張露，李俊敏，梁銳，張博愛(ài)

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052）

血管性癡呆大鼠海馬區(qū)pro-BDNF、截短型BDNF、mBDNF的變化及與認(rèn)知的關(guān)系

張露1，李俊敏1，梁銳2，張博愛(ài)1

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052）

目的探討血管性癡呆（VD）大鼠海馬中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體蛋白（pro-BDNF）、成熟腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mBDNF）、截短型腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）變化及與認(rèn)知功能的關(guān)系。方法健康雄性SD大鼠120只，6月齡，體重350 g左右，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，模型組結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組除不結(jié)扎血管外余同模型組，模型組和假手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為2、4、8和12周4個(gè)時(shí)間，水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選造模成功大鼠，免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)假手術(shù)組及造模成功的大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬中pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF變化。結(jié)果術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠的潛伏期均較假手術(shù)組延長(zhǎng)（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示模型組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)改變、數(shù)量減少、BDNF表達(dá)下降。術(shù)后模型組pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF較假手術(shù)組降低（P＜0.05），pro-BDNF水平下降趨勢(shì)較緩慢，截短型BDNF水平下降趨勢(shì)在缺血早期變化顯著，后期變化緩慢；mBDNF水平下降趨勢(shì)在缺血早期變化不明顯，后期變化顯著。結(jié)論慢性缺血VD大鼠海馬區(qū)pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF均有改變，3者比例的改變可能與VD大鼠認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

腦缺血；海馬；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體蛋白；截短型腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；成熟型腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近期研究發(fā)現(xiàn)，BDNF在哺乳動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子前體蛋白（pro-BDNF）的形式合成。pro-BDNF生成后，在細(xì)胞內(nèi)外通過(guò)不同的酶水解生成成熟的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（maturebrain-derivedneurotrophicfactor，mBDNF）和截短型BDNF[1]。以前認(rèn)為pro-BDNF和截短型BDNF為mBDNF產(chǎn)生過(guò)程中的中間產(chǎn)物，沒(méi)有生物學(xué)活性，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其具有生物學(xué)功能。pro-BDNF可誘導(dǎo)樹(shù)突分支和樹(shù)突棘的密度減小，負(fù)性調(diào)節(jié)突觸可塑性，易化長(zhǎng)時(shí)程抑制，其表達(dá)的變化與情感、認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶損害的神經(jīng)、精神性疾病，如阿爾茨海默病、精神分裂癥和嚴(yán)重抑郁障礙等有關(guān)[2-3]。而mBDNF可促進(jìn)神經(jīng)元的存活、正性調(diào)節(jié)突觸可塑性，誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，有研究表明其與認(rèn)知功能密切相關(guān)，能明顯改善癡呆大鼠的認(rèn)知功能[4-5]。截短型BD NF作用機(jī)制尚不明確，但近期有研究發(fā)現(xiàn)截短型BDNF血清水平升高與精神分裂癥患者的認(rèn)知功能減退有關(guān)系[6]。研究結(jié)果均提示，pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF可能與認(rèn)知功能有關(guān)，目前，國(guó)內(nèi)外研究血管性癡呆（Vasculardementia，VD）及BDNF均集中在mBDNF，關(guān)于pro-BDNF及截短型BDNF尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討pro-BDNF、mBDNF、截短型BDNF與VD大鼠認(rèn)知障礙的關(guān)系，以及3者含量比例的變化對(duì)認(rèn)知的影響，為VD發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD雄性大鼠120只，6個(gè)月齡，體重350 g左右，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)常溫下配方飼料喂養(yǎng)，自由飲食水。適應(yīng)環(huán)境1周后實(shí)驗(yàn)，每組取2、4、8和12周4個(gè)時(shí)間。

1.1.2主要試劑Anti-BDNF（兔抗大鼠）（美國(guó)Abcam公司），山羊抗兔免疫球蛋白G（武漢博士德公司），免疫組織化學(xué)法試劑盒（北京博奧森公司），兔抗大鼠β-actin、聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量試劑盒、放射免疫沉淀裂解液等試劑均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Morris水迷宮儀購(gòu)自北京碩林宛科技有限公司，高速低溫離心機(jī)購(gòu)自上海手術(shù)器械廠，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞典Tecan公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，眼科鑷、眼科剪、無(wú)菌線、縫合針等購(gòu)自上海手術(shù)器械廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1VD模型復(fù)制參照馬興榮等[7]的方法復(fù)制腦缺血大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，去毛消毒后，沿頸正中切開(kāi)，逐層鈍性分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，分別結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和近心端，確保阻斷頸總動(dòng)脈血流后縫合皮膚。假手術(shù)組動(dòng)物除不結(jié)扎頸總動(dòng)脈外，余過(guò)程與模型組相同。

