毛亞男,王雯,王東,張波
(1.安徽醫(yī)科大學(xué),安徽 合肥 230032;2.空軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京 100142)
免疫抑制劑對酵母聚糖誘導(dǎo)巨噬細胞Dectin-1、Toll樣受體2及腫瘤壞死因子-α表達的影響
毛亞男1,王雯2,王東2,張波1
(1.安徽醫(yī)科大學(xué),安徽 合肥 230032;2.空軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科,北京 100142)
目的研究霉酚酸酯和環(huán)孢素A對酵母聚糖(Zymosan A)誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細胞模式識別受體Dectin-1、Toll樣受體2(TLR2)表達及細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)釋放的影響。方法體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞,分別給予不同濃度的霉酚酸酯、環(huán)孢素A預(yù)處理細胞24 h,再利用100μg/ml Zymosan A單獨刺激細胞,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和流式細胞術(shù)檢測細胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平的變化,酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測上清液中TNF-α濃度的變化。結(jié)果Zymosan A單獨作用巨噬細胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平明顯上調(diào),TNF-α濃度升高(P<0.05)。Zymosan A作用于霉酚酸酯或環(huán)孢素A預(yù)處理24 h的巨噬細胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平較Zymosan A單獨作用組明顯下調(diào),TNF-α分泌量減少(P<0.05)。結(jié)論霉酚酸酯和環(huán)孢素A抑制巨噬細胞Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯,并下調(diào)TNF-α的釋放,降低機體對真菌病原體的清除能力,這可能是應(yīng)用霉酚酸酯和環(huán)孢素A引起難控性真菌感染的機制之一。
霉酚酸酯;環(huán)孢素A;酵母聚糖;模式識別受體;細胞因子
免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用于自身免疫病及移植抗宿主病的預(yù)防和治療,目的在于控制免疫反應(yīng)的加劇[1]。然而長期接受大劑量免疫抑制劑治療,機體免疫功能遭到嚴重破壞,對外界病原菌的抵抗力減弱,極易發(fā)生難以控制的感染性疾病,尤其是侵襲性真菌感染,嚴重威脅免疫抑制患者的生存。巨噬細胞等固有免疫細胞通過模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)區(qū)分自我和非我,識別并結(jié)合微生物表面病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)啟動快速的天然免疫防御反應(yīng),進而觸發(fā)持久的特異性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2],介導(dǎo)機體對致病真菌的殺滅和清除。環(huán)孢素A和霉酚酸酯是臨床最常用的兩種免疫抑制劑,與真菌感染的發(fā)病率和死亡率有著密切的聯(lián)系。本研究通過體外模擬真菌感染試驗,觀察環(huán)孢素A和霉酚酸酯對酵母聚糖(Zymosan A)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞Dectin-1、Toll樣受體2(Toll-like receptors 2,TLR2)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)表達的影響,從模式識別水平探討環(huán)孢素A、霉酚酸酯與真菌感染之間的關(guān)系。
1.1細胞培養(yǎng)
小鼠RAW264.7巨噬細胞購自南京凱基生物公司細胞庫。復(fù)蘇細胞,用含10%新生牛血清的洛斯維·帕克紀念研究所(roswell park memorial institute,RPMI)1640培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中培養(yǎng),0.25%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)胰蛋白酶消化傳代2~3次后,以1×105個/ml密度接種于35 mm培養(yǎng)皿。
1.2主要試劑
Zymosan A購自美國Sigma公司,超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司,抗小鼠PE-Dectin-1抗體、抗小鼠PE-TLR2抗體購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司,TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自美國R&D公司,霉酚酸酯、環(huán)孢素A購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。
1.3實驗分組
實驗分霉酚酸酯+Zy組、環(huán)孢素A+Zy組、陽性對照組(Zy組)和空白對照組,其中霉酚酸酯+Zy組、環(huán)孢素A+Zy組又分為低濃度、中濃度和高濃度3個組別。具體步驟如下:①向各實驗組的培養(yǎng)皿中分別加入霉酚酸酯(0.10、0.25和0.50μg/ml)或環(huán)孢素A(2.5、5.0和10.0μg/ml)預(yù)處理;陽性對照組和空白對照組加入等量完全培養(yǎng)基,24 h后棄凈原培養(yǎng)基。②空白對照組給予等量完全培養(yǎng)基,其余各組分別加入100μg/ml Zymosan A刺激細胞[3]。
