蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）的抑癌基因，能夠抑制PP2A對(duì)c-Myc蛋白S62位的去磷酸化作用。c-Myc蛋白是一種癌基因蛋白，位于細(xì)胞核內(nèi)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞快速的繁衍、數(shù)量劇增，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂至衰老的整個(gè)歷程。CIP2A抑制機(jī)體內(nèi)PP2A的抑癌作用，穩(wěn)定的c-Myc蛋白表達(dá)增強(qiáng)可以促進(jìn)細(xì)胞惡變，最后導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[2]。c-Myc可直接影響CIP2A的轉(zhuǎn)錄。CIP2A參與Ras對(duì)c-Myc的穩(wěn)定作用，促進(jìn)c-Myc的表達(dá)。Ras可激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK），使S62磷酸化，同時(shí)激活磷脂酰肌醇-3-激酶，通過(guò)抑制糖原合成激酶-3β抑制T58磷酸化，將c-Myc維持在S62磷酸化和T58去磷酸化狀態(tài)，從而阻斷c-Myc降解，穩(wěn)定c-Myc蛋白。但該過(guò)程中需要CIP2A的共同作用，因?yàn)閮H有ERK不足以穩(wěn)定c-Myc。另外，CIP2A與EGFR-MEK1/2-ERK1/2通路、HGF/c-Met信號(hào)通路均有密切聯(lián)系[3]。有研究表明，CIP2A在人體各種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中起重要作用[4]。CIP2A蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)[5]，針對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向治療研究也越來(lái)越多[6-8]，未來(lái)可能為癌癥帶來(lái)希望。

MACC1蛋白又名為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1，位于人類7號(hào)染色體[9]。MACC1蛋白是HGF/C-met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的連接蛋白，起重要的橋梁作用，MACC1蛋白通過(guò)激活c-Met，協(xié)同調(diào)節(jié)控制HGF/c-Met信息傳輸，產(chǎn)生MACC1、HGF/c-Met信號(hào)路線的交互饋環(huán)路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡變、侵襲、轉(zhuǎn)移的進(jìn)展[10-11]。實(shí)驗(yàn)證明在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶中，MACC1蛋白異常高表達(dá)，其調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、遷移，與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)30例胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)MACC1蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，MACC1蛋白在胃癌組織中同樣高表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，與胃癌各臨床病理特征的關(guān)系中，MACC1蛋白與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度等因素密切相關(guān)，而與性別、年齡、組織類別無(wú)關(guān)，而在MACC1蛋白高表達(dá)的患者中，多數(shù)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，提示MACC1蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用，表明MACC1蛋白可以作為評(píng)估胃癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

MACC1和CIP2A兩種蛋白對(duì)胃癌都有突出的表現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)，如果對(duì)兩種蛋白所占比例做出確切檢測(cè)，將可以判斷出病情的惡性程度，并以此判斷患者的預(yù)后。

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（童穎丹 編輯）

Expressions of MACC1 and CIP2A proteins and their correlations with prognosis of gastric carcinoma

Min Li
(Department of Digestive Diseases,the First Affiliated Hospital Of Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia 014010,China)

Objective To investigate the expression of metastasis-associated in colon cancer 1(MACC1) protein in gastric cancerous tissue and adjacent noncancerous tissue and its relationships with the clinical pathological factors and the cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A(CIP2A)protein expression,and evaluate the prognosis so as to provide the train of thought for the treatment of gastric cancer.Methods RTPCR was used to assay the expression of MACC1 protein in gastric cancerous tissue and adjacent noncancerous tissue.Immunohistochemical assay was used to detect the expressions of MACC1 and CIP2A proteins in gastric cancerous tissue and adjacent noncancerous tissue of 30 cases.The relationships of the expression of MACC1 protein with clinical pathological factors and CIP2A protein were analyzed.Results The positive rate of MACC1 in the gastric cancerous tissue and the adjacent noncancerous tissue was 16.7%and 76.7%respectively,the difference was statistically significant.The positive rate of CIP2A protein expression in the gastric cancerous tissue and the adjacent noncancerous tissue was 23.3%and 73.3%respectively with significant difference.The expression of MACC1 protein was not significantly different between the patients with different gender,different age or different histological types of gastric cancers.However,the patients with different depth of tumor invasion,different degree of cancer differentiation,different degree of lymph node metastasis and different clinical stage had significant differences in MACC1 expression.MACC1 and CIP2A protein ex－pressions were positively correlated.Conclusions MACC1 protein expression is positively correlated with CIP2A protein expression,combined detection of both can help to determine the prognosis of the patients.

metastasis-associated in colon cancer 1 protein;cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A protein;gastric carcinoma;prognosis

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.005

1005-8982（2016）21-0025-05

2016-01-25