1.3.2行為學(xué)評(píng)價(jià)及造模成功的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后2、4、8和12周開(kāi)始，分別將各組動(dòng)物置于Morris水迷宮中進(jìn)行定位導(dǎo)航訓(xùn)練4 d，每天訓(xùn)練3次，每次在不同的入水點(diǎn)訓(xùn)練120 s，第5天分別記錄每只動(dòng)物的潛伏期，潛伏期越短，路程越近，說(shuō)明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力越好[8]。以第5天假手術(shù)組大鼠潛伏期的均值為參考值，計(jì)算模型組大鼠第5天的平均潛伏期與參考值之差占該大鼠平均潛伏期時(shí)間的比值，比值＞20%為認(rèn)知功能障礙大鼠，潛伏期越長(zhǎng)認(rèn)知損害越嚴(yán)重[8]。

1.3.3BDNF的免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠于各時(shí)間點(diǎn)麻醉，暴露心臟，生理鹽水快速灌注至流出無(wú)血色液體，4%多聚甲醛灌注固定，充分將前液置換后開(kāi)顱取腦，放入4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，取海馬區(qū)切片。依次烤片、脫蠟水化、抗原修復(fù)、封閉，一抗（1∶300）孵育4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。磷酸緩沖鹽溶液代替一抗設(shè)陰性對(duì)照組。倒置顯微鏡觀察神經(jīng)元變化。

1.3.4蛋白樣品的制備及Western blot檢測(cè)于各時(shí)間點(diǎn)冰上取出大鼠海馬，加組織裂解液，回旋振蕩器勻漿后冰上裂解20 min，14 000 g，4℃離心10 min，取上清液，二喹啉甲酸法測(cè)蛋白濃度后加上樣緩沖液100℃變性5 min后置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩estern blot檢測(cè)：等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉，兔抗大鼠BDNF抗體（1∶2 000）4℃過(guò)夜，HRP-山羊抗兔抗體（1∶10 000）室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光，定影顯影。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照組，掃描膠片后用Image J分析條帶。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，模型組與假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的比較，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，模型組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的比較，用單因素方差分析，方差齊，方差分析有顯著性時(shí)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1VD模型復(fù)制結(jié)果

復(fù)制模型組大鼠65只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共死亡16只；復(fù)制假手術(shù)組大鼠55只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共死亡4只。

2.2各組大鼠行為學(xué)改變

模型組大鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，出現(xiàn)一定的認(rèn)知功能障礙。模型組內(nèi)比較行單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 14.63，P=0.000），表明隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，認(rèn)知功能障礙逐漸加重。見(jiàn)表1。

表1　模型組與假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)潛伏期比較（n=12，s±s）

表1　模型組與假手術(shù)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)潛伏期比較（n=12，s±s）

注：1）與術(shù)后2周比較，P＜0.05；2）與術(shù)后4周比較，P＜0.05；3）與術(shù)后8周比較，P＜0.05

組別2周4周8周12周模型組22.54±4.62 39.58±17.011）53.26±10.511）69.60±11.221）2）3）假手術(shù)組13.99±4.9115.47±6.5915.24±3.9118.65±4.52 t值2.8362.9557.5799.417 P值0.0220.0180.0000.000

圖1　大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)（免疫組織化學(xué)法）

2.3大鼠海馬區(qū)BDNF的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)示模型組海馬區(qū)神經(jīng)元胞體變大，輪廓清晰度減退，神經(jīng)元數(shù)量減少，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞陽(yáng)性率降低越明顯。見(jiàn)圖1。

Western blot檢測(cè)：①組間比較。模型組pro-BDNF在缺血早期減少不明顯，缺血晚期明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；截短型BDNF在缺血早期就開(kāi)始減少（P＜0.05）；mBDNF在缺血晚期明顯減少（P＜0.05），早期減少不明顯。②組內(nèi)比較。假手術(shù)組組內(nèi)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組組內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，模型組pro-BDNF的下降趨勢(shì)較緩慢（相鄰時(shí)間點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；截短型BDNF的下降趨勢(shì)在2和4周間最明顯（P＜0.05）；mBDNF的下降趨勢(shì)在8周后較明顯（P＜0.05）。見(jiàn)圖2和表2～4。