1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測Dectin-1、TLR2 mRNA表達
Zymosan A干預(yù)后4 h后,按照超純RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA,紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。按照世紀康為HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒要求進行反轉(zhuǎn)錄,聚合酶鏈反應(yīng)擴增條件為:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,共40個循環(huán)。引物合成由上海生物工程股份有限公司設(shè)計完成,序列如下:①Dectin-1正向引物:5'-AGACTTCAGCACTCAAGACATCCA-3',反向引物:5'-CAGGATTCCTAAACCCACTGCAA-3';②TLR2正向引物:5'-CCCACTTCAGGCTCTTTGAC-3',反向引物:5'-GCCACTCCAGGTAGGTCTTG-3';③脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk);④髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88);⑤β-actin正向引物:5'-TGAAGATCAAGATCATTGCT CCTCC-3',反向引物:5'-CTAGAAGCATTTGCGGTG GACGATG-3'。待反應(yīng)結(jié)束后,采用2-△△CT進行相對定量分析。
1.5流式細胞術(shù)檢測Dectin-1、TLR2蛋白的表達
Zymosan A作用細胞3和6h后,用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化細胞并轉(zhuǎn)移至流式管中,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)漂洗后重懸細胞,分別加5μl抗小鼠PE-Dectin-1抗體和抗小鼠PE-TLR2抗體,室溫避光20min進行熒光標(biāo)記染色,PBS漂洗離心,棄掉殘余抗體,上機檢測各組細胞的平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)。
1.6ELISA檢測TNF-α的表達
Zymosan A作用細胞12 h后收集上清液,按照TNF-α試劑盒說明書,檢測各組上清液中TNF-α的濃度。
1.7統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,兩組間比較用獨立樣本t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,多組間的兩兩比較用Bonferroni法檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細胞Dectin-1和TLR2 mRNA表達的影響
Zymosan A單獨RAW264.7巨噬細胞4 h后Dectin-1(1.757±0.020)和TLR2(2.970±0.649)表達水平與空白對照組(1.000±0.000)比較,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=99.546和74.816,P=0.000),Zymosan A上調(diào)巨噬細胞Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄。就Dectin-1和TLR2 mRNA表達水平而言,霉酚酸酯0.10μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.25μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、Zy組4組比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.652和54.953,P=0.000)。環(huán)孢素A 2.5μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 5.0μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組、Zy組Dectin-1和TLR2 mRNA表達水比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=138.202和34.434,P=0.000)。應(yīng)用中、高濃度的霉酚酸酯和環(huán)孢素A預(yù)先處理RAW264.7巨噬細胞再受到Zymosan A刺激后,與單獨應(yīng)用Zymosan A刺激組比較,經(jīng)Bonferroni法檢驗,Dectin-1 mRNA表達降低(P<0.05);3種濃度的霉酚酸酯和環(huán)孢素A預(yù)處理細胞后均能下調(diào)Zymosan A誘導(dǎo)的TLR2 mRNA的表達水平(P<0.05)。見圖1和表1、2。
圖1 霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7細胞Dectin-1、TLR2 mRNA表達的影響(n=6±s)
2.2霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細胞Dectin-1和TLR2蛋白表達的影響