圖2　兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)BDNF相對(duì)灰度值比較（n=6±s）

表2　兩組大鼠的pro-BDNF表達(dá)比較（n=6±s）

表2　兩組大鼠的pro-BDNF表達(dá)比較（n=6±s）

注：模型組內(nèi)方差分析：F=10.415，P=0.000。1）與術(shù)后2周比較，P＜0.05；2）與術(shù)后4周比較，P＜0.05

組別2周4周8周12周模型組0.644±0.078 0.590±0.068 0.480±0.0091）2）0.376±0.0831）2）假手術(shù)組0.658±0.055 0.664±0.0590.654±0.0600.666±0.051 t值0.3281.8303.3766.667 P值0.7510.1050.0100.000

表3　兩組大鼠的截短型BDNF表達(dá)比較（n=6，±s）

表3　兩組大鼠的截短型BDNF表達(dá)比較（n=6，±s）

注：模型組內(nèi)方差分析：F=8.978，P=0.001。1）與術(shù)后2周比較，P＜0.05；2）與術(shù)后4周比較，P＜0.05

組別2周4周8周12周模型組0.350±0.071 0.264±0.0521）0.220±0.0551）0.172±0.0441）2）假手術(shù)組0.372±0.0540.366±0.0680.380±0.0540.374±0.060 t值0.5552.6684.6386.036 P值0.5940.0280.0020.000

表4　兩組大鼠的mBDNF表達(dá)比較（n=6±s）

表4　兩組大鼠的mBDNF表達(dá)比較（n=6±s）

注：模型組內(nèi)方差分析：F=15.907，P=0.000。1）與術(shù)后2周比較，P＜0.05；2）與術(shù)后4周比較，P＜0.05；3）與術(shù)后8周比較，P＜0.05

組別2周4周8周12周模型組0.530±0.056 0.470±0.061 0.386±0.0621）2）0.296±0.0491）2）3）假手術(shù)組0.508±0.122 0.506±0.120 0.508±0.1280.522±0.134 t值0.3690.5981.9193.551 P值0.7220.5660.0910.007

3 討論

既往研究表明，大鼠2VO術(shù)后2周海馬血流量下降至78.4%，術(shù)后4周下降至66.3%，術(shù)后8周血流量下降約4.00%，腦低血流狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槁誀顟B(tài)[9-10]，而慢性腦缺血又是VD最常見(jiàn)的病因[11]，因此以2VO大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)模擬VD。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Morris水迷宮測(cè)量大鼠逃避潛伏期來(lái)評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在腦缺血2周時(shí)已經(jīng)有認(rèn)知功能損傷，且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的認(rèn)知功能下降越明顯，與之前的研究報(bào)道一致[12]。

本實(shí)驗(yàn)中筆者通過(guò)免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)VD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元外形發(fā)生改變，總BDNF的表達(dá)有變化，且缺血時(shí)間越長(zhǎng)，總BDNF水平越低。推測(cè)海馬供血不足會(huì)使海馬區(qū)總BDNF含量減少，并對(duì)海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定的影響。pro-BDNF和mBDNF的比例在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段是不同的，pro-BDNF的比例在新生兒期最高；其次是青春期；成年期最低[13]。近期發(fā)現(xiàn)，pro-BDNF廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且在老齡大鼠海馬中大量聚集[14]。但截短型BDNF水平的變化尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)BDNF各亞型在術(shù)后未見(jiàn)明顯變化，推測(cè)在6～10個(gè)月齡的大鼠海馬區(qū)BDNF各亞型的水平基本穩(wěn)定。模型組大鼠海馬區(qū)pro-BDNF、截短型BDNF和mBDNF表達(dá)均發(fā)生改變，但變化趨勢(shì)不同。腦缺血8周開(kāi)始pro-BDNF有明顯變化，至腦缺血12周其變化與8周比較不明顯。表明慢性腦血缺后pro-BDNF的表達(dá)變化很緩慢。而截短型BDNF蛋白水平在腦血缺后4周即開(kāi)始有明顯下降，8周后下降趨勢(shì)變緩，其變化趨勢(shì)與舒怡等[9]提出的大鼠2VO術(shù)后海馬血流量變化趨勢(shì)相符合。表明海馬區(qū)截短型BDNF的變化易受海馬區(qū)血供的影響。mBDNF在缺血8周后開(kāi)始有明顯變化，缺血12周后其水平明顯低于8周，筆者推測(cè)只有海馬區(qū)血供減少到一定程度后才會(huì)對(duì)mBDNF水平有一定的影響。