空白對照組Dectin-1蛋白免疫熒光強度為(32.483±2.597),ZymosanA單獨刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞3 h后Dectin-1蛋白免疫熒光強度為(47.060±3.310),經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t= 6.746,P=0.003),Zymosan A促進細胞表面Dectin-1蛋白表達。霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組、Zy組的Dectin-1蛋白MFI比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.109,P=0.000)。預(yù)先給予0.50μg/ml霉酚酸酯或10.0μg/ml環(huán)孢素A處理后,再受到Zymosan A刺激的RAW264.7細胞表面Dectin-1蛋白熒光強度分別為(22.967±2.098)和(23.193±2.852),低于Zymosan A單獨刺激組(P<0.01)。給予Zymosan A單獨作用6 h后,巨噬細胞表面TLR2免疫熒光強度(776.453±29.847)高于空白對照組(549.153±35.424),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t= 15.018,P=0.003);霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組、Zy組的TLR2蛋白MFI比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=34.434,P= 0.000)。MMF 0.50μg/ml+Zy組和CsA10.0μg/ml+ Zy組的TLR2免疫熒光強度分別為(578.697±25.382)和(597.763±25.113),與Zymosan A單獨作用組比較,經(jīng)Bonferroni法檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2和表3、4。
表1 霉酚酸酯對Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達的影響(n=6±s)
表1 霉酚酸酯對Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達的影響(n=6±s)
注:P1:與Zy組的Dectin-1 mRNA比較;P2:與Zy組的TLR2 mRNA比較
組別Dectin-1 mRNAP1值TLR2 mRNAP2值Zy組1.757±0.020-2.970±0.649-MMF 0.10μg/ml+ Zy組1.578±0.2611.0001.846±0.1690.000 MMF 0.25μg/ml+ Zy組1.013±0.2760.0001.368±0.2130.000 MMF 0.50μg/ml+ Zy組1.063±0.3430.0011.530±0.3250.000
表2 環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達的影響(n=6±s)
表2 環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2 mRNA表達的影響(n=6±s)
注:P1:與Zy組的Dectin-1 mRNA比較;P2:與Zy組的TLR2 mRNA比較
組別Dectin-1 mRNAP1值TLR2 mRNAP2值Zy組2.009±0.209-1.980±0.162-CsA 2.5μg/ml+ Zy組1.751±0.2740.1381.678±0.2220.018 CsA 5.0μg/ml+ Zy組0.907±0.1100.0001.303±0.0780.000 CsA 10.0μg/ml+ Zy組0.118±0.0380.0011.151±0.1280.000
圖2 霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7細胞Dectin-1和TLR2蛋白的影響
2.3霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α的影響
空白對照組可檢測到低水平TNF-α[(720.450± 61.642)pg/ml],Zymosan A共培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細胞分泌TNF-α水平為(1 908.752±32.070)pg/ml,經(jīng)t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=34.203,P=0.003),Zymosan A能夠促進TNF-α的表達。霉酚酸酯0.10μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.25μg/ml+Zy組、霉酚酸酯0.50μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A2.5μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 5.0μg/ml+Zy組、環(huán)孢素A 10.0μg/ml+Zy組與、Zy組的TNF-α分泌水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=675.899,P=0.000)。不同濃度的環(huán)孢素A和霉酚酸酯均能抑制Zymosan A誘導(dǎo)的TNF-α的釋放水平,其中大劑量的環(huán)孢素A(10.0μg/ml)抑制作用最為明顯。見圖3和表5。
表3 Zymosan(100μg/ml)對巨噬細胞表達Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響(n=3±s)
表3 Zymosan(100μg/ml)對巨噬細胞表達Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響(n=3±s)
注:t1、P1:與空白對照組的Dectin-1蛋白比較;t2、P2:與空白對照組的TLR2蛋白比較
組別Dectin-1蛋白t1值P1值TLR2蛋白t2值P2值空白對照組32.483±2.5976.7460.003549.153±35.42415.0180.003 Zy組47.060±3.310776.453±29.847
表4 霉酚酸酯、環(huán)孢素A(μg/ml)對Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響(n=3±s)
表4 霉酚酸酯、環(huán)孢素A(μg/ml)對Zymosan A誘導(dǎo)Dectin-1、TLR2蛋白MFI的影響(n=3±s)
注:P1:與Zy組的Dectin-1蛋白比較;P2:與Zy組的TLR2蛋白比較
組別Dectin-1蛋白P1值TLR2蛋白P2值Zy組47.060±3.310-776.453±29.847-MMF 0.50μg/ml+Zy組22.967±2.0980.000578.697±25.3820.000 CsA10.0μg/ml+Zy組23.193±2.8520.000597.763±25.1130.000
圖3 霉酚酸酯對Zymosan A誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞TNF-α分泌的影響(n=4±s)
表5 霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)TNF-α(pg/ml)分泌的影響(n=4,pg/ml±s)
表5 霉酚酸酯、環(huán)孢素A對Zymosan A誘導(dǎo)TNF-α(pg/ml)分泌的影響(n=4,pg/ml±s)
注:P1:與Zy組比較;P2:與CsA 10.0μg/ml+Zy組比較
組別TNF-αP1值P2值Zy組MMF 0.10μg/ml+Zy組1 908.752±32.070 1 714.344±26.852 --0.0000.000 MMF 0.25μg/ml+Zy組MMF 0.50μg/ml+Zy組1 701.978±41.446 1 706.031±26.786 0.000 0.000 0.000 0.000 CsA 2.5μg/ml+Zy組1 665.385±17.1970.0000.000 CsA 5.0μg/ml+Zy組1 744.354±25.4090.0000.000 CsA 10.0μg/ml+Zy組449.482±70.6390.0000.000
免疫抑制劑的應(yīng)用為器官移植后的抗宿主排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、非自身免疫性疾病,如腫瘤和過敏性疾病等的預(yù)防及治療提供了有效的方法和手段[4]。然而,因免疫功能過度受損引發(fā)的感染性疾病,尤其是侵襲性真菌感染,一直是免疫抑制人群面臨的重要問題。盡管新的抗真菌藥物已被研發(fā)出來,但是因為早期診斷困難,病情進展速度快,且發(fā)病率和病死率呈逐年攀升趨勢,因此侵襲性真菌病仍嚴重威脅著免疫低下患者的生存。
外來病原體入侵機體時,啟動先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)形成穩(wěn)固復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)清除致病真菌。巨噬細胞等固有免疫細胞是先天性免疫系統(tǒng)中的“前哨兵”。通過細胞表面或內(nèi)部的PRRs識別暴露于病原微生物表面的PAMPs,啟動快速有機的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,分泌大量炎癥細胞因子和趨化因子,驅(qū)動并局限中性粒細胞等炎癥細胞到達感染部位,觸發(fā)細胞的吞噬作用、呼吸爆發(fā)等功能,進而啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng),促進機體對真菌病原體的清除[5-6]。大量研究發(fā)現(xiàn),與真菌感染密切相關(guān)的PPRs,主要涉及C型凝集素受體家族(C-type lectin family,CLRs)和Toll樣受體家族[7],其中尤以Dectin-1和TLR2的研究最為廣泛,是近年來真菌相關(guān)免疫識別機制的研究熱點。
Zymosan A來源于釀酒酵母細胞壁,富含β-葡聚糖和甘露聚糖,常被用來模擬體外真菌感染的免疫學(xué)研究。Dectin-1和TLR2協(xié)同參與Zymosan A的免疫識別過程,通過激活下游的Syk和MyD88信號通路,最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子活性增強并釋放大量的細胞因子TNF-α,協(xié)同放大炎癥反應(yīng)[8]。本實驗結(jié)果表明,在Zymosan A刺激小鼠巨噬細胞的早期,可顯著上調(diào)受體Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達水平,促進細胞因子TNF-α的釋放,最終誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
環(huán)孢素A和霉酚酸酯目前是腎移植患者術(shù)后最常用的兩種免疫抑制劑,在減少移植物抗宿主反應(yīng)促進移植術(shù)后移植物存活的同時,也往往能夠引起患者感染癥狀加重,甚至發(fā)生難控性真菌感染,引起病死率顯著升高。目前,有關(guān)環(huán)孢素A和霉酚酸酯對病原體識別過程的影響,具體機制尚不清楚。特異性T淋巴細胞功能調(diào)節(jié)藥環(huán)孢素A,能夠選擇性抑制T淋巴細胞相關(guān)因子如IL-2、TNF-α的分泌,同時削弱宿主的體液/細胞免疫。此外,環(huán)孢素A發(fā)揮免疫抑制功能的具體機制可能也涉及到模式識別水平。GREENBLATT等[9]認為,環(huán)孢素A通過抑制Dectin-1通路下調(diào)細胞因子IL-10的表達,來調(diào)控對中性粒細胞的抗真菌免疫功能,而與TLR2/Myd88通路無關(guān),并由此得出Dectin-1是環(huán)孢素A作用機制的上游元件。洪英禮等[10]通過實驗觀察到,與空白對照組大鼠比較,皮下注射環(huán)孢素A的大鼠TLR2和TLR4 mRNA和蛋白水平明顯升高。而本研究結(jié)果則顯示,中濃度和高濃度的環(huán)孢素A能夠抑制Zymosan A激活Dectin-1 mRNA和蛋白水平的表達,低、中、高3種濃度的環(huán)孢素A均能下調(diào)Zymosan A誘導(dǎo)的TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯,且具有一定的劑量依賴性。本實驗結(jié)果還表明,環(huán)孢素A能夠抑制Zymosan A誘導(dǎo)的TNF-α的釋放,大劑量的環(huán)孢素作用尤為明顯。由此筆者推測環(huán)孢素A能同時抑制Dectin-1/Syk和TLR2/Myd88信號通路,抑制炎癥細胞因子TNF-α的分泌。霉酚酸酯是一種具有抗代謝功能及強效免疫抑制功能的霉酚酸半合成物,其有效活性成分為霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)。前期研究發(fā)現(xiàn),霉酚酸酯主要通過抑制T/B淋巴細胞增殖,并減少B淋巴細胞分泌相關(guān)抗體發(fā)揮強效、選擇性的免疫抑制功能[11],而關(guān)于霉酚酸酯是否影響機體模式識別功能的文獻報道十分罕見。本研究結(jié)果表明,與同環(huán)孢素作用相似,霉酚酸酯也能夠下調(diào)正常狀態(tài)細胞Dectin-1、TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯,對Zymosan A誘導(dǎo)的Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達也表現(xiàn)出一定的抑制作用,降低TNF-α的釋放水平,從而抑制機體免疫防御機制被激活。