此外，本實(shí)驗(yàn)中筆者還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠認(rèn)知功能障礙的變化趨勢(shì)與截短型BDNF變化趨勢(shì)基本一致，模型組大鼠認(rèn)知功能明顯減退也是術(shù)后4周開(kāi)始，推測(cè)大鼠海馬區(qū)截短型BDNF的減少可能與大鼠認(rèn)知功能減退關(guān)系密切。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證明mBDNF可以啟動(dòng)和維持長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，在學(xué)習(xí)和記憶形成中是不可或缺的[15-16]；pro-BDNF誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程抑制形成記憶的消退，兩者共同調(diào)節(jié)大腦現(xiàn)有的記憶[17-18]。但VD大鼠腦缺血8周時(shí)兩者均減少，而VD大鼠認(rèn)知功能的損害并沒(méi)有因此與4周有明顯差異，推測(cè)可能該時(shí)間pro-BDNF和mBDNF的表達(dá)變化對(duì)該時(shí)期VD大鼠海馬神經(jīng)元功能影響不大。VD大鼠腦缺血12周時(shí)，其認(rèn)知功能減退與截短型BDNF變化趨勢(shì)稍有不同，推測(cè)可能pro-BDNF和mBDNF表達(dá)的減少不足以維持該時(shí)期VD大鼠海馬神經(jīng)元的功能活動(dòng)，更加重認(rèn)知功能的減退。

綜上所述，在慢性缺血VD大鼠海馬區(qū)pro-BDNF、mBDNF和截短型BDNF表達(dá)均發(fā)生改變，3者比例的改變可能與VD大鼠認(rèn)知功能減退有關(guān)。在VD大鼠早期，認(rèn)知功能減退可能與截短型BDNF減少關(guān)系密切，而在晚期可能與3者的減少均有關(guān)系。但是在慢性缺血性VD大鼠8周前認(rèn)知功能的減退是否受pro-BDNF和mBDNF變化的影響尚不明確，截短型BDNF的作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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（申海菊 編輯）

Changes of pro-BDNF,mature BDNF and truncated BDNF in hippocampus of vascular dementia rats

Lu Zhang1,Jun-min Li1,Rui Liang2,Bo-ai Zhang1
(1.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou, Henan 450052,China;2.Institute of Clinical Medical Research,Henan University, Zhengzhou,Henan 450052,China)

Objective To investigate the changes of pro-brain-derived neurotrophic factor(pro-BDNF), mature BDNF and truncated BDNF in hippocampus of vascular dementia rats.Methods A total of 120 healthy male Sprague-Dawley rats aged 6 months and weighting 350 g were randomly divided into model group and sham-operation group.The model of chronic cerebral ischemia was established by permanent occlusion of the bilateral common carotid arteries(2VO)in rats,while the sham-operation group accepted the same operation except occlusion of the bilateral common carotid arteries.The rats of both model group and sham-operation group were randomly divided into 2-week,4-week,8-week and 12-week sub-groups,and the behavior of the rats in each group was evaluated by the Morris water maze to select the successful modeling, then the brains were collected for immunohistochemistry and Western blot to detect the changes of pro-BDNF, mature BDNF and truncated BDNF in the hippocampus.Results The escape latency of the rats in the modelgroup was significantly extended compared with the sham-operation group(P＜0.05).Compared with the sham-operation group,the total BDNF of the model group reduced gradually with the prolonged ischemic time,and the truncated BDNF in the model group significantly reduced in 4 weeks,8 weeks and 12 weeks (P＜0.05),and pro-BDNF significantly reduced in 8 weeks and 12 weeks(P＜0.05),and mature BDNF significantly reduced in 12 weeks(P＜0.05).Conclusions Pro-BDNF,mature BDNF and truncated BDNF have changed in the hippocampus of chronic cerebral ischemia rats,and the change in the proportion of three isoforms of BDNF may be associated with cognitive dysfunction.

cerebral ischemia;hippocampus;pro-BDNF;truncated brain-derived neurotrophic factor;mature brain-derived neurotrophic factor

R749.13

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.002

1005-8982（2016）21-0008-05

2016-02-22