筆者推測霉酚酸酯和環(huán)孢素A通過下調(diào)激活狀態(tài)下的模式識別受體Dectin-1和TLR2的轉(zhuǎn)錄和翻譯,抑制巨噬細胞炎癥細胞因子TNF-α的釋放,導(dǎo)致機體處于免疫耐受狀態(tài),降低機體對真菌病原體的敏感性,無法有效地清除入侵的真菌病原體,這可能是免疫抑制劑霉酚酸酯和環(huán)孢素A誘導(dǎo)感染加重,甚至難控性侵襲性真菌感染的發(fā)病機制之一。除環(huán)孢素A和霉酚酸酯外,其他種類免疫抑制劑誘發(fā)真菌感染的發(fā)病機制是否與調(diào)節(jié)Dectin-1和TLR2信號通路的激活相關(guān),尚需要體內(nèi)外基礎(chǔ)實驗和臨床實驗的進一步驗證。通過探討免疫抑制劑在受體識別過程中的重要靶點,揭示免疫抑制劑加重真菌感染的具體發(fā)病機制,為將來研究預(yù)防和控制免疫抑制患者并發(fā)真菌感染的靶向藥物,改善臨床預(yù)后提供一定的理論和實踐意義。
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(童穎丹 編輯)
Effect of immunosuppressants on Zymosan A-induced expressions of Dectin-1,TLR2 and TNF-alpha in macrophages
Ya-nan Mao1,Wen Wang2,Dong Wang2,Bo Zhang1
(1.Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230032,China;2.Department of Respiratory Medicine,General Hospital of Chinese Air Force,Beijing 100142,China)
Objective To study the effects of Mycophenolate mofetil and Cyclosporin A on Zymosan A-induced expressions of Dectin-1,Toll-like receptor 2(TLR2)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)in RAW264.7 macrophages.Methods Duringin vitroculture,RAW264.7 macrophages were pre-treated with different dosages of Mycophenolate mofetil and Cyclosporine A for 24 h,and then stimulated with 100 μg/ml of Zymosan A alone.RT-PCR was used to detect the expressions of Dectin-1 and TLR2 mRNAs in RAW264.7 macrophages and flow cytometry was used to detect the average fluorescence intensity of Dectin-1 and TLR2proteins.TNF-α level was measured by enzyme-linkedimmunosorbentassay.ResultsThe expressions of Dectin-1 and TLR2 mRNAs and proteins,as well as the concentration of TNF-α increased significantly in the Zymosan A+macrophage group(P<0.05).Mycophenolate mofetil and Cyclosporin A inhibited the expressions of Zymosan A-induced Dectin-1 and TLR2 mRNAs and proteins in various degrees and reduced the secretion of cytokine TNF-α(P<0.05).Conclusions Mycophenolate mofetil and Cyclosporin A reduce the transcription and translation of Dectin-1 and TLR2 and the secretion of the inflammatory cytokine TNF-α induced by Zymosan A,aggravating infection by inhibiting the body's ability to recognize and remove the fungal pathogens.It is probably one of the key mechanisms that Mycophenolate mofetil andCyclosporin A cause refractory fungal infection.
Mycophenolate mofetil;Cyclosporin a;Zymosan a;pattern-recognition receptors;cytokine
R96
A
10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.003
1005-8982(2016)21-0013-06
2016-04-06
張波,E-mail:zhangbohuxi@sina.com